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要約

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。

要約

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスは適切な脳機能にとって重要であり、その調節不全は出生後の神経発達障害や精神障害を引き起こす可能性があります。実際、これらの疾患の原因となる多くの遺伝子がこのプロセスに関与していることがわかっているため、これらの突然変異が細胞動態にどのように影響するかを明らかにすることは、これらの疾患の病因を理解するために重要です。このプロトコルは、マウス胚から得られた脳スライス中の移動するニューロンおよびグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング技術を導入します。細胞は、 子宮内 エレクトロポレーションを使用して蛍光タンパク質で標識され、心室ゾーンから移動する個々の細胞を高いS/N比で視覚化します。また、この in vivo 遺伝子導入システムにより、遺伝子の発現やノックダウン/ノックアウトベクターの共エレクトロポレーションにより、遺伝子の機能獲得実験や機能喪失実験を容易に行うことができます。このプロトコルを用いることで、個々の細胞の移動行動や移動速度、つまり固定脳からは決して得られない情報を解析することができます。

概要

大脳皮質の発達中、側脳室の内側を覆う蒼白心室ゾーン(VZ)の(頂端)橈骨グリアは、最初にニューロンを生成し、次にいくつかの重複する期間1を伴ってグリア前駆細胞を生成します。ニューロンは、VZに隣接する脳室内ゾーン(SVZ)の中間前駆細胞または基底橈骨グリアからも生成され、どちらも(頂端)橈骨グリア2,3に由来します。マウスでは、放射状グリア細胞は胚日(E)12-14にニューロンのみを産生し、E15-16ではニューロンとグリア前駆細胞を、E17以降はグリア前駆細胞を産生します4。これらの胚期に生成されたグリア前駆細胞の主要な集団は、優先的にアストロサイトに分化しますが、一部の細胞はオリゴデンドロサイトにも分化します5。これらの段階で生成されたニューロンとアストロサイト前駆細胞は、脳表面に向かって移動し、皮質プレート(将来の皮質灰白質)に入ります。VZから皮質板へのニューロンの移動は、複数の段階で発生します。ニューロンは、最初に多極細胞蓄積ゾーン(MAZ)のすぐ上で多極形態を採用し、SVZまたは中間ゾーンと重なり、そこで複数の薄いプロセスを激しく伸縮させ、ゆっくりと移動します(多極移動)6,7。約24時間後、ニューロンは双極性形態に変化し、脳表面に向かって厚い先行突起を伸ばし、後方に細い後続突起を伸ばし、放射状グリアから小孔表面まで足場として伸びる動径突起を用いて脳表面に向かって直線的に移動する。これをロコモーションモードと呼ぶ2,8.移動モードのニューロンは常に皮質板の最も外側の表面に到達し、その前身である辺縁帯のすぐ下を通過するため、ニューロンは皮質板9,10,11において生年月日に応じた裏返しに整列する。

対照的に、アストロサイト前駆細胞は、頻繁に方向を変えながら、中間ゾーンと皮質プレートに急速に移動します。この移動行動は、ニューロンの移動とは全く異なり、不規則な移動5と呼ばれる。アストロサイト前駆細胞は、血管誘導移動と呼ばれるプロセスで血管に沿って移動します。アストロサイト前駆細胞は、これらの移動モードを切り替えて皮質プレート5,12に到達します。アストロサイトの位置は、その産生年代によって厳密に決定されるわけではないが、早期に生まれたアストロサイトが皮質プレートの表層部に定着する穏やかな傾向が観察されている5。興味深いことに、皮質プレートに定着したアストロサイトは胚期に生成され、最終的には原形質アストロサイトに分化しますが、出生後に生成されたアストロサイトは活発に移動せず、白質に留まり、線維性アストロサイトに分化します5。このアストロサイトサブタイプのステージ依存的な仕様がどのように発生するかは、まだ不明です。

神経細胞の移動に関与する遺伝子の数が増えており、その中には神経発達障害や精神障害に関与する遺伝子も含まれています13,14。したがって、これらの遺伝子の突然変異が移動するニューロンの振る舞いに及ぼす影響を解明することが重要です。前述のように、ニューロンの移動は複数のフェーズで発生します。タイムラプス観察は、主に影響を受けるフェーズ(細胞周期の終了、多極性-双極転移、移動速度など)を直接決定できます。しかし、アストロサイトの仕様、移動、および配置の根底にある分子メカニズムは、ほとんどわかっていません。アストロサイトがシナプス形成15や脳の発達における血液脳関門形成16に重要な役割を果たしていることを考えると、アストロサイトの発達障害は神経発達障害を引き起こす可能性がある。アストロサイト前駆細胞のタイムラプス研究により、これらの分子メカニズムや精神疾患との関係が明らかになるかもしれません。

