Explorando soluções alternativas de perfusão usando transportadores de oxigênio à base de hemoglobina polimerizada de última geração em um modelo de perfusão pulmonar ex vivo de rato

Resumo

Aqui, descrevemos a aplicação de um carreador de oxigênio à base de hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusato e o protocolo em que essa solução de perfusão pode ser testada em um modelo de perfusão pulmonar ex vivo de rato.

Resumo

O transplante de pulmão é dificultado pela falta de doadores adequados. Anteriormente, os doadores considerados marginais ou inadequados eram descartados. No entanto, tecnologias novas e empolgantes, como a perfusão pulmonar ex vivo (EVLP), oferecem aos provedores de transplante de pulmão uma avaliação estendida para aloenxertos de doadores marginais. Essa plataforma de avaliação dinâmica levou a um aumento no transplante de pulmão e permitiu que os provedores usassem doadores que antes eram descartados, expandindo assim o pool de doadores. As técnicas de perfusão atuais usam perfusatos celulares ou acelulares, e ambas têm vantagens e desvantagens distintas. A composição da perfusão é fundamental para manter um ambiente homeostático, fornecendo suporte metabólico adequado, diminuindo a inflamação e a morte celular e, finalmente, melhorando a função do órgão. As soluções de perfusão devem conter concentração proteica suficiente para manter a pressão oncótica adequada. No entanto, as soluções de perfusão atuais geralmente levam ao extravasamento de fluido através do endotélio pulmonar, resultando em edema pulmonar inadvertido e danos. Assim, é necessário desenvolver novas soluções de perfusão que evitem danos excessivos, mantendo a homeostase celular adequada. Aqui, descrevemos a aplicação de um carreador de oxigênio à base de hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusato e o protocolo no qual essa solução de perfusão pode ser testada em um modelo de EVLP de rato. O objetivo deste estudo é fornecer à comunidade de transplante de pulmão informações importantes para projetar e desenvolver novas soluções de perfusão, bem como os protocolos adequados para testá-las em modelos de transplante translacional clinicamente relevantes.

Introdução

Como qualquer campo do transplante de órgãos sólidos, o transplante de pulmão sofre com a escassez de órgãos de doadores. A fim de aumentar o pool de doadores, pesquisas significativas têm se dedicado a investigar o potencial de aloenxertos que antes eram considerados inadequados para transplante, ou seja, doadores de critérios estendidos (ECD). Esses aloenxertos podem ser considerados DCE por vários motivos, incluindo qualidade questionável, má função, infecção, trauma, tempos isquêmicos prolongados de calor ou frio e idade avançada ^1,2. Em certos casos, onde esses pulmões são adequados para transplante imediato³, muitas vezes é vantajoso para provedores e receptores avaliar esses pulmões por mais tempo para determinar sua adequação para transplante. A perfusão pulmonar ex vivo (EVLP) é uma tecnologia que permite a avaliação estendida de potenciais aloenxertos pulmonares em um circuito fechado fora do doador 2,4,5,6,7, proporcionando ao provedor de transplante a capacidade de determinar a adequação do transplante. A PPEV tem demonstrado capacidade de avaliar adequadamente os órgãos de doadores 8,9,10,11, diminuir os efeitos da lesão de reperfusão isquêmica (IRI) ^12,13 e aumentar o pool de doadores^14,15, tornando o transplante pulmonar um tratamento mais acessível para todos.

