Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف تطبيق حامل أكسجين قائم على الهيموجلوبين البشري المبلمر (PolyhHb) باعتباره معطلا والبروتوكول الذي يمكن من خلاله اختبار محلول التروية هذا في نموذج نضح الرئة خارج الجسم الحي للفئران.

Abstract

يعوق زرع الرئة عدم وجود متبرعين مناسبين. في السابق ، تم تجاهل المانحين الذين كان يعتقد أنهم هامشيون أو غير كافيين. ومع ذلك ، فإن التكنولوجيا الجديدة والمثيرة ، مثل التروية الرئوية خارج الجسم الحي (EVLP) ، تقدم لمقدمي خدمات زراعة الرئة تقييما موسعا للطعم الخيفي للمتبرعين الهامشيين. أدت منصة التقييم الديناميكية هذه إلى زيادة في زراعة الرئة وسمحت لمقدمي الخدمات باستخدام المتبرعين الذين تم تجاهلهم سابقا ، وبالتالي توسيع مجموعة المتبرعين. تستخدم تقنيات التروية الحالية المعطرات الخلوية أو اللاخلوية ، وكلاهما له مزايا وعيوب مميزة. تكوين التروية أمر بالغ الأهمية للحفاظ على بيئة الاستتباب ، وتوفير الدعم الأيضي الكافي ، وتقليل الالتهاب والموت الخلوي ، وتحسين وظائف الأعضاء في نهاية المطاف. يجب أن تحتوي محاليل التروية على تركيز بروتين كاف للحفاظ على ضغط الأورام المناسب. ومع ذلك ، غالبا ما تؤدي محاليل التروية الحالية إلى تسرب السوائل من خلال البطانة الرئوية ، مما يؤدي إلى وذمة رئوية غير مقصودة وتلف. وبالتالي ، من الضروري تطوير حلول نضح جديدة تمنع الضرر المفرط مع الحفاظ على التوازن الخلوي المناسب. هنا ، نصف تطبيق حامل الأكسجين القائم على الهيموغلوبين البشري المبلمر (PolyhHb) باعتباره perfusate والبروتوكول الذي يمكن من خلاله اختبار محلول التروية هذا في نموذج EVLP للفئران. الهدف من هذه الدراسة هو تزويد مجتمع زراعة الرئة بالمعلومات الأساسية في تصميم وتطوير حلول نضح جديدة ، بالإضافة إلى البروتوكولات المناسبة لاختبارها في نماذج زرع متعدية ذات صلة سريريا.

Introduction

مثل أي مجال في زراعة الأعضاء الصلبة ، تعاني زراعة الرئة من نقص في الأعضاء المانحة. من أجل زيادة مجموعة المتبرعين ، تم تكريس بحث كبير للتحقيق في إمكانات الطعم الخيفي الذي كان يعتقد في السابق أنه غير مناسب للزرع ، أي المتبرعين بالمعايير الموسعة (ECD). يمكن اعتبار هذه الطعم الخيفي لتنمية الطفولة المبكرة لمجموعة من الأسباب ، بما في ذلك الجودة المشكوك فيها ، وضعف الوظيفة ، والعدوى ، والصدمات ، وأوقات نقص تروية الدفء أو البرودة المطولة ، والتقدم في سن 1,2. في بعض الحالات ، حيث تكون هذه الرئتين مناسبة للزرع الفوري3 ، غالبا ما يكون من المفيد لمقدمي الخدمات والمتلقين على حد سواء تقييم هذه الرئتين لفترة إضافية لتحديد مدى ملاءمتها للزرع. نضح الرئة خارج الجسم الحي (EVLP) هو تقنية تسمح بإجراء تقييم موسع للطعم الخيفي الرئوي المحتمل في دائرة مغلقة خارج المتبرع2،4،5،6،7 ، مما يمنح مقدم الزرع القدرة على تحديد مدى ملاءمة الزرع. أظهر EVLP القدرة على تقييم الأعضاء المانحة بشكل كاف8،9،10،11 ، وتقليل آثار إصابة نقص تروية الدم (IRI) 12،13 وزيادة مجموعة المتبرعين14،15 مما يجعل زراعة الرئة علاجا أكثر سهولة للجميع.

