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Exploración de soluciones alternativas de perfusión utilizando portadores de oxígeno basados en hemoglobina polimerizada de próxima generación en un modelo de perfusión pulmonar ex vivo en ratas
* Estos autores han contribuido por igual
En este artículo
Resumen
Aquí, describimos la aplicación de un portador de oxígeno basado en hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusión y el protocolo en el que esta solución de perfusión se puede probar en un modelo de perfusión pulmonar ex vivo en ratas.
Resumen
El trasplante de pulmón se ve obstaculizado por la falta de donantes adecuados. Anteriormente, se descartaban los donantes que se consideraban marginales o inadecuados. Sin embargo, una tecnología nueva y emocionante, como la perfusión pulmonar ex vivo (EVLP), ofrece a los proveedores de trasplantes de pulmón una evaluación ampliada para los aloinjertos de donantes marginales. Esta plataforma de evaluación dinámica ha provocado un aumento del trasplante pulmonar y ha permitido a los proveedores utilizar donantes que antes se descartaban, ampliando así el grupo de donantes. Las técnicas de perfusión actuales utilizan perfusionados celulares o acelulares, y ambos tienen ventajas y desventajas distintas. La composición de la perfusión es fundamental para mantener un entorno homeostático, proporcionar un apoyo metabólico adecuado, disminuir la inflamación y la muerte celular y, en última instancia, mejorar la función de los órganos. Las soluciones de perfusión deben contener una concentración de proteínas suficiente para mantener una presión oncótica adecuada. Sin embargo, las soluciones de perfusión actuales a menudo conducen a la extravasación de líquido a través del endotelio pulmonar, lo que resulta en edema y daño pulmonar inadvertido. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevas soluciones de perfusión que eviten el daño excesivo mientras mantienen una homeostasis celular adecuada. Aquí, describimos la aplicación de un portador de oxígeno basado en hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusión y el protocolo en el que esta solución de perfusión se puede probar en un modelo de EVLP de rata. El objetivo de este estudio es proporcionar a la comunidad de trasplantes pulmonares información clave para el diseño y desarrollo de nuevas soluciones de perfusión, así como los protocolos adecuados para probarlas en modelos de trasplante traslacional clínicamente relevantes.
Introducción
Como cualquier campo en el trasplante de órganos sólidos, el trasplante de pulmón sufre de una escasez de órganos de donantes. Con el fin de aumentar el grupo de donantes, se han dedicado importantes investigaciones a investigar el potencial de los aloinjertos que antes se pensaba que no eran adecuados para el trasplante, es decir, los donantes de criterio extendido (ECD). Estos aloinjertos pueden considerarse ECD por una serie de razones, que incluyen calidad cuestionable, mala función, infección, traumatismo, tiempos isquémicos cálidos o fríos prolongados y edad avanzada 1,2....
Protocolo
Las ratas Sprague-Dawley (300 g de peso corporal) se obtuvieron comercialmente y se alojaron en condiciones libres de patógenos en el Centro Médico Wexner de la Universidad Estatal de Ohio. Todos los procedimientos se realizaron de manera humanitaria de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso Humanitario de Animales de Laboratorio de los NIH y el Consejo Nacional de Investigación y con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ohio (Protocolo IACUC 2023A00000071).
1. Síntesis y purificación de PolyhHb
NOTA: L....
Resultados Representativos
En la Figura 10 se demuestra la validación de nuestra perfusión basada en PolyhHb y, además, la estabilidad de esta perfusión durante varias horas. Durante la primera 1 h, todas las perfusionadas probadas (PolyhHb, Control (Williams Media + 5% HSA), basadas en RBC) mostraron una ligera disminución de LA pO2 (Post pO2). Sin embargo, la perfusión basada en glóbulos rojos mostró una disminución significativa a 1 h en comparación .......
Discusión
El desarrollo y las pruebas de soluciones de perfusión es un esfuerzo novedoso en el que se están embarcando muchas personas en todo el mundo. Tradicionalmente, las perfusiones estándar ofrecen la capacidad de suspender el tiempo isquémico y mitigar las lesiones asociadas a la isquemia, así como la reperfusión18. Sin embargo, la próxima evolución de la EVLP es mejorar la tecnología actual de perfusión, así como incorporar terapias de reparación y reaco.......
Divulgaciones
Para el material presentado en este trabajo, A.F.P., A.G. y C.C. son inventores en la solicitud de patente de EE. UU. PCT/US2022/041743. A.F.P., C.C., B.A.W. y S.M.B. son inventores en la solicitud de patente estadounidense PCT/US2023/017765.