Em geral, um sistema de PPEV é um sistema fechado com um circuito ventilatório (obtido pela conexão de um ventilador à traqueia para introduzir ar no sistema) e um circuito vascular (obtido pela conexão do átrio esquerdo (AE) à artéria pulmonar (AP) com tubulação)⁷. O circuito vascular tem perfusato perfusando passando pelo tubo para fornecer nutrientes vitais e oxigênio ao pulmão, limitando o tempo isquêmico frio (CIT)5,8,16,17. Essa solução é baseada no sangue (ou seja, por meio da adição de concentrado de hemácias (PRBCs)^)16,17 ou acelular (ou seja, sem PRBCs)^4,5. No entanto, existem várias desvantagens notáveis no uso de PRBCs. Se forem usados CHP de doadores que morreram de trauma ou doadores com morte encefálica (TDC), esses fluidos geralmente contêm grandes quantidades de citocinas inflamatórias, que podem aumentar o dano celular durante a PPEV, bem como aumentar os níveis de hemoglobina livre de células (Hb), heme, ferro e fragmentos celulares que causam danos adicionais às células^18,19. Além disso, como esses doadores geralmente são de múltiplos órgãos, a coleta de CH antes da aquisição pode levar à diminuição do volume sanguíneo no doador e, subsequentemente, ao aumento da isquemia para todos os órgãos. Se usarem CHP de outra fonte, os provedores podem enfrentar escassez de sangue, pois este é um material escasso por si só^20,21. Finalmente, os CHPs são propensos à lise mecânica no circuito EVLP, independentemente de sua fonte, liberando Hb e outros componentes que contribuem para o dano celular.

Assim, por muitas razões, pode ser vantajoso usar um substituto artificial dos glóbulos vermelhos, ou seja, transportadores de oxigênio à base de hemoglobina (HBOCs), como suplemento de perfusato. Um HBOC particularmente promissor é a hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb). A polihHb é sintetizada a partir de Hb purificada de CH vencidas que foram consideradas inadequadas para transfusão imediata²². Eles têm se mostrado substitutos viáveis do sangue no choque hemorrágico²³ e no transplante²⁴ e podem ser produzidos em grandes quantidades²². No entanto, a adoção em larga escala da PolihHb não teve sucesso devido a complicações imprevistas, como vasoconstrição, aumento da pressão arterial e parada cardíaca^23,25. As razões por trás desses achados foram provavelmente devido à presença de polímeros de Hb livre ou de baixo peso molecular (< 500 kDa) na solução de PolyhHb, pois eles têm uma propensão a extravasar para o espaço tecidual, o que resultou em diminuição da disponibilidade de óxido nítrico, subsequente vasoconstrição, hipertensão sistêmica e, finalmente, lesão oxidativa do tecido^26,27. Para melhorar essas questões, o Laboratório Palmer trabalhou para desenvolver um PolyhHb de próxima geração que contenha espécies mínimas de baixo MW e Hb livre de células, que demonstrou características biofísicas aprimoradas e respostas in vivo 22,28,29,30. Vários estudos transfusionais em animais mostraram que, se polímeros de Hb de baixo peso molecular forem eliminados do HBOC, a vasoconstrição, a hipertensão sistêmica e o dano oxidativo podem ser mitigados 28,29,31,32,33,34,35. Portanto, tornando este PolyhHb de próxima geração um candidato promissor a perfusato.

Aqui, descrevemos a aplicação de um PolyhHb de última geração para ser usado em um perfusato e o protocolo pelo qual essa solução de perfusão pode ser testada em um modelo de EVLP de rato. O objetivo deste estudo é fornecer à comunidade de transplante de pulmão informações importantes na concepção e desenvolvimento de novas soluções de perfusão, bem como fornecer protocolos para testá-las em modelos de transplante translacional clinicamente relevantes.

Protocolo

Ratos Sprague-Dawley (300 g de peso corporal) foram obtidos comercialmente e alojados em condições livres de patógenos no Centro Médico Wexner da Universidade Estadual de Ohio. Todos os procedimentos foram realizados humanamente de acordo com o NIH e o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o Cuidado Humano e Uso de Animais de Laboratório e com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Ohio (Protocolo IACUC 2023A00000071).

1. Síntese e purificação de PolyhHb

NOTA: A produção e síntese do material PolyhHb que foi usado para os seguintes experimentos de EVLP foram inicialmente publicados por Cuddington et al. em 2020²². Consulte este trabalho para esquemas detalhados e análise da síntese de PolyhHb. A seguir, um resumo da síntese e purificação de PolyhHb em escala piloto e sua subsequente preparação como perfusato.