بشكل عام ، نظام EVLP هو نظام مغلق مع دائرة تهوية (يتم تحقيقه عن طريق توصيل جهاز التنفس الصناعي بالقصبة الهوائية لإدخال الهواء في النظام) ودائرة الأوعية الدموية (يتم تحقيقه عن طريق توصيل الأذين الأيسر (LA) بالشريان الرئوي (PA) مع الأنابيب)7. تحتوي الدائرة الوعائية على مادة بيروزوت تمر عبر الأنبوب لإعطاء الرئة العناصر الغذائية الحيوية والأكسجين مع الحد من الوقت الإقفاري البارد (CIT)5،8،16،17. هذا الحل إما قائم على الدم (أي عن طريق إضافة خلايا الدم الحمراء المعبأة (PRBCs))16,17 أو قائم على الخلايا (أي بدون PRBCs)4,5. ومع ذلك ، هناك العديد من العيوب الملحوظة لاستخدام PRBCs. في حالة استخدام PRBCs من المتبرعين الذين ماتوا من الصدمات أو المتبرعين المتوفين دماغيا (BDD) ، غالبا ما تحتوي هذه السوائل على كميات كبيرة من السيتوكينات الالتهابية ، والتي قد تزيد من تلف الخلايا أثناء EVLP بالإضافة إلى زيادة مستويات الهيموجلوبين الخالي من الخلايا (Hb) والهيم والحديد وشظايا الخلايا التي تسبب أضرارا إضافية للخلايا18,19. علاوة على ذلك ، نظرا لأن هؤلاء المتبرعين غالبا ما يكونون متعددي الأعضاء ، فإن جمع PRBCs قبل الشراء يمكن أن يؤدي إلى انخفاض حجم الدم في المتبرع وبالتالي زيادة نقص التروية لجميع الأعضاء. في حالة استخدام PRBCs من مصدر آخر ، قد يواجه مقدمو الخدمة نقصا في الدم لأن هذه مادة نادرة في حد ذاتها 20,21. أخيرا ، تكون PRBCs عرضة للتحلل الميكانيكي على دائرة EVLP بغض النظر عن مصدرها ، مما يؤدي إلى إطلاق Hb والمكونات الأخرى التي تساهم في تلف الخلايا.

وبالتالي ، لأسباب عديدة ، قد يكون من المفيد استخدام بديل لخلايا الدم الحمراء الاصطناعية ، أي ناقلات الأكسجين القائمة على الهيموغلوبين (HBOCs) ، كمكمل بيروسات. أحد HBOC الواعد بشكل خاص هو الهيموغلوبين البشري المبلمر (PolyhHb). يتم تصنيع PolyhHb من Hb المنقى من PRBCs منتهية الصلاحية والتي اعتبرت غير مناسبة لنقل الدمالفوري 22. لقد ثبت أنها بدائل دم قابلة للحياة في الصدمة النزفية23 والزرع24 ويمكن إنتاجها بكميات كبيرة22. ومع ذلك ، فإن اعتماد PolyhHb على نطاق واسع لم ينجح بسبب المضاعفات غير المتوقعة مثل تضيق الأوعية ، وزيادة ضغط الدم ، والسكتة القلبية23,25. من المحتمل أن تكون الأسباب الكامنة وراء هذه النتائج بسبب وجود Hb الخالي من الخلايا أو بوليمرات Hb منخفضة الوزن الجزيئي (< 500 كيلو دالتون) في محلول PolyhHb ، حيث أن لديهم ميلا إلى التسرب في مساحة الأنسجة ، مما أدى إلى انخفاض توافر أكسيد النيتريك ، وتضيق الأوعية اللاحقة ، وارتفاع ضغط الدم الجهازي ، وإصابة الأنسجة المؤكسدة في نهاية المطاف26,27. لتحسين هذه المشكلات ، عمل مختبر بالمر على تطوير الجيل التالي من PolyhHb الذي يحتوي على الحد الأدنى من أنواع MW المنخفضة و Hb الخالية من الخلايا ، والتي أظهرت خصائص فيزيائية حيوية محسنة واستجابات في الجسم الحي 22،28،29،30. أظهرت العديد من دراسات نقل الدم في أنه إذا تم التخلص من بوليمرات Hb منخفضة الوزن الجزيئي من HBOC ، يمكن تخفيف تضيق الأوعية وارتفاع ضغط الدم الجهازي والضرر التأكسدي28،29،31،32،33،34،35. لذلك ، جعل هذا الجيل القادم من PolyhHb مرشحا واعدا.

هنا ، نصف تطبيق الجيل التالي من PolyhHb لاستخدامه في perfusate والبروتوكول الذي يمكن من خلاله اختبار محلول التروية هذا في نموذج EVLP للفئران. الهدف من هذه الدراسة هو تزويد مجتمع زراعة الرئة بالمعلومات الأساسية في تصميم وتطوير حلول نضح جديدة ، بالإضافة إلى توفير بروتوكولات لاختبارها في نماذج زرع متعدية ذات صلة سريريا.

Protocol

تم الحصول على فئران Sprague-Dawley (300 غرام من وزن الجسم) تجاريا وإيوائها في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض في مرفق التابع لمركز ويكسنر الطبي بجامعة ولاية أوهايو. تم تنفيذ جميع الإجراءات بشكل إنساني وفقا للمعاهد الوطنية للصحة ودليل المجلس القومي للبحوث للرعاية الإنسانية واستخدام المختبر وبموافقة لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ولاية أوهايو (بروتوكول IACUC 2023A00000071).

