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この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 代表的な結果
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  • 開示事項
  • 謝辞
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要約

ここでは、重合ヒトヘモグロビン(PolyhHb)ベースの酸素キャリアを灌流液として適用する方法と、この灌流溶液をラット のex vivo 肺灌流モデルで試験できるプロトコルについて説明します。

要約

肺移植は、適切なドナーの不足によって妨げられています。以前は、限界的または不十分であると考えられていたドナーは破棄されていました。しかし、 ex vivo 肺灌流 (EVLP) などの新しくエキサイティングな技術により、肺移植提供者は限界ドナー同種移植片に対する評価を延長できます。このダイナミックな評価プラットフォームにより、肺移植が増加し、医療提供者は以前は廃棄されていたドナーを使用できるようになったため、ドナープールが拡大しました。現在の灌流技術は、細胞性灌流または無細胞性灌流物を使用しており、どちらにも明確な長所と短所があります。灌流組成物は、恒常性を維持し、適切な代謝サポートを提供し、炎症と細胞死を減少させ、最終的には臓器機能を改善するために重要です。灌流溶液には、適切な膠質浸透圧を維持するために十分なタンパク質濃度が含まれている必要があります。しかし、現在の灌流溶液は、肺内皮を介した体液の血管外漏出につながることが多く、不注意による肺水腫や損傷を引き起こします。したがって、適切な細胞恒常性を維持しながら過度の損傷を防ぐ新しい灌流ソリューションを開発する必要があります。ここでは、重合ヒトヘモグロビン(PolyhHb)ベースの酸素キャリアを灌流液として適用する方法と、この灌流溶液をラットEVLPのモデルで試験できるプロトコルについて説明します。この研究の目標は、肺移植コミュニティに、新しい灌流ソリューションの設計と開発における重要な情報と、臨床的に関連するトランスレーショナル移植モデルでそれらをテストするための適切なプロトコルを提供することです。

概要

固形臓器移植の他の分野と同様に、肺移植はドナー臓器の不足に悩まされています。ドナープールを増やすために、かつて移植に適さないと考えられていた同種移植片、すなわち拡張基準ドナー(ECD)の可能性を調査するために重要な研究が捧げられてきました。これらの同種移植片は、疑わしい品質、機能の低下、感染、外傷、長期にわたる温かくまたは寒い虚血性時間、高齢など、さまざまな理由でECDと見なすことができます1,2。場合によっては、これらの肺が即時移植3に適している場合、これらの肺をさらに評価して移植への適合性を判断することは、提供者とレシピエントの両方にとって有利であることがよくあります。Ex vivo 肺灌流 (EVLP) は、ドナー 2,4,5,6,7 の外部の閉回路で潜在的な肺同種移植片の拡張評価を可能にする技術であり、移植提供者が移植の適合性を判断できるようにします。E....

プロトコル

Sprague-Dawleyラット(体重300g)は、オハイオ州立大学ウェクスナー医療センター動物施設で病原体のない条件下で商業的に入手され、飼育されました。すべての手順は、NIHおよびNational Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animalsに従い、オハイオ州立大学施設動物管理および使用委員会(IACUC Protocol 2023A00000071)の承認を得て、人道的に行われました。

1. PolyhHbの合成および精製

注:以下のEVLP実験に使用されたPolyhHb材料の製造と合成は、2020年にCuddingtonらによって最初に発表されました22。PolyhHb合成の詳細な回路図と解析については、この資料を参照してください。以下は、パイロットスケールでのPolyhHbの合成と精製、およびその後の灌流剤としての調製についてまとめたものです。

  1. RBC洗浄、溶解、およびHb精製
    1. 18ユニットの呼気満了ヒトPRBCを調達し、20Lのろ過容器に注ぎ、0.9 wt%生理食塩水で希釈して最終ヘマトクリットを22%にします(

代表的な結果

当社のPolyhHbベースの灌流液の検証、さらにこの灌流液の数時間にわたる安定性を図10に示します。最初の1時間で、試験したすべての灌流液(PolyhHb、コントロール(Williams Media + 5% HSA)、RBCベース)では、LA pO2(Post pO2)がわずかに減少しました。しかし、RBCベースの灌流液は、PolyhHbと比較して1時間で有意な減少を示しました(p < 0.05)。?.......