1. Lavagem de hemácias, lise e purificação de Hb
   1. Adquira 18 unidades de CH humanos vencidos e despeje-os em um recipiente de filtração de 20 L, diluído com 0,9% em peso de solução salina até um hematócrito final de 22% (Figura 1B, C).
   2. Realize seis trocas de volume do sistema (diaciclos) em um módulo de filtração de fluxo tangencial (TFF) de polietileno sulfona modificado (mPES) de 0,65 μm com 0,9% em peso de solução salina na solução de hemácias. NOTA: O objetivo desta etapa de lavagem é remover hemácias danificadas, fragmentos de membrana e outros materiais extracelulares antes da hemólise ( Figura 1B, C ).
   3. Lisar a solução de hemácias com 10 l de tampão fosfato (PB, 3,75 mM, pH 7,4) durante 1 h a 4 °C com agitação constante.
   4. Remover os fragmentos de membrana lisada e outros agregados filtrando a solução sobre um módulo TFF de 500 kDa e recolhendo o permeado no recipiente do reator de 30 L (Figura 1A-C).
   5. Quando 480 g de Hb estiverem no reator, adicione uma carga de sal para converter PB em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   6. Recircule o Hb através de um contator de gás alimentado com nitrogênio, bem como mantenha um espaço de cabeça de nitrogênio no reator, para desoxigenar a proteína durante a noite. Refrigerar a 14 °C para limitar a formação de metemoglobina (metHb).
2. Polimerização de Hb
   1. Aquecer a solução de Hb à temperatura fisiológica (37 °C) enquanto recircula a solução num circuito de contactor de gás.
      NOTA: O objetivo é desoxigenar a proteína a um pO₂ entre 0-10 mmHg para garantir que a maior parte da Hb esteja no estado quaternário tenso (Figura 1A).
   2. Adicione 1 g de carga de ditionito de sódio, conforme necessário, para garantir uma desoxigenação eficaz.
   3. Enquanto mantém o circuito de recirculação e desgaseifica a solução de Hb, adicione uma proporção molar de 30:1 de glutaraldeído (GA) para Hb diluído em 3 L de PBS desoxigenado (pH 7,4).
   4. Adicionar a solução ao vaso do reator durante 3 h com uma hora adicional de tempo de reação.
   5. Extinguir a reação de reticulação com uma proporção molar de 7:1 de cianoborohidreto de sódio para GA, diluído em 3 L de PBS (pH 7,4). Adicione ao reator por mais de 10 min.
   6. Refrigerar o reactor a 14 °C durante a noite.
3. Purificação de PolyhHb
   1. Bombeie o conteúdo do reator para um recipiente de filtragem de 10 L e inicie a circulação através de um módulo TFF de polietileno sulfona (PES) de 0,2 μm (Estágio 1). Esta etapa removerá grandes agregados e contaminantes indesejados.
   2. Alimente o permeado em um recipiente de filtragem secundário de 10 L que circulará sobre um módulo TFF de polissulfona (PS) de 500 kDa (Stage 2) uma vez cheio. Continue até que o reator seja esvaziado (Figura 1B,D).
   3. Assim que o reator for esvaziado no circuito de purificação, inicie a troca de excipientes no Stage 1 com uma solução de Ringer com lactato modificada (pH 7,4). Após cada troca de volume total, medir a concentração de proteínas no permeado da fase 1 utilizando espectroscopia UV-visível.
   4. Quando o permeado do Estágio 1 tiver uma concentração inferior a 1 mg Hb / mL, transfira a solução de Ringer modificada para o Estágio 2. Qualquer retenção no Stage 1 é um desperdício e deve ser descartado adequadamente. No total, certifique-se de que 12 trocas de volume total da solução de Ringer modificada sejam realizadas em ambos os estágios.
   5. Após a conclusão dos diaciclos, concentrar o conteúdo da fase 2 em, pelo menos, 10 g/dL sobre o módulo TFF de 500 kDa.
   6. Embalar a solução concentrada em tubos cónicos de 50 ml e conservar a -80 °C até à utilização.

2. Formulação de perfusato

1. Prepare o perfusato para um volume final de 165 mL. Diluir o PolyhHb até uma concentração final de 3,7 g/dL com o meio E de William.
2. Adicione albumina sérica humana (HSA) a uma concentração final de 3% de HSA em peso. Adicione 1 mL de heparina à solução final.