1. توليف وتنقية PolyhHb

ملاحظة: تم نشر إنتاج وتوليف مادة PolyhHb التي تم استخدامها في تجارب EVLP التالية في البداية بواسطة Cuddington et al. في 202022. يرجى الرجوع إلى هذا العمل للحصول على مخططات متعمقة وتحليل لتوليف PolyhHb. فيما يلي ملخص لتوليف وتنقية PolyhHb على نطاق تجريبي وإعداده اللاحق باعتباره perfusate.

  1. غسل كرات الدم الحمراء ، والتحلل ، وتنقية الهيموغلوبين
    1. شراء 18 وحدة من كرات الدم البيضاء البشرية منتهية الصلاحية وصبها في وعاء ترشيح سعة 20 لترا ، مخففا بنسبة 0.9٪ بالوزن إلى الهيماتوكريت النهائي بنسبة 22٪ (الشكل 1B ، C).
    2. قم بإجراء ستة تبادلات حجم النظام (diacycles) على وحدة ترشيح التدفق العرضي (TFF) المعدلة من البولي إيثيلين سلفون (mPES) 0.65 ميكرومتر مع محلول ملحي بنسبة 0.9٪ بالوزن على محلول كرات الدم الحمراء. ملاحظة: الغرض من خطوة الغسيل هذه هو إزالة كرات الدم الحمراء التالفة وشظايا الغشاء والمواد الأخرى خارج الخلية قبل انحلال الدم (الشكل 1B ، C).
    3. تحلل محلول كرات الدم الحمراء مع 10 لتر من المخزن المؤقت للفوسفات (PB ، 3.75 mM ، درجة الحموضة 7.4) لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية مع التحريك المستمر.
    4. قم بإزالة شظايا الغشاء المحللة والركام الآخر عن طريق ترشيح المحلول على وحدة TFF 500 كيلو دالتون وجمع النفاذية في وعاء مفاعل الدفعات 30 لترا (الشكل 1A-C).
    5. بمجرد وجود 480 جم من Hb في المفاعل ، أضف شحنة ملح لتحويل PB إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    6. أعد تدوير الهيموغلوبين من خلال موصل غاز يتم تغذيته بالنيتروجين ، بالإضافة إلى الحفاظ على مساحة رأس النيتروجين في المفاعل ، لإزالة الأكسجين من البروتين طوال الليل. تبرد إلى 14 درجة مئوية للحد من تكوين الميثيموغلوبين (metHb).
  2. بلمرة الهيموغلوبين
    1. سخن محلول الهيموغلوبين إلى درجة حرارة فسيولوجية (37 درجة مئوية) أثناء إعادة تدوير المحلول على حلقة قواطع الغاز.
      ملاحظة: الهدف هو إزالة الأكسجين من البروتين إلى pO2 بين 0-10 مم زئبق لضمان أن معظم الهيموغلوبين في الحالة الرباعية المتوترة (الشكل 1 أ).
    2. أضف 1 غرام من ثنائي ثيونايت الصوديوم ، حسب الحاجة ، لضمان إزالة الأكسجين بشكل فعال.
    3. مع الحفاظ على حلقة إعادة التدوير وإزالة الغاز من محلول Hb ، أضف نسبة مولية 30: 1 من الجلوتارالدهيد (GA) إلى Hb المخفف في 3 لتر من PBS غير المؤكسج (الرقم الهيدروجيني 7.4).
    4. أضف المحلول إلى وعاء المفاعل على مدى 3 ساعات مع ساعة إضافية من وقت التفاعل.
    5. إخماد تفاعل التشابك بنسبة 7: 1 مولية من سيانوبوروهيدريد الصوديوم إلى GA ، مخففة في 3 لتر PBS (درجة الحموضة 7.4). أضفه إلى المفاعل لأكثر من 10 دقائق.
    6. مفاعل التبريد عند 14 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. تنقية بوليهب
    1. قم بضخ محتويات المفاعل في وعاء ترشيح سعة 10 لتر وابدأ الدوران من خلال وحدة TFF من البولي إيثيلين سلفون (PES) 0.2 ميكرومتر (المرحلة 1). ستزيل هذه الخطوة الركام الكبير والملوثات غير المرغوب فيها.
    2. قم بتغذية النفاذية في وعاء ترشيح ثانوي سعة 10 لترات يقوم بتدوير أكثر من وحدة TFF بولي سلفون (PS) 500 كيلو دالتون (المرحلة 2) بمجرد امتلائها. استمر حتى يتم إفراغ المفاعل (الشكل 1B ، D).
    3. بمجرد إفراغ المفاعل في دائرة التنقية ، ابدأ تبادل السواغ في المرحلة 1 بمحلول رينغر المعدل (الرقم الهيدروجيني 7.4). بعد كل تبادل كامل الحجم ، قم بقياس تركيز البروتين في نفاذ المرحلة 1 باستخدام التحليل الطيفي المرئي للأشعة فوق البنفسجية.
    4. عندما يكون تركيز المرحلة 1 أقل من 1 ملغ Hb / mL ، انقل محلول Ringer المعدل إلى المرحلة 2. أي تأخير في المرحلة 1 هو مضيعة ويجب التخلص منه بشكل مناسب. في المجموع ، تأكد من إجراء 12 عملية تبادل كاملة الحجم لحل Ringer المعدل عبر كلتا المرحلتين.
    5. بعد الانتهاء من الدورات ، ركز محتويات المرحلة 2 على 10 جم / ديسيلتر على الأقل على وحدة TFF 500 كيلو دالتون.
    6. قم بتعبئة المحلول المركز في أنابيب مخروطية سعة 50 مل واحفظه في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. صياغة البيروسات

