Erforschung alternativer Perfusionslösungen unter Verwendung von polymerisierten hämoglobinbasierten Sauerstoffträgern der nächsten Generation in einem Modell der ex vivo Lungenperfusion von Ratten

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Anwendung eines polymerisierten humanen Hämoglobin (PolyhHb)-basierten Sauerstoffträgers als Perfusat und das Protokoll, in dem diese Perfusionslösung in einem Modell der ex vivo Lungenperfusion von Ratten getestet werden kann.

Zusammenfassung

Eine Lungentransplantation wird durch den Mangel an geeigneten Spendern erschwert. Früher wurden Spender, die als marginal oder unzureichend galten, verworfen. Neue und aufregende Technologien, wie z. B. die Ex-vivo-Lungenperfusion (EVLP), bieten Lungentransplantationsanbietern jedoch eine erweiterte Bewertung für Allotransplantate von marginalen Spendern. Diese dynamische Bewertungsplattform hat zu einer Zunahme der Lungentransplantationen geführt und es den Anbietern ermöglicht, Spender zu verwenden, die zuvor verworfen wurden, wodurch der Spenderpool erweitert wurde. Derzeitige Perfusionstechniken verwenden zelluläre oder azelluläre Perfusate, und beide haben unterschiedliche Vor- und Nachteile. Die Zusammensetzung der Perfusion ist entscheidend für die Aufrechterhaltung eines homöostatischen Milieus, eine angemessene metabolische Unterstützung, die Verringerung von Entzündungen und Zelltod und letztendlich die Verbesserung der Organfunktion. Perfusionslösungen müssen eine ausreichende Proteinkonzentration enthalten, um einen angemessenen onkotischen Druck aufrechtzuerhalten. Derzeitige Perfusionslösungen führen jedoch häufig zu einer Flüssigkeitsextravasation durch das Lungenendothel, was zu unbeabsichtigten Lungenödemen und -schäden führt. Daher ist es notwendig, neuartige Perfusionslösungen zu entwickeln, die übermäßige Schäden verhindern und gleichzeitig eine ordnungsgemäße zelluläre Homöostase aufrechterhalten. Hier beschreiben wir die Anwendung eines polymerisierten humanen Hämoglobin (PolyhHb)-basierten Sauerstoffträgers als Perfusat und das Protokoll, in dem diese Perfusionslösung in einem Modell der EVLP der Ratte getestet werden kann. Das Ziel dieser Studie ist es, der Lungentransplantationsgemeinschaft wichtige Informationen für die Konzeption und Entwicklung neuartiger Perfusionslösungen sowie die richtigen Protokolle zur Verfügung zu stellen, um sie in klinisch relevanten translationalen Transplantationsmodellen zu testen.

Einleitung

Wie jeder Bereich der soliden Organtransplantation leidet auch die Lungentransplantation unter einem Mangel an Spenderorganen. Um den Spenderpool zu vergrößern, wurde viel geforscht, um das Potenzial von Allotransplantaten zu untersuchen, die einst als ungeeignet für eine Transplantation galten, d.h. Spender mit erweiterter Kriterien, d.h. Spender mit erweiterten Kriterien (ECD). Diese Allotransplantate können aus einer Reihe von Gründen als ECD angesehen werden, darunter fragwürdige Qualität, schlechte Funktion, Infektionen, Traumata, verlängerte warme oder kalte ischämische Zeiten und fortgeschrittenes Alter ....

Protokoll

Sprague-Dawley-Ratten (300 g Körpergewicht) wurden kommerziell gewonnen und unter pathogenfreien Bedingungen in der Tiereinrichtung des Wexner Medical Center der Ohio State University untergebracht. Alle Verfahren wurden gemäß dem Leitfaden für die humane Pflege und Verwendung von Labortieren des NIH und des National Research Council und mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der Ohio State University (IACUC-Protokoll 2023A00000071) human durchgeführt.

1. PolyhHb-Synthese und -Reinigung

HINWEIS: Die Herstellung und Synthese des PolyhHb-Mate....