3. Configuração do circuito de perfusão pulmonar ex vivo

1. Coloque o perfusato de PolyhHb no reservatório do circuito EVLP e ligue o banho-maria quente a 37 °C. Certifique-se de que o perfusato esteja circulando dentro do circuito ligando as bombas de rolos.
2. Conecte o gás de desoxigenação (ou seja, 6% O₂, 8% CO₂, 84% N₂) ao oxigenador de fibra oca para desoxigenar o perfusato. Isso é feito para avaliar a capacidade do pulmão de oxigenar o perfusato.
3. Abra o software de aquisição de dados em um computador próximo. Certifique-se de que a pressão da artéria pulmonar, a pressão diferencial traqueal, a pressão diferencial do fluxo respiratório, o peso pulmonar e os transdutores de velocidade da bomba estejam conectados ao circuito e à caixa do conversor de dados.
4. Certifique-se de que não haja vazamentos em todo o sistema, examinando cuidadosamente todas as conexões do tubo e que a água quente esteja circulando (Figura 2). Pressione Executar no software de aquisição de dados para garantir que todos os transdutores de pressão estejam funcionando. Quando o sistema estiver funcionando corretamente, desligue as bombas de rolos.

4. Obtenção de bloqueio pulmonar de rato doador

1. Montar a mesa cirúrgica e dispor os instrumentos (Figura 3). Autoclave todos os instrumentos a 121 °C por 30 min.
2. Prepare 1200 U/kg de heparina, uma mistura de cetamina/xilazina para anestésico (60 mg/kg de cetamina e 5 mg/kg), bem como suturas de seda de 5-10 cm de comprimento (3-0 ou 4-0).
3. Injete a solução de cetamina/xilazina por via intraperitoneal no rato. Aguarde de 5 a 10 minutos para que o plano anestésico se desenvolva. Para garantir um nível adequado de anestesia, belisque o rato com o dedo do pé para provocar uma reação. Se não houver reação, o nível adequado de anestesia foi atingido.
4. Raspe o abdômen do rato e coloque-o em decúbito dorsal na prancha cirúrgica. Limpe o abdômen com iodopovidona e etanol 70%. Coloque pomada oftálmica sob os olhos do rato para evitar o ressecamento.
5. Mova o rato para a placa cirúrgica e prenda o rato no lugar (Figura 4A). Ligue o software de aquisição de dados e comece a gravar. Ligue o ventilador a 4 mL/kg e certifique-se de que a pressão expiratória final positiva (PEEP) esteja em torno de 2 cm/H₂O.
   NOTA: Essas configurações iniciais são específicas do experimento. Cabe a todos os pesquisadores determinar as melhores estratégias ventilatórias para experimentos individuais.
6. Uma vez atingida a profundidade anestésica adequada, realize uma laparotomia da linha média do processo xifóide até a sínfise púbica usando uma tesoura. Em seguida, realizar uma rotação visceral médio-lateral e visualizar a veia cava inferior infra-hepática usando um instrumento rombudo (VCI)36,37,38 (Figura 4B). Injete heparina na VCI com uma agulha 20G (Figura 4C).
7. Volte a atenção para o pescoço e corte a pele da incisura esternal até logo abaixo do ângulo da mandíbula com uma tesoura. Em seguida, comece a dissecar em direção à traqueia (Figura 5A).
8. No pescoço, disseque sem rodeios os músculos necessários da cinta para expor a traqueia (Figura 5B). Faça uma incisão transversal com uma tesoura na traqueia anterior entre os anéis cartilaginosos grande o suficiente para o tubo endotraqueal (ET) (vários milímetros), mas não corte a porção posterior da traqueia. Coloque uma sutura de seda 5-0 ao redor da traqueia (Figura 5C).
9. Insira o tubo endotraqueal e fixe-o no lugar com a sutura de seda 5-0 mencionada acima (Figura 5D). Conecte o tubo ET ao ventilador e garanta a elevação adequada do tórax.
10. Realize uma esternotomia mediana e entre novamente na cavidade torácica usando uma tesoura. Coloque afastadores da parede torácica para expor o coração e os pulmões (Figura 6A). Evite qualquer manipulação inadvertida dos pulmões, pois eles são incrivelmente friáveis.