  1. تحضير perfusate إلى حجم نهائي من 165 مل. خفف PolyhHb إلى تركيز نهائي قدره 3.7 جم / ديسيلتر باستخدام وسيط ويليام E.
  2. أضف ألبومين المصل البشري (HSA) إلى تركيز نهائي بنسبة 3٪ HSA بالوزن. أضف 1 مل من الهيبارين إلى المحلول النهائي.

3. إعداد دائرة نضح الرئة خارج الجسم الحي

  1. ضع PolyhHb perfusate في خزان دائرة EVLP وقم بتشغيل حمام الماء الدافئ إلى 37 درجة مئوية. تأكد من دوران البيرفوسات داخل الدائرة عن طريق تشغيل المضخات الدوارة.
  2. قم بتوصيل غاز إزالة الأكسجين (أي 6٪ O2 ، 8٪ CO2 ، 84٪ N2) بجهاز أكسجين الألياف المجوف لإزالة الأكسجين من البيروسات. يتم ذلك لتقييم قدرة الرئة على أكسجة البيرفوسات.
  3. افتح برنامج الحصول على البيانات على جهاز كمبيوتر قريب. تأكد من توصيل ضغط الشريان الرئوي والضغط التفاضلي للقصبة الهوائية والضغط التفاضلي لتدفق الجهاز التنفسي ووزن الرئة ومحولات سرعة المضخة بكل من الدائرة وصندوق محول البيانات.
  4. تأكد من عدم وجود تسرب في جميع أنحاء النظام من خلال فحص جميع وصلات الأنبوب بعناية وأن الماء الدافئ يدور في جميع الأنحاء (الشكل 2). اضغط على تشغيل في برنامج الحصول على البيانات للتأكد من أن جميع محولات الضغط تعمل. بمجرد أن يعمل النظام بشكل صحيح ، قم بإيقاف تشغيل المضخات الدوارة.

