배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

요약

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

초록

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정은 적절한 뇌 기능에 매우 중요하며, 조절 장애는 출생 후 신경 발달 및 정신 장애를 초래할 수 있습니다. 실제로 이러한 질병의 원인이 되는 많은 유전자가 이 과정에 관여하는 것으로 밝혀졌으므로 이러한 돌연변이가 세포 역학에 어떻게 영향을 미치는지 밝히는 것은 이러한 질병의 발병 기전을 이해하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 마우스 배아에서 얻은 뇌 절편에서 이동하는 뉴런과 신경교 전구 세포의 타임 랩스 이미징 기술을 소개합니다. 세포는 자궁 전기천공법 (in utero electroporation)을 사용하여 형광 단백질로 표지되며, 이는 높은 신호 대 잡음비로 심실 영역에서 이동하는 개별 세포를 시각화합니다. 또한, 이 in vivo 유전자 전달 시스템을 사용하면 발현 또는 knockdown/knockout 벡터의 동시 전기천공을 통해 주어진 유전자에 대한 Gain-of-Function 또는 Loss-of-function 실험을 쉽게 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 고정된 뇌에서는 절대 얻을 수 없는 정보인 개별 세포의 이동 행동과 이동 속도를 분석할 수 있습니다.

서문

대뇌피질(cerebral cortex)이 발달하는 동안, 외측심실(lateral ventricle)을 둘러싸고 있는 팔심실영역(pallial ventricular zone, VZ)에 있는 (정점) 요사상교세포(radial glia)는 먼저 뉴런을 생성하고, 그 다음에는 일부 주기가 겹치는 신경교세포(glial progenitor)를 생성한다¹. 뉴런은 또한 VZ에 인접한 뇌실하 영역(SVZ)의 중간 전구 세포 또는 기저 요골 아교세포에서 생성되며, 둘 다 (정점) 요골 아교세포 ^2,3에서 유래합니다. 마우스에서 요골 신경교세포는 배아 일(E) 12-14일에만 뉴런을 생성하고, E15-16에는 뉴런과 신경교 전구세포를, E17 이후에는⁴.의 신경교세포를 생성합니다. 이러한 배아 단계에서 생성된 신경교세포(glial progenitor)의 주요 집단은 우선적으로 성상교세포(astrocyte)로 분화하지만, 일부 세포는 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 분화하기도 한다⁵. 이 단계에서 생성된 뉴런과 성상세포(astrocyte) 전구세포는 뇌 표면으로 이동하여 피질판(cortical plate, 미래의 대뇌피질 회백질)으로 들어갑니다. VZ에서 피질판으로의 신경 세포 이동은 여러 단계에서 발생합니다. 뉴런은 먼저 SVZ 또는 중간 영역과 겹치는 다극 세포 축적 영역(MAZ) 바로 위의 다극 형태를 채택하여 여러 얇은 돌기를 격렬하게 확장 및 수축하고 천천히 이동(다극 이동)합니다(다극 이동)^6,7. 약 24시간 후, 뉴런은 양극성 형태로 변형되어 두꺼운 선행 돌기를 뇌 표면 쪽으로 확장하고 얇은 후행 돌기를 뒤로 확장하고, 요골 아교세포에서 pial 표면까지 확장되는 방사형 돌기를 골격으로 사용하여 뇌 표면을 향해 선형으로 이동하는데, 이를 운동 모드 ^2,8이라고 합니다. 운동 모드의 뉴런은 항상 피질판의 가장 바깥쪽 표면에 도달하기 때문에 가장자리 영역 바로 아래의 선행 뉴런을 통과하기 때문에 뉴런은 피질판 ^9,10,11에서 생년월일에 의존하는 안팎으로 정렬됩니다.