11. Remova o timo do mediastino anterior por uma combinação de dissecção afiada (tesoura) e romba. Tenha cuidado para não danificar grandes vasos ou pulmões.
12. Identificar a artéria pulmonar (AP; Figura 6B) e coloque uma sutura de seda 5-0 ao redor para preparar a canulação (Figura 6C). Devido à anatomia microscópica dos grandes vasos do rato, muitas vezes é mais fácil colocar a sutura ao redor do PA e da aorta ao mesmo tempo.
13. Faça uma incisão de 2-3 mm na via de saída do ventrículo direito (VSVD) usando uma tesoura (Figura 6D-E) para colocar a cânula arterial dentro do AP e fixá-la no lugar com a sutura 5-0 descrita um passo antes (Figura 6F).
14. Faça uma incisão de 5 mm no ventrículo esquerdo (VE), bem como na VCI infra-hepática, usando uma tesoura para eutanasiar o rato. Conecte rapidamente o fluido de preservação pulmonar à cânula arterial para lavar os pulmões por gravidade com cerca de 20 mL (Figura 7A-B). Certifique-se de que o fluido de preservação pulmonar seja desarejado antes de conectá-lo à cânula arterial, pois os êmbolos aéreos são muito prejudiciais aos pulmões.
15. Conecte a cânula arterial ao circuito EVLP. Ligue a bomba de rolos e deixe uma pequena quantidade de perfusato fluir através do pulmão e sair do ventrículo esquerdo para a cavidade torácica. Assim que o perfusato começar a fluir para fora do átrio esquerdo, desligue a bomba de rolos (Figura 7C). Ao permitir que o perfusato flua, certifique-se de que a pressão do PA não aumente - o que indicaria bloqueio ou posicionamento incorreto.
16. Coloque uma pequena pinça no VE e estique suavemente o anel da valva mitral, o que permitirá a introdução da cânula do átrio esquerdo (AE) (Figura 8A). Coloque uma gravata de seda 5-0 ao redor do coração e amarre frouxamente (Figura 8B).
17. Insira a cânula AL no VE e avance a cânula AL até que possa ser vista dentro do átrio. Termine de prender o AE com a sutura 5-0 pré-amarrada (Figura 8C).
18. Identifique o esôfago e prenda-o com um hemostático o mais próximo possível do diafragma. Corte o esôfago abaixo do hemostático para garantir que não haja derramamento na cavidade torácica (Figura 9A).
19. Usando a coluna como guia, corte todas as inserções ligamentares que conectam o bloco coração-pulmão às estruturas circundantes usando uma tesoura (Figura 9B). Uma vez que o bloqueio coração-pulmão esteja livremente móvel, disseque a traqueia do pescoço e, finalmente, corte a traqueia acima do tubo ET usando uma tesoura para liberar o bloqueio coração-pulmão (Figura 9C).
20. Mova o bloqueio coração-pulmão para a jaqueta torácica dentro do circuito EVLP e conecte a cânula AL ao circuito EVLP (Figura 9D). Ligue a bomba de rolos e conecte o monitor do ventilador.
21. Verifique a armadilha de bolhas para garantir que nenhum êmbolo de ar esteja sendo introduzido no sistema.
22. Altere lentamente as configurações de ventilação e perfusão para os níveis experimentais desejados durante os 15 minutos iniciais 36,37,38. Além disso, durante esta fase inicial de aceleração, aumente a taxa de fluxo de perfusão para a taxa e/ou pressão desejada.
23. Em pontos de tempo designados pelo experimento, verifique os níveis de gás perfusato, bem como os testes de função pulmonar.

Resultados

A validação de nosso perfusato baseado em PolyhHb e, além disso, a estabilidade desse perfusato ao longo de várias horas, é demonstrada na Figura 10. Durante a primeira 1 h, todos os perfusato testados (PolyhHb, Controle (Williams Media + 5% HSA), baseado em hemácias) mostraram uma ligeira diminuição no LA pO₂ (Post pO₂). No entanto, o perfusato baseado em hemácias mostrou uma diminuição significativa em 1 h em comparação c...