4. شراء كتلة رئة الفئران المانحة

  1. قم بإعداد الطاولة الجراحية وتخطيط الأدوات (الشكل 3). الأوتوكلاف جميع الأدوات على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. تحضير 1200 وحدة / كجم من الهيبارين ، خليط الكيتامين / الزيلازين للتخدير (60 مجم / كجم من الكيتامين و 5 مجم / كجم) ، بالإضافة إلى خيوط حرير بطول 5-10 سم (3-0 أو 4-0).
  3. حقن الكيتامين / محلول زيلازين داخل الصفاق في الفئران. انتظر 5-10 دقائق حتى تتطور طائرة التخدير. لضمان مستوى مناسب من التخدير ، قرصة إصبع القدم الفئران لإثارة رد فعل. إذا لم يكن هناك رد فعل ، فقد تم استيفاء المستوى المناسب من التخدير.
  4. حلق بطن الفئران ووضع الفئران في وضع ضعيف على اللوحة الجراحية. تنظيف البطن مع البوفيدون اليود و 70 ٪ من الإيثانول. ضع مرهم العيون تحت عيون الفئران لمنع الجفاف.
  5. انقل الجرذ إلى اللوحة الجراحية وقم بتثبيت الجرذ في مكانه (الشكل 4 أ). قم بتشغيل برنامج الحصول على البيانات وابدأ التسجيل. قم بتشغيل جهاز التنفس الصناعي عند 4 مل / كجم وتأكد من أن ضغط الزفير الإيجابي (PEEP) حوالي 2 سم / ساعة2درجة مئوية.
    ملاحظة: هذه الإعدادات الأولية خاصة بالتجربة. الأمر متروك لجميع الباحثين لتحديد أفضل استراتيجيات التهوية للتجارب الفردية.
  6. بمجرد استيفاء عمق التخدير المناسب ، قم بإجراء بضع البطن في خط الوسط من عملية الخنجري إلى ارتفاق العانة باستخدام مقص. بعد ذلك ، قم بإجراء دوران حشوي وسطي جانبي وتصور الوريد الأجوف السفلي تحت الكبدي باستخدام أداة حادة (IVC)36،37،38 (الشكل 4B). حقن الهيبارين في IVC بإبرة 20G (الشكل 4C).
  7. لفت الانتباه إلى الرقبة وقطع الجلد من الشق القصي إلى أسفل زاوية الفك السفلي بزوج من المقص. بعد ذلك ، ابدأ في تشريح القصبة الهوائية (الشكل 5 أ).
  8. في الرقبة ، قم بتشريح عضلات الشريط اللازمة بصراحة لفضح القصبة الهوائية (الشكل 5 ب). قم بعمل شق عرضي بمقص على القصبة الهوائية الأمامية بين الحلقات الغضروفية الكبيرة بما يكفي لأنبوب القصبة الهوائية (ET) (عدة ملليمترات) ، لكن لا تقطع الجزء الخلفي من القصبة الهوائية. ضع خيطا حريريا 5-0 حول القصبة الهوائية (الشكل 5 ج).
  9. أدخل الأنبوب الرغامي وثبته في مكانه باستخدام خياطة الحرير 5-0 المذكورة أعلاه (الشكل 5 د). قم بتوصيل أنبوب ET بجهاز التنفس الصناعي وتأكد من ارتفاع الصدر بشكل صحيح.
  10. إجراء بضع القص المتوسط وأدخل التجويف الصدري مرة أخرى باستخدام المقص. ضع مبعدات جدار الصدر لكشف القلب والرئتين (الشكل 6 أ). تجنب أي تلاعب غير مقصود بالرئتين ، لأنها قابلة للتفتيت بشكل لا يصدق.
  11. قم بإزالة الغدة الصعترية من المنصف الأمامي عن طريق مزيج من الحاد (المقص) والتشريح الحاد. احرص على عدم إتلاف الأوعية أو الرئتين الكبيرتين.
  12. تحديد الشريان الرئوي (PA; الشكل 6 ب) ووضع خيط حرير 5-0 حوله للتحضير للقنية (الشكل 6 ج). بسبب التشريح المجهري لأوعية الفئران الكبيرة ، غالبا ما يكون من الأسهل وضع الخيط حول السلطة الفلسطينية والشريان الأورطي في نفس الوقت.
  13. قم بعمل شق 2-3 مم في مسار تدفق البطين الأيمن (RVOT) باستخدام مقص (الشكل 6D-E) لوضع القنية الشريانية داخل السلطة الفلسطينية وتثبيتها في مكانها باستخدام خياطة 5-0 الموصوفة قبل خطوة (الشكل 6F).
  14. قم بعمل شق 5 مم في البطين الأيسر (LV) وكذلك IVC تحت الكبد باستخدام مقص للقتل الرحيم للفئران. قم بتوصيل سائل الحفاظ على الرئة بسرعة بالقنية الشريانية لتدفق الرئتين بالجاذبية بحوالي 20 مل (الشكل 7A-B). تأكد من إزالة تهوية سائل الحفاظ على الرئة قبل توصيله بالقنية الشريانية لأن الصمات الهوائية ضارة جدا بالرئتين.
  15. قم بتوصيل القنية الشريانية بدائرة EVLP. قم بتشغيل المضخة الدوارة واترك كمية صغيرة من البيرفوسات تتدفق عبر الرئة وتخرج من البطين الأيسر إلى التجويف الصدري. بمجرد أن يبدأ البيروسات في التدفق من الأذين الأيسر ، قم بإيقاف تشغيل المضخة الدوارة (الشكل 7C). مع السماح للبيرفوسات بالتدفق ، تأكد من عدم ارتفاع ضغط PA - مما يشير إلى انسداد أو وضع غير صحيح.
  16. ضع ملقط صغير في الجهد المنخفض وقم بتمديد حلقة الصمام التاجي برفق ، مما سيسمح بإدخال قنية الأذين الأيسر (LA) (الشكل 8A). ضع ربطة عنق حريرية 5-0 حول القلب واربطها بشكل فضفاض (الشكل 8 ب).
  17. أدخل قنية LA في LV وقم بدفع قنية LA حتى يمكن رؤيتها داخل الأذين. قم بإنهاء تأمين LA بالخيط المربوط مسبقا 5-0 (الشكل 8C).
  18. تحديد المريء وتثبيته مع مرقئ أقرب ما يمكن إلى الحجاب الحاجز. اقطع المريء أسفل المرقئ لضمان عدم وجود انسكاب في التجويف الصدري (الشكل 9 أ).
  19. باستخدام العمود الفقري كدليل ، قم بقطع جميع المرفقات الرباطية التي تربط كتلة القلب والرئة بالهياكل المحيطة باستخدام مقص (الشكل 9 ب). بمجرد أن تصبح كتلة القلب والرئة متحركة بحرية ، قم بتشريح القصبة الهوائية من الرقبة وأخيرا قم بقطع القصبة الهوائية فوق أنبوب ET باستخدام مقص لتحرير كتلة القلب والرئة (الشكل 9C).
  20. انقل كتلة القلب والرئة إلى الغلاف الصدري داخل دائرة EVLP وقم بتوصيل قنية LA بدائرة EVLP (الشكل 9 د). قم بتشغيل مضخة الأسطوانة وتوصيل جهاز التنفس الصناعي.
  21. تحقق من مصيدة الفقاعات للتأكد من عدم إدخال الصمات الهوائية في النظام.
  22. قم بتغيير إعدادات التهوية والتروية ببطء إلى المستويات التجريبية المرغوبة خلال ال 15 دقيقة الأولية36،37،38. بالإضافة إلى ذلك ، خلال مرحلة التكثيف الأولية هذه ، قم بزيادة معدل تدفق التروية إلى المعدل و / أو الضغط المطلوبين.
  23. في النقاط الزمنية المحددة للتجربة ، تحقق من مستويات غاز البيروسات وكذلك اختبارات وظائف الرئة.

