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Resumen

Aquí, describimos la aplicación de un portador de oxígeno basado en hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusión y el protocolo en el que esta solución de perfusión se puede probar en un modelo de perfusión pulmonar ex vivo en ratas.

Resumen

El trasplante de pulmón se ve obstaculizado por la falta de donantes adecuados. Anteriormente, se descartaban los donantes que se consideraban marginales o inadecuados. Sin embargo, una tecnología nueva y emocionante, como la perfusión pulmonar ex vivo (EVLP), ofrece a los proveedores de trasplantes de pulmón una evaluación ampliada para los aloinjertos de donantes marginales. Esta plataforma de evaluación dinámica ha provocado un aumento del trasplante pulmonar y ha permitido a los proveedores utilizar donantes que antes se descartaban, ampliando así el grupo de donantes. Las técnicas de perfusión actuales utilizan perfusionados celulares o acelulares, y ambos tienen ventajas y desventajas distintas. La composición de la perfusión es fundamental para mantener un entorno homeostático, proporcionar un apoyo metabólico adecuado, disminuir la inflamación y la muerte celular y, en última instancia, mejorar la función de los órganos. Las soluciones de perfusión deben contener una concentración de proteínas suficiente para mantener una presión oncótica adecuada. Sin embargo, las soluciones de perfusión actuales a menudo conducen a la extravasación de líquido a través del endotelio pulmonar, lo que resulta en edema y daño pulmonar inadvertido. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevas soluciones de perfusión que eviten el daño excesivo mientras mantienen una homeostasis celular adecuada. Aquí, describimos la aplicación de un portador de oxígeno basado en hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb) como perfusión y el protocolo en el que esta solución de perfusión se puede probar en un modelo de EVLP de rata. El objetivo de este estudio es proporcionar a la comunidad de trasplantes pulmonares información clave para el diseño y desarrollo de nuevas soluciones de perfusión, así como los protocolos adecuados para probarlas en modelos de trasplante traslacional clínicamente relevantes.

Introducción

Como cualquier campo en el trasplante de órganos sólidos, el trasplante de pulmón sufre de una escasez de órganos de donantes. Con el fin de aumentar el grupo de donantes, se han dedicado importantes investigaciones a investigar el potencial de los aloinjertos que antes se pensaba que no eran adecuados para el trasplante, es decir, los donantes de criterio extendido (ECD). Estos aloinjertos pueden considerarse ECD por una serie de razones, que incluyen calidad cuestionable, mala función, infección, traumatismo, tiempos isquémicos cálidos o fríos prolongados y edad avanzada 1,2. En ciertos casos, en los que estos pulmones son adecuados para el trasplante inmediato3, a menudo es ventajoso tanto para los proveedores como para los receptores evaluar estos pulmones durante un tiempo adicional para determinar su idoneidad para el trasplante. La perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) es una tecnología que permite una evaluación ampliada de posibles aloinjertos pulmonares en un circuito cerrado fuera del donante 2,4,5,6,7, lo que permite al proveedor del trasplante determinar la idoneidad del trasplante. La EVLP ha demostrado la capacidad de evaluar adecuadamente los órganos del donante 8,9,10,11, disminuir los efectos de la lesión por reperfusión isquémica (IRI)12,13 y aumentar el número de donantes14,15, lo que hace que el trasplante pulmonar sea un tratamiento más accesible para todos.

En general, un sistema EVLP es un sistema cerrado con un circuito ventilatorio (que se logra conectando un ventilador a la tráquea para introducir aire en el sistema) y un circuito vascular (que se logra conectando la aurícula izquierda (AI) a la arteria pulmonar (AP) con tubos)7. El circuito vascular tiene perfusión que corre a través del tubo para proporcionar al pulmón nutrientes vitales y oxígeno, al tiempo que limita el tiempo de isquemia fría (TCE)5,8,16,17. Esta solución es de base sanguínea (es decir, a través de la adición de glóbulos rojos empaquetados (PRBC))16,17 o de base acelular (es decir, sin PRBC)4,5. Sin embargo, existen varias desventajas notables en el uso de PRBC. Si se utilizan PRBC de donantes que murieron por traumatismo o donantes con muerte cerebral (BDD), estos fluidos a menudo contienen grandes cantidades de citocinas inflamatorias, lo que puede aumentar el daño celular durante la EVLP, así como aumentar los niveles de hemoglobina libre de células (Hb), hemo, hierro y fragmentos celulares que causan daño adicional a las células18,19. Además, dado que estos donantes suelen ser multiorgánicos, la recolección de PRBC antes de la obtención podría conducir a una disminución del volumen sanguíneo en el donante y, posteriormente, a un aumento de la isquemia en todos los órganos. Si se utilizan PRBC de otra fuente, los proveedores podrían enfrentar escasez de sangre, ya que este es un material escaso en sí mismo20,21. Por último, los PRBC son propensos a la lisis mecánica en el circuito EVLP, independientemente de su fuente, liberando Hb y otros componentes que contribuyen al daño celular.

