배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

요약

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

초록

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정은 적절한 뇌 기능에 매우 중요하며, 조절 장애는 출생 후 신경 발달 및 정신 장애를 초래할 수 있습니다. 실제로 이러한 질병의 원인이 되는 많은 유전자가 이 과정에 관여하는 것으로 밝혀졌으므로 이러한 돌연변이가 세포 역학에 어떻게 영향을 미치는지 밝히는 것은 이러한 질병의 발병 기전을 이해하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 마우스 배아에서 얻은 뇌 절편에서 이동하는 뉴런과 신경교 전구 세포의 타임 랩스 이미징 기술을 소개합니다. 세포는 자궁 전기천공법 (in utero electroporation)을 사용하여 형광 단백질로 표지되며, 이는 높은 신호 대 잡음비로 심실 영역에서 이동하는 개별 세포를 시각화합니다. 또한, 이 in vivo 유전자 전달 시스템을 사용하면 발현 또는 knockdown/knockout 벡터의 동시 전기천공을 통해 주어진 유전자에 대한 Gain-of-Function 또는 Loss-of-function 실험을 쉽게 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 고정된 뇌에서는 절대 얻을 수 없는 정보인 개별 세포의 이동 행동과 이동 속도를 분석할 수 있습니다.

서문

대뇌피질(cerebral cortex)이 발달하는 동안, 외측심실(lateral ventricle)을 둘러싸고 있는 팔심실영역(pallial ventricular zone, VZ)에 있는 (정점) 요사상교세포(radial glia)는 먼저 뉴런을 생성하고, 그 다음에는 일부 주기가 겹치는 신경교세포(glial progenitor)를 생성한다¹. 뉴런은 또한 VZ에 인접한 뇌실하 영역(SVZ)의 중간 전구 세포 또는 기저 요골 아교세포에서 생성되며, 둘 다 (정점) 요골 아교세포 ^2,3에서 유래합니다. 마우스에서 요골 신경교세포는 배아 일(E) 12-14일에만 뉴런을 생성하고, E15-16에는 뉴런과 신경교 전구세포를, E17 이후에는⁴.의 신경교세포를 생성합니다. 이러한 배아 단계에서 생성된 신경교세포(glial progenitor)의 주요 집단은 우선적으로 성상교세포(astrocyte)로 분화하지만, 일부 세포는 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 분화하기도 한다⁵. 이 단계에서 생성된 뉴런과 성상세포(astrocyte) 전구세포는 뇌 표면으로 이....

프로토콜

본 연구는 발달 연구소, 아이치 발달 장애 센터(#2019-013) 및 게이오 대학(A2021-030)의 동물 보호 및 사용 위원회의 승인과 지침에 따라 수행되었습니다. 시간 제한 임신 ICR(야생형) 마우스를 상업적으로 수득하였다( 재료 표 참조). 이동하는 세포와 혈관 사이의 관계를 관찰하기 위해 내피 세포가 DsRed²²를 발현하는 Flt1-DsRed 마우스를 사용했습니다. 수컷 Flt1-DsRed 마우스를 암컷 ICR 마우스와 교배시켰다(두 마우스 모두 8-24주의 연령이었다). 모든 동물은 샘플링 할 때까지 특정 병원체가 없는(SPF) 조건에서 수용되고 조작되었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 자궁 electroporation에서

1. 시판되는 2x HBS에 동일한 양의 오토클레이브수를 첨가하여 HEPES 완충 식염수(HBS) 용액을 준비합니다.
2. 마취제에는 두 가지 옵션이 있습니다. 이소플루란(흡입) 및 MMB(주사). MMB를 사용하는 경우 다음과 같이 준비합니다. 0.75mL의 오토클레이브수에 0.75mL의 ....

토론

이 프로토콜은 pallial(cortical) VZ에서 유래한 세포의 타임 랩스 관찰 방법을 도입했습니다. VZ에서 이동하는 세포를 라벨링하기 위해 우리는 자궁 전기천공법(utero electroporation)을 사용했는데, 이 경우 바이러스 벡터 매개 라벨링보다 더 높은 신호 대 잡음비로 개별 세포를 명확하게 라벨링했습니다. 자궁 전기천공법(utero electroporation)에 사용하여, 어떤 조합으로든 모든 유형의 벡터를 살?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.