Agradecimientos
Esta investigación fue generosamente apoyada por el Jewel and Frank Benson Family Endowment y la Cátedra de Investigación Jewel and Frank Benson. B.A.W. cuenta con el apoyo parcial de la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) R01HL143000. A.F.P. cuenta con el apoyo de las subvenciones de los NIH R01HL126945, R01EB021926, R01HL131720 y R01HL138116 y de la W81XWH1810059 de subvenciones del Comando de Investigación Médica y Material del Ejército de los EE. UU. S.M.B. cuenta con el apoyo de la DK123475 NIH R01.
....Materiales
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle | B-D | 309301 | |
| 30 L Glass Batch Bioreactor | Ace Glass | ||
| 30g Needle | Med Needles | BD-305106 | |
| Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets | Elanco | NA | |
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma Aldrich | 10035-04-8 | For modified Ringer's lactate |
| CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 | Harvard Apparatus | 731747 | |
| Connect kit D150 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11252-50 | |
| Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45° | Fine Science tools | 11253-25 | |
| Ecoline Star Edition 003, E100 Water Heater | Lauda | LCK 1879 | |
| Expired human leukoreduced, packed RBC units | Wexner Medical Center Canadian Blood Services Zen-Bio Inc | ||
| Fiberoxygenator D150 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
| Forceps | Fine Science tools | 11027-12 | |
| Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%) | Sigma Aldrich | 111-30-8 (G7776) | |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Roboz Surgical | RS-7112 | |
| Heparin 30,000 units per 30 ml | APP Pharmaceuticals | ||
| Human Serum Albumin (HSA) | OctaPharma Plasma | Perfusate additive | |
| IL2 Tube set for perfusate | Harvard Apparatus | 733842 | |
| IPL-2 Basic Lung Perfusion System | Harvard Apparatus | ||
| Ketamine 500 mg per 5 ml | JHP Pharmaceuticals | ||
| Left Atrium cannula | Harvard Apparatus | 730712 | |
| Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor | 3M | G420 | gas contactor |
| low potassium dextran glucose solution (perfadex) | XVIVO | solution flushing the lung | |
| Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24) | Cole-Palmer | ||
| N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S) | Sigma Aldrich | 616-91-1 (A7250) | For modified Ringer's lactate |
| Nalgene Vessels (10L, 20L) | Nalgene | Filtration vessels | |
| Peristaltic Pump | Ismatec | ISM 827B | |
| PES, 0.65 µm TFF module | Repligen | N02-E65U-07-N | |
| PhysioSuite | Kent Scientific Corporation | PS-MSTAT-RT | |
| polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF module | Repligen | N02-S20U-05-N | |
| Polysulfone (PS), 500 kDa TFF module | Repligen | N02-P500-05-N | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For PBS |
| PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
| Pulmonary Artery cannula | Harvard Apparatus | 730710 | |
| Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24) | PharMed BPT | ||
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | NA | |
| Scissors | Fine Science tools | 14090-11 | |
| SCP Servo controller for perfusion type 704 | Harvard Apparatus | 732806 | |
| Small Animal Ventilator model 683 | Harvard Apparatus | 55-000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 7647-14-5 (S271-10) | For PBS and saline |
| Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3) | Sigma Aldrich | 25895-60-7 | |
| Sodium Dithionite (Na2S2O4) | Sigma Aldrich | 7775-14-6 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | 1310-73-2 | For modified Ringer's lactate |
| Sodium Lactate (NaC3H5O3) | Sigma Aldrich | 867-56-1 | For modified Ringer's lactate |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | 7558-79-4 | For PBS |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Fisher Scientific | 7558-80-7 | For PBS |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-MVG-Module | |
| Sprague-Dawley rats | Envigo | ||
| TAM-A transducer amplifier module type 705/1 | Harvard Apparatus | 73-0065 | |
| TAM-D transducer amplifier type 705/2 | Harvard Apparatus | 73-1793 | |
| TCM time control module type 686 | Harvard Apparatus | 731750 | |
| Tracheal cannula | Harvard Apparatus | 733557 | |
| Tube set for moist chamber | Harvard Apparatus | 73V83157 | |
| Tubing Cassette | Cole-Parmer | IS 0649 | |
| Tweezer #5 Dumostar | Kent Scientific Corporation | INS500085-A | |
| Tweezer #5 stainless steel, curved | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
| Tweezer #7 Titanium | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
| Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID | Harvard Apparatus | 721017 | perfusate line entering lung |
| Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID | Harvard Apparatus | 721019 | perfusate line leaving lung |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| VCM ventilator control module type 681 | Harvard Apparatus | 731741 | |
| William's E Media | Gibco, ThermoFisher Scientific | A12176-01 | Perfusate additive |
| Xylazine 100 mg per 1 ml | Akorn |
Referencias
- Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2021 annual data report: Lung. Am J Transplant. 23, S379-S442 (2023).
- Gouchoe, D. A., et al. Ex vivo l....
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