このプロトコルは、皮質VZ由来細胞のタイムラプス観察の方法を提供します。ニューロンの移動を観察するための同様のビデオプロトコルはすでに公開されています17。ここでは、移動するニューロンとアストロサイト前駆細胞の両方の方法について説明します。これらの細胞を、緑色および赤色の蛍光タンパク質(GFPおよびRFP)などの蛍光タンパク質で標識するために、適切な成分を含むプラスミド混合物を、適切な段階での子宮内エレクトロポレーションにより皮質VZに導入される18,19,20,21。操作した胚を所望の段階で取り出し、脳をスライスしてレーザー走査型顕微鏡によるタイムラプス観察に用います。移動速度、方向、およびその他の行動は、固定された脳サンプルを使用して対処されることは決してありませんが、この方法を使用して調べることができます。子宮内エレクトロポレーション、発現、ノックダウン/ノックアウトベクターは、蛍光タンパク質ベクターと併用して容易に導入できるため、特定の遺伝子の機能獲得および機能喪失の研究を行うことができます。

プロトコル

本研究は、あいち発達研究センター動物利用委員会、愛知県発達障害センター(#2019-013)、慶應義塾大学(A2021-030)の承認とガイドラインに従って実施された。時限妊娠ICR(野生型)マウスを市販で入手した( 「材料の表」参照)。遊走細胞と血管との関係を観察するために、内皮細胞がDsRed22を発現するFlt1-DsRedマウスを用いた。雄のFlt1-DsRedマウスを雌のICRマウスと交配した(両マウスとも生後8-24週齢)。すべての動物は、サンプリングされるまで、特定の病原体フリー(SPF)条件下で飼育および操作されました。この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. 子宮内 エレクトロポレーション

  1. 市販の2x HBSに等量のオートクレーブ水を加えて、HEPES緩衝生理食塩水(HBS)を調製します。
  2. 麻酔薬には2つのオプションがあります。イソフルラン(吸入)およびMMB(注射)。MMBを使用する場合は、以下のようにご用意ください。0.75mLのメデトミジン(1mg / mL)、2mLのミダゾラム(5mg / mL)、および2.5mLのブトルファノール(5mg / mL)を19.75mLのオートクレーブ水に加えます23。
    注:この麻酔液は2か月以内に活性が低下します。遮光材付きで4°Cで保存してください。
  3. アチパメゾール溶液を調製する。0.75 mLのアチパメゾール(5 mg/mL)を24.25 mLのオートクレーブ水で希釈します。
  4. オートクレーブ水に0.2%(w/v)Fast Green溶液を調製します。フィルター(細孔径0.22μm)で滅菌します。
  5. アルカリ溶解およびカラム精製に基づく従来のプラスミド精製キットを使用して、製造元の指示に従ってプラスミドを調製します23 ( 材料の表を参照)。100 mLの細菌培養物から精製したプラスミドを30-50 μLのHBSに溶解して、プラスミドストック(3-5 μg/μL)を調製します(補足ファイル1)。
    1. プラスミドストックをHBSと混合して希釈し、0.2% Fast Greenの1/10容量を加えて注入液を着色します。プラスミドの成分と最終濃度は、その目的に応じて決定されます(表1)。
  6. ピペットプーラーを使用してガラスキャピラリーを引っ張ってマイクロピペットを作成します。
    注:ピペットの先端は、細い鉗子を使用して斜めに切断されます。先端の外径は約70μmです。2 μLの水を吸引して、2 μL間隔でマイクロピペットに印を付けます。
  7. 適切な段階で、妊娠中のマウスに 10 μL/g 体重の用量で MMB 麻酔薬を腹腔内に注射します (施設で承認されたプロトコルに従います)。
    注:操作する胚期は、目的に応じて決定する必要があります。将来のII/III錐体ニューロンの標識には、E14.5が適しています。グリア前駆細胞を標識するには、E15-16でエレクトロポレーションを行う必要があります。あるいは、マウスはイソフルラン(1%〜2%)の吸入によって麻酔することができる。
  8. マウスに深く麻酔をかけた後、38°Cの温かいプレートの上に置きます。
    メモ: マウスがテールをつまむことに反応しないことを確認してください。
  9. 脱毛クリームを使用して手術部位の周囲の毛皮を取り除いた後、ヨウ素ベースのスクラブと70%アルコールの両方で、手術部位を円を描くように数回消毒します。前方の2番目に 後方の乳首のペアのレベルから正中線に沿って2 cmの長さの皮膚切開を行い、続いてアルバ線に沿って腹壁に2cmの正中線切開を行います(図1A)。
    注:腹壁を切開する過程で、内臓を切らないように細い鉗子で少し持ち上げます。
  10. 滅菌プラスチックシートを皮膚に置き、その上に滅菌ティッシュペーパーを置きます(図1A)。中央に穴を開けて手術部位を露出させます。
    注:乳首の位置を参照して切開を配置するには広い視野が必要なため、滅菌プラスチックシートと滅菌ティッシュペーパーは切開後に配置されます。
  11. 滅菌PBSで紙を濡らし、切開部から子宮角を注意深く観察し、プラスチックシートと紙の穴から子宮角を引き出します。
  12. 吸引チューブアセンブリに取り付けられたマイクロピペットを使用して、呼気圧により、プラスミド混合物1 μLを子宮壁を介して左右の側心室に注入します(図1A)。
    注:あるいは、プラスミドはマイクロインジェクターを使用して注入することもできます。
  13. ピンセット型電極で胚の頭部をつまみ、エレクトロポレーター(E14-16は35V、E17は50V、450ms間隔で50msの方形パルスを5回)を用いて電子パルスを印加します(図1A)。
    注:胚の頭を強くつまむと、胚が損傷します。実際の電流は40〜70mAである必要があります。
  14. 子宮角を腹腔に戻します。
  15. 5-0の絹糸を使用して腹壁を縫合します。
  16. アチパメゾール溶液を10μL / g体重の用量で腹腔内に適用します。.
  17. 5-0の絹糸を使用して皮膚を縫合します。
    注:スキンはオートクリップを使用して閉じることができます。
  18. 操作したマウスを温かいプレートに少なくとも30分間置いてください。マウスはケージ内で動き始めます。
    注: 子宮内 エレクトロポレーションの手順(ステップ1.7から1.16まで)は30分以内に行う必要があります。一般的な操作時間は20分です。