النتائج

يوضح الشكل 10 التحقق من صحة البيروسات القائم على PolyhHb ، علاوة على ذلك ، استقرار هذا البيروسات على مدار عدة ساعات. خلال أول ساعة واحدة ، أظهرت جميع perfusates التي تم اختبارها (PolyhHb ، Control (Williams Media + 5٪ HSA) ، RBC based) انخفاضا طفيفا في LA pO2 (Post pO2). ومع ذلك ، أظهر ...

Discussion

يعد تطوير واختبار حلول التروية مسعى جديدا يشرع فيه الكثيرون في جميع أنحاء العالم. تقليديا ، توفر perfusates القياسية القدرة على تعليق الوقت الإقفاري وتخفيف الإصابات المرتبطة بنقص التروية ، وكذلك إعادة التروية18. ومع ذلك ، فإن التطور التالي ل EVLP هو تحسين تقنية الم...

Disclosures

بالنسبة للمواد المعروضة في هذا العمل ، فإن A.F.P. ، A.G. ، و C.C. هم مخترعون في طلب البراءة الأمريكي PCT / US2022/041743. A.F.P. ، C.C. ، B.A.W. ، و S.M.B. هم مخترعون في طلب براءة الاختراع الأمريكي PCT / US2023 / 017765.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث بسخاء من قبل مؤسسة عائلة جويل وفرانك بنسون وأستاذية أبحاث الجوهرة وفرانك بنسون. يتم دعم B.A.W. جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة R01HL143000. يتم دعم AFP من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01HL126945 و R01EB021926 و R01HL131720 و R01HL138116 ومنحة قيادة العتاد الطبي للجيش الأمريكي W81XWH1810059. يتم دعم SMB من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 DK123475.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needleB-D309301
30 L Glass Batch BioreactorAce Glass
30g NeedleMed NeedlesBD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial TabletsElancoNA
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O)Sigma Aldrich10035-04-8For modified Ringer's lactate
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672Harvard Apparatus731747
Connect kit D150Cole-Parmer VK 73-3763
Dumont #5 ForcepsFine Science tools11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45°Fine Science tools11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Water HeaterLaudaLCK 1879
Expired human leukoreduced, packed RBC unitsWexner Medical Center
Canadian Blood Services
Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150Hugo Sachs ElektronikPY2 73-3762
ForcepsFine Science tools11027-12
Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%)Sigma Aldrich111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito HemostatRoboz SurgicalRS-7112
Heparin 30,000 units per 30 mlAPP Pharmaceuticals
Human Serum Albumin (HSA)OctaPharma PlasmaPerfusate additive
IL2 Tube set for perfusateHarvard Apparatus733842
IPL-2 Basic Lung Perfusion SystemHarvard Apparatus
Ketamine 500 mg per 5 mlJHP Pharmaceuticals
Left Atrium cannulaHarvard Apparatus730712
Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor3MG420gas contactor
low potassium dextran glucose solution (perfadex)XVIVOsolution flushing the lung
Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24)Cole-Palmer
N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S)Sigma Aldrich616-91-1 (A7250)For modified Ringer's lactate
Nalgene Vessels (10L, 20L)NalgeneFiltration vessels
Peristaltic Pump Ismatec ISM 827B
PES, 0.65 µm TFF moduleRepligenN02-E65U-07-N
PhysioSuiteKent Scientific CorporationPS-MSTAT-RT
polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF moduleRepligenN02-S20U-05-N
Polysulfone (PS), 500 kDa TFF moduleRepligenN02-P500-05-N
Potassium Chloride (KCl)Fisher Scientific7447-40-7For PBS
PowerLab 8/35 ADInstruments730045
Pulmonary Artery cannulaHarvard Apparatus730710
Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24)PharMed BPT
Puralube Ophthalmic OintmentDechraNA
ScissorsFine Science tools14090-11
SCP Servo controller for perfusion type 704Harvard Apparatus732806
Small Animal Ventilator model 683Harvard Apparatus55-000
Sodium Chloride (NaCl)Fisher Scientific7647-14-5 (S271-10)For PBS and saline
Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3)Sigma Aldrich25895-60-7
Sodium Dithionite (Na2S2O4)Sigma Aldrich7775-14-6
Sodium Hydroxide (NaOH)Fisher Scientific1310-73-2For modified Ringer's lactate
Sodium Lactate (NaC3H5O3)Sigma Aldrich867-56-1For modified Ringer's lactate
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)Fisher Scientific7558-79-4For PBS
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Fisher Scientific7558-80-7For PBS
SomnoSuite Small Animal Anesthesia SystemKent Scientific CorporationSS-MVG-Module
Sprague-Dawley ratsEnvigo
TAM-A transducer amplifier module type 705/1Harvard Apparatus73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2Harvard Apparatus 73-1793
TCM time control module type 686Harvard Apparatus731750
Tracheal cannulaHarvard Apparatus733557
Tube set for moist chamberHarvard Apparatus 73V83157
Tubing CassetteCole-ParmerIS 0649
Tweezer #5 DumostarKent Scientific Corporation INS500085-A
Tweezer #5 stainless steel, curvedKent Scientific CorporationIND500232
Tweezer #7 TitaniumKent Scientific Corporation INS600187
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm IDHarvard Apparatus721017perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm IDHarvard Apparatus721019perfusate line leaving lung
Vannas-Tubingen Spring ScissorsFine Science Tools15008-08
VCM ventilator control module type 681Harvard Apparatus731741
William's E MediaGibco, ThermoFisher ScientificA12176-01Perfusate additive
Xylazine 100 mg per 1 mlAkorn