대조적으로, 성상교세포(astrocyte) 전구세포는 중간 영역(intermediate zone)과 피질판(cortical plate)으로 빠르게 이동하며 빈번한 방향 변화를 겪습니다. 이러한 이동 행동은 신경 세포의 이동과는 완전히 다르며, 불규칙한 이동(erratic migration)이라고 불린다⁵. 성상세포(astrocyte) 전구세포는 또한 혈관 유도 이동(bloodvessel-guided migration)이라고 불리는 과정에서 혈관을 따라 이동합니다. 성상세포(astrocyte) 전구세포는 이러한 이동 모드 사이를 전환하여 피질판(cortical plate) ^5,12에 도달합니다. 성상세포(astrocyte)의 위치가 생산 날짜에 의해 엄격하게 결정되는 것은 아니지만, 일찍 태어난 성상교세포(astrocyte)가 피질판의 표피부에 정착하는 경미한 경향이 관찰되었다⁵. 흥미롭게도, 대뇌피질판에 정착한 성상세포는 배아 단계에서 생성되어 결국 원형질 성상세포로 분화하는 반면, 출생 후에 생성된 성상세포는 활발하게 이동하지 않고 백질에 남아 섬유성 성상세포로 분화한다⁵. 성상세포(astrocytic) 아형의 이러한 병기 의존적 사양이 어떻게 발생하는지는 불분명하다.

신경 발달 및 정신 장애에 관여하는 유전자를 포함하여 신경 세포 이동에 관여하는 유전자의 수가 점점 더 많이 확인되고 있습니다^13,14. 따라서 이러한 유전자의 돌연변이가 이동하는 뉴런의 행동에 미치는 영향을 밝히는 것이 중요합니다. 앞서 언급했듯이 뉴런 이동은 여러 단계에서 발생합니다. 타임랩스 관찰은 주로 영향을 받는 단계(세포 주기 종료, 다극-양극 전이, 이동 속도 등)를 직접 결정할 수 있습니다. 그러나 성상세포의 사양, 이동 및 위치의 기저에 있는 분자 메커니즘은 대부분 알려져 있지 않습니다. 성상교세포(astrocyte)가 뇌 발달 중 시냅토형성(synaptogenesis⁾¹⁵과 혈액뇌장벽(blood-brain barrier) 형성에 중요한 역할을 한다는 점을 감안할 때¹⁶, 성상세포의 발달 결함은 신경발달 장애를 초래할 수 있다. 성상교세포 전구세포에 대한 타임랩스 연구는 이러한 분자 메커니즘과 정신 질환과의 관계를 명확히 할 수 있습니다.

이 프로토콜은 대뇌 피질 VZ 유래 세포의 타임 랩스 관찰 방법을 제공합니다. 신경 세포 이동을 관찰하기 위한 유사한 비디오 프로토콜이 이미 발표되었다¹⁷. 여기에서는 뉴런과 성상교세포 전구세포를 모두 이동하는 방법을 설명합니다. 이들 세포를 녹색 및 적색 형광 단백질(GFP 및 RFP)과 같은 형광 단백질로 라벨링하기 위해, 적절한 성분을 함유하는 플라스미드 혼합물 을 적절한 단계 18,19,20,21에서 자궁 내 전기천공법에 의해 대뇌 피질 VZ로 도입한다. 조작된 배아는 원하는 단계에서 제거되고, 뇌는 잘게 쪼개져 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 타임랩스 관찰에 사용됩니다. 이동 속도, 방향 및 기타 행동은 고정된 뇌 샘플로는 다루지 않지만 이 방법을 사용하여 검사할 수 있습니다. in utero electroporation을 사용하면 expression 및 knockdown/knockout 벡터를 형광 단백질 벡터와 동시에 쉽게 전달할 수 있으므로 특정 유전자에 대한 Gain-of-Function 및 Loss-of-Function 연구를 수행할 수 있습니다.