2.スライスの準備

注:スライスの鮮度は、この実験の成功の鍵です。スライスは、2時間以内(ステップ2.5〜2.12)で準備する必要があります。

  1. ハンクスの平衡塩溶液をCa2+およびMg2+で調製します。HBSS(+)です。5 mLのCaCl2(14 g/L、オートクレーブ)と5 mLのMgSO 4.7H2O(20 g/L、オートクレーブ)を5 mLのHBSS(-)に加えます。4°Cで保存してください。 使用前に、溶液を95%O2 + 5%CO2ガスで氷上で5分間泡立てます。
  2. 培地を準備します。少なくとも2.5 mL /皿が必要です。2 mLのウシ胎児血清、25 μLのL-グルタミン(200 mM)、200 μL B27(50x)、50 μLのペニシリン+ストレプトマイシン(10 K単位/ mLおよび10 mg / mL)を8 mLの神経基礎培地に加えます。
  3. 3%低融点アガロースゲルを調製します。HBSS(+)を50mL細孔し、低融点アガロース1.5mgを加えてオートクレーブします。アガロースを電子レンジで溶かし、ウォーターバスインキュベーターで50°Cに保ってから使用してください。
  4. ガラスベースの皿に1.9mLの培地を加えます。フィルターの下にエアバルブが引っかからないように細胞培養インサートを慎重に置き、500 μLの培地をフィルターに加えます(図1B)。氷の上に置きます。
  5. 5% イソフルランを吸入して操作したマウスに麻酔をかけた後、観察する適切な段階で子宮頸部脱臼 (施設で承認されたプロトコルに従う) によってマウスを犠牲にします。
    注:E14.5でのエレクトロポレーションの2日後(48時間)と3日後は、それぞれ多極-双極転移と移動モードを観察するのに適しています。
  6. 胚を取り出し、冷たいPBSを入れたペトリ皿に入れます。
  7. 顕微鏡下でGFPまたは他の蛍光タンパク質の発現によって胚を選択します。
  8. 胚の斬首後、解剖顕微鏡で脳6 を解剖し、冷房HBSS(+)に保管する。
  9. 溶かした3%低融点アガロースゲルをクライオモールド( 材料表参照)に流し込み、脳みそを入れて数回転がします。アガロースが完全に固まるまで室温で置き、氷の上に置きます。
  10. 振動するミクロトームを使用して、脳を350μmの厚さで冠状にスライスします( 材料の表を参照)。
  11. フィルターにスライスを配置します(フィルターごとに最大6スライス)。
  12. フィルターカップの内側と外側から培地を取り出します(合計600μL)。このステップでは、スライスをフィルターに押し付けて固定します。5分後、細胞培養インサートの内側に100μLの培地を加えます。