References

  1. Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2021 annual data report: Lung. Am J Transplant. 23, S379-S442 (2023).
  2. Gouchoe, D. A., et al. Ex vivo lung perfusion in donation after circulatory death: A post hoc analysis of the normothermic Ex Vivo lung perfusion as an assessment of extended/marginal donors lungs trial. J Thorac Cardiovasc Surg. , (2024).
  3. Bobba, C. M., et al. Trends in donation after circulatory death in lung transplantation in the United States: Impact of era. Transpl Int. 35, 10172 (2022).
  4. Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).
  5. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. N Engl J Med. 364 (15), 1431-1440 (2011).
  6. Cypel, M., Neyrinck, A., Machuca, T. N. Ex vivo perfusion techniques: state of the art and potential applications. Intens Care Med. 45 (3), 354-356 (2019).
  7. Gouchoe, D. A., et al. XPS™ Jensen lung as a low-cost, high-fidelity training adjunct to ex-vivo lung perfusion. Artif Organs. , (2023).
  8. Van Raemdonck, D., Rega, F., Rex, S., Neyrinck, A. Machine perfusion of thoracic organs. J Thorac Dis. 10, S910-S923 (2018).
  9. Andreasson, A. S., Dark, J. H., Fisher, A. J. Ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation--state of the art. Eur J Cardiothorac Surg. 46 (5), 779-788 (2014).
  10. Ahmad, K., Pluhacek, J. L., Brown, A. W. Ex vivo lung perfusion: A review of current and future application in lung transplantation. Pulm Ther. 8 (2), 149-165 (2022).
  11. Kim, J. L., et al. Biometric profiling to quantify lung injury through ex vivo lung perfusion following warm ischemia. Asaio j. 69 (8), e368-e375 (2023).
  12. Jeon, J. E., et al. Acellular ex vivo lung perfusate silences pro-inflammatory signaling in human lung endothelial and epithelial cells. J Transl Med. 21 (1), 729 (2023).
  13. Baciu, C., et al. Altered purine metabolism at reperfusion affects clinical outcome in lung transplantation. Thorax. 78 (3), 249-257 (2023).
  14. Peel, J. K., et al. Evaluating the impact of ex vivo lung perfusion on organ transplantation: A retrospective cohort study. Ann Surg. 278 (2), 288-296 (2023).
  15. Peel, J. K., et al. Determining the impact of ex vivo lung perfusion on hospital costs for lung transplantation: A retrospective cohort study. J Heart Lung Transpl. 42 (3), 356-367 (2023).
  16. Warnecke, G., et al. Normothermic ex vivo preservation with the portable Organ Care System Lung device for bilateral lung transplantation (INSPIRE): a randomised, open-label, non-inferiority, phase 3 study. Lancet Respir Med. 6 (5), 357-367 (2018).
  17. Loor, G., et al. Portable normothermic ex vivo lung perfusion, ventilation, and functional assessment with the Organ Care System on donor lung use for transplantation from extended-criteria donors (EXPAND): a single-arm, pivotal trial. Lancet Resp Med. 7 (11), 975-984 (2019).
  18. Loor, G., et al. Prolonged EVLP using OCS lung: Cellular and acellular perfusates. Transplantation. 101 (10), 2303-2311 (2017).
  19. Bansal, S., Biswas, G., Avadhani, N. G. Mitochondria-targeted heme oxygenase-1 induces oxidative stress and mitochondrial dysfunction in macrophages, kidney fibroblasts and in chronic alcohol hepatotoxicity. Redox Biol. 2, 273-283 (2014).
  20. Park, S., et al. Initial investigation on the feasibility of porcine red blood cells from genetically modified pigs as an alternative to human red blood cells for transfusion. Front Immunol. 14, 1298035 (2023).
  21. Ellingson, K. D., et al. Continued decline in blood collection and transfusion in the United States-2015. Transfusion. 57, 1588-1598 (2017).
  22. Cuddington, C. T., et al. Pilot scale production and characterization of next generation high molecular weight and tense quaternary state polymerized human hemoglobin. Biotechnol Bioeng. 119 (12), 3447-3461 (2022).
