Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Özet

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Özet

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreç, uygun beyin fonksiyonu için çok önemlidir ve düzensizliği doğumdan sonra nörogelişimsel ve psikiyatrik bozukluklara neden olabilir. Aslında, bu hastalıklardan sorumlu birçok genin bu süreçte yer aldığı bulunmuştur ve bu nedenle, bu mutasyonların hücresel dinamikleri nasıl etkilediğini ortaya koymak, bu hastalıkların patogenezini anlamak için önemlidir. Bu protokol, fare embriyolarından elde edilen beyin dilimlerinde göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntülenmesi için bir teknik sunar. Hücreler, ventriküler bölgeden yüksek bir sinyal-gürültü oranıyla göç eden tek tek hücreleri görselleştiren utero elektroporasyon kullanılarak floresan proteinlerle etiketlenir. Ayrıca, bu in vivo gen transfer sistemi, ekspresyonlarının veya knockdown/knockout vektörlerinin birlikte elektroporasyonu yoluyla verilen genler üzerinde fonksiyon kazancı veya fonksiyon kaybı deneylerini kolayca gerçekleştirmemizi sağlar. Bu protokol kullanılarak, tek tek hücrelerin göç davranışı ve göç hızı, sabit beyinlerden asla elde edilemeyen bilgiler analiz edilebilir.

Giriş

Serebral korteksin gelişimi sırasında, lateral ventrikülü kaplayan pallial ventriküler bölgedeki (VZ) (apikal) radyal glia, önce nöronları ve daha sonra bazı örtüşen periyotlarla^glial progenitörleri üretir 1. Nöronlar ayrıca, her ikisi de (apikal) radyal glia ^2,3'ten kaynaklanan, VZ'ye bitişik subventriküler bölgedeki (SVZ) ara progenitörlerden veya bazal radyal gliadan üretilir. Farelerde, radyal glial hücreler embriyonik gün (E) 12-14'te sadece nöronlar, E15-16'da hem nöronlar hem de glial progenitörler ve E17'den itibaren glial progenitörler^{üretir 4}. Bu embriy....

Protokol

Bu çalışma, Gelişimsel Araştırmalar Enstitüsü, Aichi Gelişimsel Engellilik Merkezi (#2019-013) ve Keio Üniversitesi (A2021-030) Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onayı ve yönergeleri izlenerek gerçekleştirilmiştir. Zamanlanmış gebe ICR (vahşi tip) fareler ticari olarak elde edildi (bkz. Malzeme Tablosu). Göç eden hücreler ve kan damarları arasındaki ilişkiyi gözlemlemek için, endotel hücrelerinin DsRed^22'yi eksprese ettiği Flt1-DsRed fareleri kullanıldı. Erkek Flt1-DsRed fareleri dişi ICR fareleri ile çaprazlandı (her iki fare de 8-24 haftalıktı). Tüm hayvanlar, numune alınana kadar belirli patojen içermeyen (SPF) koşulla....

Tartışmalar

Bu protokol, pallial (kortikal) VZ'den türetilen hücrelerin hızlandırılmış gözlemi için bir yöntem tanıttı. VZ'den göç eden hücreleri etiketlemek için, tek tek hücrelerin viral vektör aracılı etiketlemeden daha yüksek bir sinyal-gürültü oranıyla açıkça etiketlendiği utero elektroporasyonda kullandık. Utero elektroporasyon kullanılarak, herhangi bir kombinasyondaki herhangi bir vektör türü, canlı embriyolardaki radyal glial hücrelere (nöral kök hücreler) kolayca sok.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.