ディスカッション

灌流ソリューションの開発とテストは、世界中の多くの人々が着手している斬新な試みです。伝統的に、標準的な灌流剤は、虚血時間を中断し、虚血に伴う損傷を軽減する能力、および再灌流18を提供します。しかし、EVLPの次の進化は、現在の灌流技術を改善し、修復および再調整療法を組み込むことです39,40,41,42,43。

開示事項

この作品で提示されている資料については、A.F.P.、A.G.、およびC.C.は、米国特許出願PCT/US2022/041743の発明者です。A.F.P.、C.C.、B.A.W.、S.M.B.は、米国特許出願PCT/US2023/017765の発明者です。

謝辞

この研究は、ジュエル・アンド・フランク・ベンソン・ファミリー基金とジュエル・アンド・フランク・ベンソン研究教授職の多大な支援を受けました。B.A.W.は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R01HL143000によって部分的にサポートされています。AFPは、NIHの助成金R01HL126945、R01EB021926、R01HL131720、R01HL138116、および米国陸軍医学研究および資材司令部の助成金W81XWH1810059によってサポートされています。S.M.B.はNIH R01 DK123475でサポートされています。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needleB-D309301
30 L Glass Batch BioreactorAce Glass
30g NeedleMed NeedlesBD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial TabletsElancoNA
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O)Sigma Aldrich10035-04-8For modified Ringer's lactate
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672Harvard Apparatus731747
Connect kit D150Cole-Parmer VK 73-3763
Dumont #5 ForcepsFine Science tools11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45°Fine Science tools11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Water HeaterLaudaLCK 1879
Expired human leukoreduced, packed RBC unitsWexner Medical Center
Canadian Blood Services
Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150Hugo Sachs ElektronikPY2 73-3762
ForcepsFine Science tools11027-12
Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%)Sigma Aldrich111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito HemostatRoboz SurgicalRS-7112
Heparin 30,000 units per 30 mlAPP Pharmaceuticals
Human Serum Albumin (HSA)OctaPharma PlasmaPerfusate additive
IL2 Tube set for perfusateHarvard Apparatus733842
IPL-2 Basic Lung Perfusion SystemHarvard Apparatus
Ketamine 500 mg per 5 mlJHP Pharmaceuticals
Left Atrium cannulaHarvard Apparatus730712
Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor3MG420gas contactor
low potassium dextran glucose solution (perfadex)XVIVOsolution flushing the lung
Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24)Cole-Palmer
N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S)Sigma Aldrich616-91-1 (A7250)For modified Ringer's lactate
Nalgene Vessels (10L, 20L)NalgeneFiltration vessels
Peristaltic Pump Ismatec ISM 827B
PES, 0.65 µm TFF moduleRepligenN02-E65U-07-N
PhysioSuiteKent Scientific CorporationPS-MSTAT-RT
polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF moduleRepligenN02-S20U-05-N
Polysulfone (PS), 500 kDa TFF moduleRepligenN02-P500-05-N
Potassium Chloride (KCl)Fisher Scientific7447-40-7For PBS
PowerLab 8/35 ADInstruments730045
Pulmonary Artery cannulaHarvard Apparatus730710
Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24)PharMed BPT
Puralube Ophthalmic OintmentDechraNA
ScissorsFine Science tools14090-11
SCP Servo controller for perfusion type 704Harvard Apparatus732806
Small Animal Ventilator model 683Harvard Apparatus55-000
Sodium Chloride (NaCl)Fisher Scientific7647-14-5 (S271-10)For PBS and saline
Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3)Sigma Aldrich25895-60-7
Sodium Dithionite (Na2S2O4)Sigma Aldrich7775-14-6
Sodium Hydroxide (NaOH)Fisher Scientific1310-73-2For modified Ringer's lactate
Sodium Lactate (NaC3H5O3)Sigma Aldrich867-56-1For modified Ringer's lactate
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)Fisher Scientific7558-79-4For PBS
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Fisher Scientific7558-80-7For PBS
SomnoSuite Small Animal Anesthesia SystemKent Scientific CorporationSS-MVG-Module
Sprague-Dawley ratsEnvigo
TAM-A transducer amplifier module type 705/1Harvard Apparatus73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2Harvard Apparatus 73-1793
TCM time control module type 686Harvard Apparatus731750
Tracheal cannulaHarvard Apparatus733557
Tube set for moist chamberHarvard Apparatus 73V83157
Tubing CassetteCole-ParmerIS 0649
Tweezer #5 DumostarKent Scientific Corporation INS500085-A
Tweezer #5 stainless steel, curvedKent Scientific CorporationIND500232
Tweezer #7 TitaniumKent Scientific Corporation INS600187
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm IDHarvard Apparatus721017perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm IDHarvard Apparatus721019perfusate line leaving lung
Vannas-Tubingen Spring ScissorsFine Science Tools15008-08
VCM ventilator control module type 681Harvard Apparatus731741
William's E MediaGibco, ThermoFisher ScientificA12176-01Perfusate additive
Xylazine 100 mg per 1 mlAkorn

参考文献

  1. Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2021 annual data report: Lung. Am J Transplant. 23, S379-S442 (2023).
  2. Gouchoe, D. A., et al. Ex vivo l....

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