  23. Moore, E. E., et al. Human polymerized hemoglobin for the treatment of hemorrhagic shock when blood is unavailable: the USA multicenter trial. J Am Coll Surg. 208 (1), 1-13 (2009).
  24. Shonaka, T., et al. Impact of human-derived hemoglobin based oxygen vesicles as a machine perfusion solution for liver donation after cardiac death in a pig model. PLoS One. 14 (12), e0226183 (2019).
  25. Chen, G., Palmer, A. F. Hemoglobin-based oxygen carrier and convection enhanced oxygen transport in a hollow fiber bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102 (6), 1603-1612 (2009).
  26. Bucci, E., Kwansa, H., Koehler, R. C., Matheson, B. Development of zero-link polymers of hemoglobin, which do not extravasate and do not induce pressure increases upon infusion. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 35 (1), 11-18 (2007).
  27. Schaer, C. A., et al. Haptoglobin preserves vascular nitric oxide signaling during hemolysis. Am J Respir Crit Care Med. 193 (10), 1111-1122 (2016).
  28. Muller, C. R., et al. Safety and efficacy of human polymerized hemoglobin on guinea pig resuscitation from hemorrhagic shock. Sci Rep. 12 (1), 20480 (2022).
  29. Greenfield, A., et al. Biophysical analysis and preclinical pharmacokinetics-pharmacodynamics of tangential flow filtration fractionated polymerized human hemoglobin as a red blood cell substitute. Biomacromolecules. 24 (4), 1855-1870 (2023).
  30. Cuddington, C., et al. Polymerized human hemoglobin-based oxygen carrier preserves lung allograft function during normothermic ex vivo lung perfusion. Asaio j. , (2024).
  31. Cabrales, P., et al. Effects of the molecular mass of tense-state polymerized bovine hemoglobin on blood pressure and vasoconstriction. J Appl Physiol. 107 (5), 1548-1558 (2009).
  32. Baek, J. H., et al. Down selection of polymerized bovine hemoglobins for use as oxygen releasing therapeutics in a guinea pig model. Toxicol Sci. 127 (2), 567-581 (2012).
  33. Williams, A. T., et al. Resuscitation from hemorrhagic shock with fresh and stored blood and polymerized hemoglobin. Shock. 54 (4), 464-473 (2020).
  34. Muller, C. R., et al. Resuscitation from hemorrhagic shock after traumatic brain injury with polymerized hemoglobin. Sci Rep. 11 (1), 2509 (2021).
  35. Lamb, D. R., et al. The molecular size of bioengineered oxygen carriers determines tissue oxygenation in a hypercholesterolemia guinea pig model of hemorrhagic shock and resuscitation. Mol Pharm. 20 (11), 5739-5752 (2023).
  36. Bobba, C. M., et al. A novel negative pressure-flow waveform to ventilate lungs for normothermic ex vivo lung perfusion. Asaio j. 67 (1), 96-103 (2021).
  37. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. J Vis Exp. (96), e52309 (2015).
  38. Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), 7-15 (2014).
  39. Wong, A., et al. Potential therapeutic targets for lung repair during human ex vivo lung perfusion. Eur Respir J. 55 (4), 1902222 (2020).
  40. Machuca, T. N., et al. The role of the endothelin-1 pathway as a biomarker for donor lung assessment in clinical ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transpl. 34 (6), 849-857 (2015).
  41. Gouchoe, D. A., et al. Mitsugumin 53 Mitigation of ischemia reperfusion injury in a mouse model. J Thorac Cardiovasc Surg. 10, (2023).
  42. Gouchoe, D. A., Whitson, B. A., Zhu, H. The next frontier in lung transplantation: Protecting the endothelium and repairing organs for transplant utilizing MG53. Clin Transl Dis. 3 (6), e255 (2023).
  43. Gouchoe, D. A., et al. MG53 mitigates warm ischemic lung injury in a murine model of transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg. , (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved