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Explorando soluções alternativas de perfusão usando transportadores de oxigênio à base de hemoglobina polimerizada de última geração em um modelo de perfusão pulmonar ex vivo de rato
* Estes autores contribuíram igualmente
Neste Artigo
Resumo
Aqui, descrevemos a aplicação de um carreador de oxigênio à base de hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusato e o protocolo em que essa solução de perfusão pode ser testada em um modelo de perfusão pulmonar ex vivo de rato.
Resumo
O transplante de pulmão é dificultado pela falta de doadores adequados. Anteriormente, os doadores considerados marginais ou inadequados eram descartados. No entanto, tecnologias novas e empolgantes, como a perfusão pulmonar ex vivo (EVLP), oferecem aos provedores de transplante de pulmão uma avaliação estendida para aloenxertos de doadores marginais. Essa plataforma de avaliação dinâmica levou a um aumento no transplante de pulmão e permitiu que os provedores usassem doadores que antes eram descartados, expandindo assim o pool de doadores. As técnicas de perfusão atuais usam perfusatos celulares ou acelulares, e ambas têm vantagens e desvantagens distintas. A composição da perfusão é fundamental para manter um ambiente homeostático, fornecendo suporte metabólico adequado, diminuindo a inflamação e a morte celular e, finalmente, melhorando a função do órgão. As soluções de perfusão devem conter concentração proteica suficiente para manter a pressão oncótica adequada. No entanto, as soluções de perfusão atuais geralmente levam ao extravasamento de fluido através do endotélio pulmonar, resultando em edema pulmonar inadvertido e danos. Assim, é necessário desenvolver novas soluções de perfusão que evitem danos excessivos, mantendo a homeostase celular adequada. Aqui, descrevemos a aplicação de um carreador de oxigênio à base de hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusato e o protocolo no qual essa solução de perfusão pode ser testada em um modelo de EVLP de rato. O objetivo deste estudo é fornecer à comunidade de transplante de pulmão informações importantes para projetar e desenvolver novas soluções de perfusão, bem como os protocolos adequados para testá-las em modelos de transplante translacional clinicamente relevantes.
Introdução
Como qualquer campo do transplante de órgãos sólidos, o transplante de pulmão sofre com a escassez de órgãos de doadores. A fim de aumentar o pool de doadores, pesquisas significativas têm se dedicado a investigar o potencial de aloenxertos que antes eram considerados inadequados para transplante, ou seja, doadores de critérios estendidos (ECD). Esses aloenxertos podem ser considerados DCE por vários motivos, incluindo qualidade questionável, má função, infecção, trauma, tempos isquêmicos prolongados de calor ou frio e idade avançada 1,2. Em certos casos, onde esses pulmões sã....
Protocolo
Ratos Sprague-Dawley (300 g de peso corporal) foram obtidos comercialmente e alojados em condições livres de patógenos no Centro Médico Wexner da Universidade Estadual de Ohio. Todos os procedimentos foram realizados humanamente de acordo com o NIH e o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o Cuidado Humano e Uso de Animais de Laboratório e com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Ohio (Protocolo IACUC 2023A00000071).
1. Síntese e purificação de PolyhHb
NOTA: A produção e síntese do material PolyhHb que fo....
Resultados Representativos
A validação de nosso perfusato baseado em PolyhHb e, além disso, a estabilidade desse perfusato ao longo de várias horas, é demonstrada na Figura 10. Durante a primeira 1 h, todos os perfusato testados (PolyhHb, Controle (Williams Media + 5% HSA), baseado em hemácias) mostraram uma ligeira diminuição no LA pO2 (Post pO2). No entanto, o perfusato baseado em hemácias mostrou uma diminuição significativa em 1 h em comparação c.......
Discussão
O desenvolvimento e teste de soluções de perfusão é um novo empreendimento no qual muitos em todo o mundo estão embarcando. Tradicionalmente, os perfusato padrão oferecem a capacidade de suspender o tempo isquêmico e mitigar as lesões associadas à isquemia, bem como à reperfusão18. No entanto, a próxima evolução da EVLP é melhorar a tecnologia atual de perfusato, bem como incorporar terapias de reparo e recondicionamento 39,40,41,42,43.
Divulgações
Para o material apresentado neste trabalho, A.F.P., A.G. e C.C. são inventores do pedido de patente dos EUA PCT/US2022/041743. A.F.P., C.C., B.A.W. e S.M.B. são inventores do pedido de patente dos EUA PCT/US2023/017765.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi generosamente apoiada pelo Jewel and Frank Benson Family Endowment e pela Jewel and Frank Benson Research Professorship. B.A.W. é parcialmente apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) conceder R01HL143000. A A.F.P. é apoiada por subsídios do NIH R01HL126945, R01EB021926, R01HL131720 e R01HL138116 e W81XWH1810059 de subsídios do Comando de Pesquisa Médica e Material do Exército dos EUA. O S.M.B. é apoiado pelo NIH R01 DK123475.