프로토콜

본 연구는 발달 연구소, 아이치 발달 장애 센터(#2019-013) 및 게이오 대학(A2021-030)의 동물 보호 및 사용 위원회의 승인과 지침에 따라 수행되었습니다. 시간 제한 임신 ICR(야생형) 마우스를 상업적으로 수득하였다( 재료 표 참조). 이동하는 세포와 혈관 사이의 관계를 관찰하기 위해 내피 세포가 DsRed²²를 발현하는 Flt1-DsRed 마우스를 사용했습니다. 수컷 Flt1-DsRed 마우스를 암컷 ICR 마우스와 교배시켰다(두 마우스 모두 8-24주의 연령이었다). 모든 동물은 샘플링 할 때까지 특정 병원체가 없는(SPF) 조건에서 수용되고 조작되었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 자궁 electroporation에서

1. 시판되는 2x HBS에 동일한 양의 오토클레이브수를 첨가하여 HEPES 완충 식염수(HBS) 용액을 준비합니다.
2. 마취제에는 두 가지 옵션이 있습니다. 이소플루란(흡입) 및 MMB(주사). MMB를 사용하는 경우 다음과 같이 준비합니다. 0.75mL의 오토클레이브수에 0.75mL의 메데토미딘(1mg/mL), 2mL의 미다졸람(5mg/mL), 2.5mL의 부토르판올(19.75mg/mL)을 추가합니다.²³.
   참고: 이 마취액은 2개월 이내에 활성이 감소합니다. 라이트 쉴드와 함께 4 °C에서 보관하십시오.
3. 아티파메졸 용액을 준비합니다. 0.75mL의 아티파메졸(5mg/mL)을 24.25mL의 오토클레이브수에 희석합니다.
4. 오토클레이브된 물에 0.2%(w/v) Fast Green 용액을 준비합니다. 필터(기공 크기 0.22μm)로 살균합니다.
5. 제조업체의 지침에 따라 알칼리 용해 및 컬럼 정제²³ 을 기반으로 하는 기존 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 준비합니다( 재료 표 참조). 100mL 박테리아 배양에서 정제된 플라스미드를 30-50 μL의 HBS에 용해시켜 플라스미드 스톡(3-5 μg/μL)을 준비합니다(보충 파일 1).
   1. 플라스미드 스톡을 HBS와 혼합 및 희석하고 0.2% Fast Green의 1/10 부피를 추가하여 주입제를 착색합니다. plasmids의 성분 및 최종 농도는 그 목적에 따라 결정됩니다(표 1).
6. 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 당겨 마이크로피펫을 만듭니다.
   알림: 피펫의 끝은 미세한 집게를 사용하여 비스듬히 절단됩니다. 팁의 외경은 약 70μm입니다. 2μL의 물을 빨아들여 2μL 간격으로 마이크로피펫을 표시합니다.
7. 적절한 단계에서 임신한 쥐에게 체중 10μL/g의 MMB 마취제를 복강내로 주입합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름).
   참고: 조작할 배아 단계는 목적에 따라 결정되어야 합니다. 미래의 II/III 피라미드 뉴런을 표지하려면 E14.5가 적합합니다. 신경교 전구세포를 라벨링하려면 E15-16에서 전기천공법을 수행해야 합니다. 대안적으로, 마우스는 이소플루란(1%-2%)의 흡입에 의해 마취될 수 있다.
8. 마우스를 완전히 마취한 후 38°C의 따뜻한 접시에 놓습니다.
   알림: 마우스가 꼬리를 잡는 데 반응하지 않는지 확인하십시오.
9. 제모 크림을 사용하여 수술 부위 주변의 털을 제거한 후 요오드 성분의 스크럽과 70% 알코올로 수술 부위를 원을 그리며 여러 번 소독합니다. 전^{방으로 가장 뒤쪽} 에 있는 2번째 유두 수준에서 정중선을 따라 2cm 길이의 피부를 절개한 다음 linea alba를 따라 복벽에 2cm 정중선을 절개합니다(그림 1A).
   참고: 복벽을 절개하는 과정에서 내부 장기가 절단되지 않도록 미세한 집게로 살짝 들어 올립니다.
10. 멸균 플라스틱 시트를 피부에 놓고 그 위에 멸균 티슈 페이퍼 조각을 놓습니다(그림 1A). 중앙에 구멍을 뚫어 수술 부위를 노출시킵니다.
    NOTE: 멸균 플라스틱 시트와 멸균 티슈 페이퍼는 유두의 위치를 기준으로 절개 부위를 배치하기 위해 넓은 시야가 필요하기 때문에 절개 후 배치합니다.
11. 멸균 PBS로 종이를 적시고 절개 부위에서 자궁 뿔을 주의 깊게 관찰하고 플라스틱 시트와 종이의 구멍을 통해 자궁 뿔을 빼냅니다.
12. 흡인기 튜브 어셈블리에 부착된 마이크로피펫을 사용하여 호기 압력에 의해 자궁벽을 통해 플라스미드 혼합물 1μL를 왼쪽 또는 오른쪽 외측 심실에 주입합니다(그림 1A).
    NOTE: 또는 microinjector를 사용하여 plasmid를 주입할 수 있습니다.
13. 핀셋형 전극으로 배아의 머리를 끼우고 전기포레이터(E14-16의 경우 35V, E17의 경우 50V, 450ms 간격의 50ms 구각 펄스, 5회)를 사용하여 전자 펄스를 적용합니다(그림 1A).
    알림: 배아가 손상될 수 있으므로 배아의 머리를 강하게 꼬집지 마십시오. 실제 전류는 40-70mA여야 합니다.
14. 자궁 뿔을 복강에 다시 넣습니다.
15. 5-0 명주실을 사용하여 복벽을 봉합합니다.
16. 체중 10μL/g의 용량으로 아티파메졸 용액을 복강내로 적용합니다.
17. 5-0 명주실을 사용하여 피부를 봉합합니다.
    참고: 스킨은 자동 클립을 사용하여 닫을 수 있습니다.
18. 조작된 쥐를 따뜻한 접시에 최소 30분 동안 두십시오. 쥐는 우리 안에서 움직이기 시작할 것입니다.
    참고: 자궁 내 전기천공법 절차(1.7단계에서 1.16단계까지)는 30분 이내에 수행해야 합니다. 일반적인 작동 시간은 20분입니다.