Por lo tanto, por muchas razones, podría ser ventajoso utilizar un sustituto artificial de glóbulos rojos, es decir, portadores de oxígeno basados en hemoglobina (HBOC), como suplemento de perfusión. Un HBOC particularmente prometedor es la hemoglobina humana polimerizada (PolyhHb). La poliHHb se sintetiza a partir de Hb purificada a partir de PRBC caducados que se consideraron inadecuados para la transfusión inmediata22. Se ha demostrado que son sustitutos viables de la sangre en el shock hemorrágico23 y en el trasplante24 y pueden producirse en grandes cantidades22. Sin embargo, la adopción a gran escala de PolyhHb no ha tenido éxito debido a complicaciones imprevistas como vasoconstricción, aumento de la presión arterial y paro cardíaco23,25. Las razones detrás de estos hallazgos probablemente se debieron a la presencia de Hb libre de células o polímeros de Hb de bajo peso molecular (< 500 kDa) en la solución de PolyhHb, ya que tienen una propensión a extravasarse al espacio tisular, lo que resultó en una disminución de la disponibilidad de óxido nítrico, vasoconstricción posterior, hipertensión sistémica y, finalmente, lesión oxidativa del tejido26,27. Para mejorar estos problemas, el Laboratorio Palmer ha trabajado en el desarrollo de una nueva generación de PolyhHb que contiene un mínimo de especies de bajo MW y Hb libre de células, que ha demostrado mejores características biofísicas y respuestas in vivo 22,28,29,30. Varios estudios de transfusión en animales han demostrado que si se eliminan los polímeros de Hb de bajo peso molecular del HBOC, se pueden mitigar la vasoconstricción, la hipertensión sistémica y el daño oxidativo 28,29,31,32,33,34,35. Por lo tanto, esto convierte a este PolyhHb de próxima generación en un candidato prometedor para perfundir.

Aquí, describimos la aplicación de un PolyhHb de próxima generación para ser utilizado en una perfusión y el protocolo por el cual esta solución de perfusión puede ser probada en un modelo de EVLP de rata. El objetivo de este estudio es proporcionar a la comunidad de trasplantes pulmonares información clave para el diseño y desarrollo de nuevas soluciones de perfusión, así como proporcionar protocolos para probarlas en modelos de trasplante traslacional clínicamente relevantes.

Protocolo

Las ratas Sprague-Dawley (300 g de peso corporal) se obtuvieron comercialmente y se alojaron en condiciones libres de patógenos en el Centro Médico Wexner de la Universidad Estatal de Ohio. Todos los procedimientos se realizaron de manera humanitaria de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso Humanitario de Animales de Laboratorio de los NIH y el Consejo Nacional de Investigación y con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ohio (Protocolo IACUC 2023A00000071).

1. Síntesis y purificación de PolyhHb

NOTA: La producción y síntesis del material PolyhHb que se utilizó para los siguientes experimentos de EVLP fueron publicadas inicialmente por Cuddington et al. en 202022. Consulte este trabajo para obtener esquemas y análisis detallados de la síntesis de PolyhHb. A continuación se presenta un resumen de la síntesis y purificación de PolyhHb a escala piloto y su posterior preparación como perfusión.