Diskussion

Die Entwicklung und Erprobung von Perfusionslösungen ist ein neuartiges Unterfangen, das viele Menschen auf der ganzen Welt in Angriff nehmen. Traditionell bieten Standardperfusate die Möglichkeit, die ischämische Zeit auszusetzen und die damit verbundenen Verletzungen mit Ischämie sowie Reperfusion zu mildern¹⁸. Die nächste Weiterentwicklung von EVLP besteht jedoch darin, die derzeitige Perfusattechnologie zu verbessern und Reparatur- und Rekonditionierungst.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle	B-D	309301
30 L Glass Batch Bioreactor	Ace Glass
30g Needle	Med Needles	BD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets	Elanco	NA
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O)	Sigma Aldrich	10035-04-8	For modified Ringer's lactate
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672	Harvard Apparatus	731747
Connect kit D150	Cole-Parmer	VK 73-3763
Dumont #5 Forceps	Fine Science tools	11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45°	Fine Science tools	11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Water Heater	Lauda	LCK 1879
Expired human leukoreduced, packed RBC units	Wexner Medical Center Canadian Blood Services Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150	Hugo Sachs Elektronik	PY2 73-3762
Forceps	Fine Science tools	11027-12
Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%)	Sigma Aldrich	111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito Hemostat	Roboz Surgical	RS-7112
Heparin 30,000 units per 30 ml	APP Pharmaceuticals
Human Serum Albumin (HSA)	OctaPharma Plasma		Perfusate additive
IL2 Tube set for perfusate	Harvard Apparatus	733842
IPL-2 Basic Lung Perfusion System	Harvard Apparatus
Ketamine 500 mg per 5 ml	JHP Pharmaceuticals
Left Atrium cannula	Harvard Apparatus	730712
Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor	3M	G420	gas contactor
low potassium dextran glucose solution (perfadex)	XVIVO		solution flushing the lung
Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24)	Cole-Palmer
N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S)	Sigma Aldrich	616-91-1 (A7250)	For modified Ringer's lactate
Nalgene Vessels (10L, 20L)	Nalgene		Filtration vessels
Peristaltic Pump	Ismatec	ISM 827B
PES, 0.65 µm TFF module	Repligen	N02-E65U-07-N
PhysioSuite	Kent Scientific Corporation	PS-MSTAT-RT
polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF module	Repligen	N02-S20U-05-N
Polysulfone (PS), 500 kDa TFF module	Repligen	N02-P500-05-N
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	7447-40-7	For PBS
PowerLab 8/35	ADInstruments	730045
Pulmonary Artery cannula	Harvard Apparatus	730710
Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24)	PharMed BPT
Puralube Ophthalmic Ointment	Dechra	NA
Scissors	Fine Science tools	14090-11
SCP Servo controller for perfusion type 704	Harvard Apparatus	732806
Small Animal Ventilator model 683	Harvard Apparatus	55-000
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	7647-14-5 (S271-10)	For PBS and saline
Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3)	Sigma Aldrich	25895-60-7
Sodium Dithionite (Na2S2O4)	Sigma Aldrich	7775-14-6
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	1310-73-2	For modified Ringer's lactate
Sodium Lactate (NaC3H5O3)	Sigma Aldrich	867-56-1	For modified Ringer's lactate
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Fisher Scientific	7558-79-4	For PBS
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Fisher Scientific	7558-80-7	For PBS
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SS-MVG-Module
Sprague-Dawley rats	Envigo
TAM-A transducer amplifier module type 705/1	Harvard Apparatus	73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2	Harvard Apparatus	73-1793
TCM time control module type 686	Harvard Apparatus	731750
Tracheal cannula	Harvard Apparatus	733557
Tube set for moist chamber	Harvard Apparatus	73V83157
Tubing Cassette	Cole-Parmer	IS 0649
Tweezer #5 Dumostar	Kent Scientific Corporation	INS500085-A
Tweezer #5 stainless steel, curved	Kent Scientific Corporation	IND500232
Tweezer #7 Titanium	Kent Scientific Corporation	INS600187
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID	Harvard Apparatus	721017	perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID	Harvard Apparatus	721019	perfusate line leaving lung
Vannas-Tubingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15008-08
VCM ventilator control module type 681	Harvard Apparatus	731741
William's E Media	Gibco, ThermoFisher Scientific	A12176-01	Perfusate additive
Xylazine 100 mg per 1 ml	Akorn