Discussão

O desenvolvimento e teste de soluções de perfusão é um novo empreendimento no qual muitos em todo o mundo estão embarcando. Tradicionalmente, os perfusato padrão oferecem a capacidade de suspender o tempo isquêmico e mitigar as lesões associadas à isquemia, bem como à reperfusão¹⁸. No entanto, a próxima evolução da EVLP é melhorar a tecnologia atual de perfusato, bem como incorporar terapias de reparo e recondicionamento 39,40,41,42,43.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle	B-D	309301
30 L Glass Batch Bioreactor	Ace Glass
30g Needle	Med Needles	BD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets	Elanco	NA
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O)	Sigma Aldrich	10035-04-8	For modified Ringer's lactate
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672	Harvard Apparatus	731747
Connect kit D150	Cole-Parmer	VK 73-3763
Dumont #5 Forceps	Fine Science tools	11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45°	Fine Science tools	11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Water Heater	Lauda	LCK 1879
Expired human leukoreduced, packed RBC units	Wexner Medical Center Canadian Blood Services Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150	Hugo Sachs Elektronik	PY2 73-3762
Forceps	Fine Science tools	11027-12
Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%)	Sigma Aldrich	111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito Hemostat	Roboz Surgical	RS-7112
Heparin 30,000 units per 30 ml	APP Pharmaceuticals
Human Serum Albumin (HSA)	OctaPharma Plasma		Perfusate additive
IL2 Tube set for perfusate	Harvard Apparatus	733842
IPL-2 Basic Lung Perfusion System	Harvard Apparatus
Ketamine 500 mg per 5 ml	JHP Pharmaceuticals
Left Atrium cannula	Harvard Apparatus	730712
Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor	3M	G420	gas contactor
low potassium dextran glucose solution (perfadex)	XVIVO		solution flushing the lung
Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24)	Cole-Palmer
N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S)	Sigma Aldrich	616-91-1 (A7250)	For modified Ringer's lactate
Nalgene Vessels (10L, 20L)	Nalgene		Filtration vessels
Peristaltic Pump	Ismatec	ISM 827B
PES, 0.65 µm TFF module	Repligen	N02-E65U-07-N
PhysioSuite	Kent Scientific Corporation	PS-MSTAT-RT
polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF module	Repligen	N02-S20U-05-N
Polysulfone (PS), 500 kDa TFF module	Repligen	N02-P500-05-N
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	7447-40-7	For PBS
PowerLab 8/35	ADInstruments	730045
Pulmonary Artery cannula	Harvard Apparatus	730710
Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24)	PharMed BPT
Puralube Ophthalmic Ointment	Dechra	NA
Scissors	Fine Science tools	14090-11
SCP Servo controller for perfusion type 704	Harvard Apparatus	732806
Small Animal Ventilator model 683	Harvard Apparatus	55-000
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	7647-14-5 (S271-10)	For PBS and saline
Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3)	Sigma Aldrich	25895-60-7
Sodium Dithionite (Na2S2O4)	Sigma Aldrich	7775-14-6
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	1310-73-2	For modified Ringer's lactate
Sodium Lactate (NaC3H5O3)	Sigma Aldrich	867-56-1	For modified Ringer's lactate
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Fisher Scientific	7558-79-4	For PBS
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Fisher Scientific	7558-80-7	For PBS
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SS-MVG-Module
Sprague-Dawley rats	Envigo
TAM-A transducer amplifier module type 705/1	Harvard Apparatus	73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2	Harvard Apparatus	73-1793
TCM time control module type 686	Harvard Apparatus	731750
Tracheal cannula	Harvard Apparatus	733557
Tube set for moist chamber	Harvard Apparatus	73V83157
Tubing Cassette	Cole-Parmer	IS 0649
Tweezer #5 Dumostar	Kent Scientific Corporation	INS500085-A
Tweezer #5 stainless steel, curved	Kent Scientific Corporation	IND500232
Tweezer #7 Titanium	Kent Scientific Corporation	INS600187
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID	Harvard Apparatus	721017	perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID	Harvard Apparatus	721019	perfusate line leaving lung
Vannas-Tubingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15008-08
VCM ventilator control module type 681	Harvard Apparatus	731741
William's E Media	Gibco, ThermoFisher Scientific	A12176-01	Perfusate additive
Xylazine 100 mg per 1 ml	Akorn