2. 슬라이스 준비

참고: 슬라이스의 신선도는 이 실험 성공의 열쇠입니다. 슬라이스는 2.5시간 이내에 준비해야 합니다(2.5-2.12단계에서).

1. Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +}로 Hanks의 균형 잡힌 소금 용액을 준비합니다. HBSS(+)입니다. 500mL의 HBSS(-)에 CaCl₂ 5mL(14g/L, 고압멸균)와 5mL의 MgSO_{4.7H 2}O(20g/L, 고압멸균)를 추가합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 95%_O2 + 5% CO₂ 가스로 용액을 얼음에 5분 동안 거품을 냅니다.
2. 배양 배지를 준비합니다. 접시당 최소 2.5mL가 필요합니다. 소 태아 혈청 2mL, L-글루타민 25μL(200mM), B27 200μL(50x), 페니실린 50μL + 스트렙토마이신(10K 단위/mL 및 10mg/mL)을 신경기저 배지 8mL에 추가합니다.
3. 3% 낮은 용융 온도의 아가로스 겔을 준비합니다. 50mL의 HBSS(+)를 기공한 다음 1.5mg의 낮은 용융 온도 아가로스를 첨가하고 고압멸균합니다. 아가로스를 전자레인지에 녹이고 사용하기 전에 수조 인큐베이터에서 50°C로 보관합니다.
4. 1.9mL의 배양 배지를 유리 베이스 접시에 추가합니다. 필터 아래에 공기 전구가 갇히지 않도록 세포 배양 삽입물을 조심스럽게 삽입한 다음 500μL의 배양 배지를 필터에 추가합니다(그림 1B). 얼음 위에 놓습니다.
5. 5% 이소플루란을 흡입하여 조작된 마우스를 마취한 후, 관찰할 적절한 단계에서 자궁경부 탈구(제도적으로 승인된 프로토콜에 따름)로 희생시킵니다.
   참고: E14.5에서 전기천공법 후 2일(48시간) 및 3일은 각각 다극-양극 전이 및 이동 모드를 관찰하는 데 적합합니다.
6. 배아를 꺼내 차가운 PBS가 있는 페트리 접시에 넣습니다.
7. 현미경으로 GFP 또는 다른 형광 단백질의 발현으로 배아를 선택합니다.
8. 배아의 참수 후 해부^{현미경으로 뇌} 6를 절개하고 차가운 HBSS(+)에 보관한다.
9. 녹은 3% 낮은 용융 온도의 아가로스 겔을 냉동 몰드에 붓고( 재료 표 참조) 뇌를 넣고 여러 번 굴립니다. 아가로스가 완전히 굳을 때까지 실온에 두었다가 얼음 위에 놓는다.
10. 진동 마이크로톰을 사용하여 350μm 두께로 뇌를 관상으로 절단합니다( 재료 표 참조).
11. 필터에 슬라이스를 정렬합니다(필터당 최대 6개 슬라이스).
12. 필터 컵의 내부와 외부에서 배양 배지를 빼냅니다(총 600μL). 이 단계에서는 슬라이스를 눌러 필터에 고정합니다. 5분 후 세포 배양 삽입물 내부에 100μL의 배양 배지를 추가합니다.