....Materiais
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle | B-D | 309301 | |
| 30 L Glass Batch Bioreactor | Ace Glass | ||
| 30g Needle | Med Needles | BD-305106 | |
| Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets | Elanco | NA | |
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma Aldrich | 10035-04-8 | For modified Ringer's lactate |
| CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 | Harvard Apparatus | 731747 | |
| Connect kit D150 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11252-50 | |
| Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45° | Fine Science tools | 11253-25 | |
| Ecoline Star Edition 003, E100 Water Heater | Lauda | LCK 1879 | |
| Expired human leukoreduced, packed RBC units | Wexner Medical Center Canadian Blood Services Zen-Bio Inc | ||
| Fiberoxygenator D150 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
| Forceps | Fine Science tools | 11027-12 | |
| Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%) | Sigma Aldrich | 111-30-8 (G7776) | |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Roboz Surgical | RS-7112 | |
| Heparin 30,000 units per 30 ml | APP Pharmaceuticals | ||
| Human Serum Albumin (HSA) | OctaPharma Plasma | Perfusate additive | |
| IL2 Tube set for perfusate | Harvard Apparatus | 733842 | |
| IPL-2 Basic Lung Perfusion System | Harvard Apparatus | ||
| Ketamine 500 mg per 5 ml | JHP Pharmaceuticals | ||
| Left Atrium cannula | Harvard Apparatus | 730712 | |
| Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor | 3M | G420 | gas contactor |
| low potassium dextran glucose solution (perfadex) | XVIVO | solution flushing the lung | |
| Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24) | Cole-Palmer | ||
| N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S) | Sigma Aldrich | 616-91-1 (A7250) | For modified Ringer's lactate |
| Nalgene Vessels (10L, 20L) | Nalgene | Filtration vessels | |
| Peristaltic Pump | Ismatec | ISM 827B | |
| PES, 0.65 µm TFF module | Repligen | N02-E65U-07-N | |
| PhysioSuite | Kent Scientific Corporation | PS-MSTAT-RT | |
| polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF module | Repligen | N02-S20U-05-N | |
| Polysulfone (PS), 500 kDa TFF module | Repligen | N02-P500-05-N | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For PBS |
| PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
| Pulmonary Artery cannula | Harvard Apparatus | 730710 | |
| Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24) | PharMed BPT | ||
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | NA | |
| Scissors | Fine Science tools | 14090-11 | |
| SCP Servo controller for perfusion type 704 | Harvard Apparatus | 732806 | |
| Small Animal Ventilator model 683 | Harvard Apparatus | 55-000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 7647-14-5 (S271-10) | For PBS and saline |
| Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3) | Sigma Aldrich | 25895-60-7 | |
| Sodium Dithionite (Na2S2O4) | Sigma Aldrich | 7775-14-6 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | 1310-73-2 | For modified Ringer's lactate |
| Sodium Lactate (NaC3H5O3) | Sigma Aldrich | 867-56-1 | For modified Ringer's lactate |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | 7558-79-4 | For PBS |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Fisher Scientific | 7558-80-7 | For PBS |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-MVG-Module | |
| Sprague-Dawley rats | Envigo | ||
| TAM-A transducer amplifier module type 705/1 | Harvard Apparatus | 73-0065 | |
| TAM-D transducer amplifier type 705/2 | Harvard Apparatus | 73-1793 | |
| TCM time control module type 686 | Harvard Apparatus | 731750 | |
| Tracheal cannula | Harvard Apparatus | 733557 | |
| Tube set for moist chamber | Harvard Apparatus | 73V83157 | |
| Tubing Cassette | Cole-Parmer | IS 0649 | |
| Tweezer #5 Dumostar | Kent Scientific Corporation | INS500085-A | |
| Tweezer #5 stainless steel, curved | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
| Tweezer #7 Titanium | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
| Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID | Harvard Apparatus | 721017 | perfusate line entering lung |
| Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID | Harvard Apparatus | 721019 | perfusate line leaving lung |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| VCM ventilator control module type 681 | Harvard Apparatus | 731741 | |
| William's E Media | Gibco, ThermoFisher Scientific | A12176-01 | Perfusate additive |
| Xylazine 100 mg per 1 ml | Akorn |
Referências
- Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2021 annual data report: Lung. Am J Transplant. 23, S379-S442 (2023).
- Gouchoe, D. A., et al. Ex vivo l....
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