3.タイムラプスイメージング

  1. Zドリフトを防ぐために、イメージングの少なくとも30分前に、チャンバーのヒーターまたは顕微鏡を囲むフードを使用して、培養チャンバーを倒立レーザースキャン顕微鏡のステージに取り付けたままにしてください。加湿した5%CO2 + 40%O2 ガスを培養チャンバーに供給します。
  2. 上に準備したスライスで培養皿を培養室にセットします。
  3. 長作動距離の20倍レンズ(NA = 0.45)を使用して、15〜30分ごとに5μmステップで約10枚のZスタック画像を24時間取得します。
    注:電動XYステージの使用を強くお勧めします。これにより、複数の目的フィールドから画像を取得することができます。通常、1回のタイムラプス実験でさまざまな目的フィールドから10〜20枚の画像を取得します。

4. 画像解析

  1. ImageJなどのソフトウェアを使用して、Z軸の最大投影によってXYZT画像をXYTに変換します。
    注:観察中にスライスがスライドした場合は、ImageJプラグインであるStackRedとリジッドボディ変換の機能を使用して、画像内のセルの位置を調整します( マテリアルの表を参照)。
  2. GFPまたは他の蛍光タンパク質陽性細胞の軌跡を手動または自動で追跡します。手動トレースと自動トレースは、それぞれMTrackJ24とTrackMate 25,26(ImageJプラグイン)を使用して実行できます。TrackMateを使用した自動トレースは、多くの細胞を偏りなく分析するのに効率的です。ただし、MTrackJを使用した手動トレースは、個々のセルを正確に追跡するために引き続き有用です。

結果

パリアルVZの放射状グリア細胞は、E14まではニューロンのみを産生し、E15とE16ではニューロンとグリア細胞の両方を産生します。ニューロンとグリア細胞の遊走挙動を同時に観察するために、ニューロン特異的プロモーターであるTα1プロモーター27と、アストロサイトで優先的に活性化されるヒトグリア線維性酸性タンパク質(hGFAP)プロモーター28を?...

ディスカッション

このプロトコルは、蒼白(皮質)VZに由来する細胞のタイムラプス観察の方法を導入しました。VZから移動する細胞を標識するために、子宮内エレクトロポレーションを使用し、個々の細胞をウイルスベクター媒介標識よりも高いS/N比で明確に標識しました。子宮内エレクトロポレーションを使用すると、任意の組み合わせの任意のタイプのベクターを、生きた胚の放射状グリア細?...

開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

Tα1プロモーターは、P.バーカーとFDミラーからの贈り物です。Dcxのプロモーターは、Q.ルーからの贈り物です。hGFAP-Cre は Albee Messing 氏からの贈り物でした。PiggyBacトランスポゾンベクターシステムは、Sanger Instituteから提供されました。Flt1-DsRedマウスは、滋賀大学(M. Ema)から提供されました。本研究は、日本学術振興会科学研究費助成(課題番号JP21K07309:田畑秀樹、JP20H05688・JP22K19365:中島和彦)、武田科学振興財団、慶應義塾教育研究振興基金、慶應義塾学術振興基金(中島和彦)の支援を受けて行われました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Aspirator tube assemblyDrummond2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)MeijiMepatia
AutoclipBecton Dickinson4276309 mm
B27 supplementGibco17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)MeijiVetorphale
Cell culture insertMilliporePICM ORG 50
Confocal microscopeNikonA1RHD25Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
CryomoldTissue-Tek4566
Culture chamberTokkenTK-NBCMPCustom-made
ElectroporatorNEPA GeneNEPA21
Fast GreenSigma-AldrichF7258
Gas mixerTokkenTK-MIGM01-02
Glass base dishIwaki3910-035Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillariesNarishigeGD-1
HBS (2x)Sigma-Aldrich51558
HBSS(-)Wako084-08345
Heater UnitTokkenTK-0003HU20Custom-made, including hood and heater
hGFAP-CreAddgene#40591A gift from Albee Messing
ImageJhttps://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)Gibco25030
Low melting temperature agaroseLonza50100
Medetomidine (1 mg/mL)MeijiMedetomin
MicroinjectorNarishigeIM-300
Midazolam (5 mg/mL)SandozMidazolam
MTrackJhttps://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal mediumGibco21103-049
pCAG-hyPBaseThe hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-DreThe Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + StreptomycinGibco15140122
Plasmid purification kitInvitrogenPureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFPCAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFPThe sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
PullerNarishigePN-31
StackReda plugin for ImageJhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needleNazmeC-24-521-R No.11/2 circle, length 14 mm
Suture threadNazmeC-23-B2Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) miceJapan SLCICR mouse
TrackMatehttps://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrodeBEX or NEPA GeneCUY650P5 
Tα1-EGFPEGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtomeLeica or ZeissVibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.

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