3. 타임랩스 이미징

1. 배양 챔버를 스테이지에 장착한 상태로 유지tag전자 챔버의 히터 또는 현미경을 둘러싸고 있는 후드를 사용하여 챔버의 히터를 사용하여 Z 드리프트를 방지하기 최소 30분 전에 현미경을 둘러싸고 있습니다. 배양실에 가습된 5%_CO2 + 40%_O2 가스를 공급합니다.
2. 배양실에서 위에 준비한 조각으로 배양 접시를 설정합니다.
3. 긴 작동 거리의 20x 렌즈(NA = 0.45)를 사용하여 24시간 동안 15-30분마다 5μm 단위로 약 10개의 Z 스택 이미지를 획득합니다.
   알림: 전동식 XY s의 사용을 적극 권장합니다.tage. 이를 통해 여러 대물렌즈 필드에서 이미지를 얻을 수 있습니다. 일반적으로 하나의 타임랩스 실험에서 서로 다른 객관식 필드에서 10-20개의 이미지를 얻습니다.

4. 이미징 분석

1. ImageJ 또는 기타 소프트웨어를 사용하여 Z축의 최대 투영으로 XYZT 이미지를 XYT로 변환합니다.
   참고: 관찰 중에 슬라이스가 미끄러지면 강체 변환 기능이 있는 ImageJ 플러그인인 StackRed를 사용하여 이미지 내 셀의 위치를 조정하십시오( 재료 표 참조).
2. GFP 또는 기타 형광 단백질 양성 세포의 궤적을 수동 또는 자동으로 추적합니다. 수동 및 자동 추적은 각각 MTrackJ²⁴ 및 TrackMate ^25,26(ImageJ 플러그인)을 사용하여 수행할 수 있습니다. TrackMate를 사용한 자동 추적은 편향되지 않은 방식으로 많은 세포를 분석하는 데 효율적입니다. 그러나 MTrackJ를 사용한 수동 추적은 개별 세포의 정확한 추적에 여전히 유용합니다.

결과

pallial VZ의 방사형 신경교세포는 E14까지는 뉴런만 생성하고, E15 및 E16에서는 뉴런과 신경교세포를 모두 생산합니다. 뉴런과 신경교세포의 이동 거동을 동시에 관찰하기 위해 뉴런 특이적 프로모터인 Tα1 promoter²⁷과 성상교세포에서 우선적으로 활성화되는 human glial fibrillary acidic protein(hGFAP) 프로모터²⁸을 사용하여 각각 EGFP(enhanced GFP) 및 RFP로 라벨링했습니?...

토론

이 프로토콜은 pallial(cortical) VZ에서 유래한 세포의 타임 랩스 관찰 방법을 도입했습니다. VZ에서 이동하는 세포를 라벨링하기 위해 우리는 자궁 전기천공법(utero electroporation)을 사용했는데, 이 경우 바이러스 벡터 매개 라벨링보다 더 높은 신호 대 잡음비로 개별 세포를 명확하게 라벨링했습니다. 자궁 전기천공법(utero electroporation)에 사용하여, 어떤 조합으로든 모든 유형의 벡터를 살?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.