  1. Lavado, lisis y purificación de Hb de glóbulos rojos
    1. Adquiera 18 unidades de PRBC humanos caducados y viértalas en un recipiente de filtración de 20 L, diluido con solución salina al 0,9% en peso hasta obtener un hematocrito final del 22% (Figura 1B, C).
    2. Realice seis intercambios de volumen del sistema (diaciclos) en un módulo de filtración de flujo tangencial (TFF) de polietileno sulfona (mPES) modificado de 0,65 μm con solución salina al 0,9 % en peso en la solución RBC. NOTA: El propósito de este paso de lavado es eliminar los glóbulos rojos dañados, los fragmentos de membrana y otros materiales extracelulares antes de la hemólisis (Figura 1B, C).
    3. Lisar la solución de RBC con 10 L de tampón fosfato (PB, 3,75 mM, pH 7,4) durante 1 h a 4 °C con agitación constante.
    4. Elimine los fragmentos de membrana lisada y otros agregados filtrando la solución sobre un módulo TFF de 500 kDa y recolectando el permeado en la vasija del reactor discontinuo de 30 L (Figura 1A-C).
    5. Una vez que haya 480 g de Hb en el reactor, agregue una carga de sal para convertir el PB en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    6. Recircule la Hb a través de un contactor de gas alimentado con nitrógeno, además de mantener un espacio de cabeza de nitrógeno en el reactor, para desoxigenar la proteína durante la noche. Enfriar a 14 °C para limitar la formación de metahemoglobina (metHb).
  2. Polimerización de Hb
    1. Calentar la solución de Hb a la temperatura fisiológica (37 °C) mientras se recircula la solución en un circuito contactor de gas.
      NOTA: El objetivo es desoxigenar la proteína a unapO2 entre 0-10 mmHg para asegurar que la mayor parte de la Hb esté en el estado cuaternario tenso (Figura 1A).
    2. Agregue 1 g de carga de ditionita de sodio, según sea necesario, para garantizar una desoxigenación efectiva.
    3. Mientras se mantiene el circuito de recirculación y se desgasifica la solución de Hb, se añade una proporción molar de 30:1 de glutaraldehído (GA) a Hb diluido en 3 L de PBS desoxigenado (pH 7,4).
    4. Agregue la solución a la vasija del reactor durante 3 h con una hora adicional de tiempo de reacción.
    5. Apague la reacción de reticulación con una proporción molar de 7:1 de cianoborohidruro de sodio a GA, diluido en 3 L de PBS (pH 7,4). Añadir al reactor durante más de 10 min.
    6. Enfriar el reactor a 14 °C durante la noche.
  3. Purificación de PolyhHb
    1. Bombee el contenido del reactor a un recipiente de filtración de 10 L y comience la circulación a través de un módulo TFF de polietileno sulfona (PES) de 0,2 μm (Etapa 1). Este paso eliminará los agregados grandes y los contaminantes no deseados.
    2. Alimente el permeado en un recipiente de filtración secundario de 10 L que circulará sobre un módulo TFF de polisulfona (PS) de 500 kDa (Etapa 2) una vez lleno. Continúe hasta que se vacíe el reactor (Figura 1B, D).
    3. Una vez que el reactor se vacía en el circuito de purificación, inicie el intercambio de excipientes en la Etapa 1 con una solución de Ringer lactato modificada (pH 7.4). Después de cada intercambio de volumen completo, mida la concentración de proteínas en el permeado de la Etapa 1 utilizando espectroscopía UV-visible.
    4. Cuando el permeado de la Etapa 1 tenga una concentración de menos de 1 mg Hb/mL, transfiera la solución de Ringer modificada a la Etapa 2. Cualquier retención en la Etapa 1 es un desperdicio y debe eliminarse de manera adecuada. En total, asegúrese de que se realicen 12 intercambios de volumen completo de la solución modificada del Ringer en ambas etapas.
    5. Una vez finalizados los diaciclos, concentre el contenido de la Etapa 2 en al menos 10 g/dL en el módulo TFF de 500 kDa.
    6. Envasar la solución concentrada en tubos cónicos de 50 mL y almacenar a -80 °C hasta su uso.

2. Formulación perfumada

  1. Prepare la perfusión hasta un volumen final de 165 mL. Diluya PolyhHb hasta una concentración final de 3,7 g/dL con William's E Medium.
  2. Añadir albúmina sérica humana (HSA) hasta una concentración final de 3% de HSA en peso. Agregue 1 mL de heparina a la solución final.

3. Configuración del circuito de perfusión pulmonar ex vivo

  1. Coloque la perfusión de PolyhHb en el depósito del circuito EVLP y abra el baño de agua tibia a 37 °C. Asegúrese de que la perfusión circule dentro del circuito encendiendo las bombas de rodillos.
  2. Conecte el gas de desoxigenación (es decir, 6% de O2, 8% de CO2, 84% de N2) al oxigenador de fibra hueca para desoxigenar la perfusión. Esto se hace para evaluar la capacidad del pulmón para oxigenar la perfusión.
  3. Abra el software de adquisición de datos en una computadora cercana. Asegúrese de que la presión de la arteria pulmonar, la presión diferencial traqueal, la presión diferencial del flujo respiratorio, el peso pulmonar y los transductores de velocidad de la bomba estén conectados tanto al circuito como a la caja convertidora de datos.
  4. Asegúrese de que no haya fugas en todo el sistema examinando cuidadosamente todas las conexiones de los tubos y que el agua caliente circule por todas partes (Figura 2). Presione Ejecutar en el software de adquisición de datos para asegurarse de que todos los transductores de presión estén funcionando. Una vez que el sistema funcione correctamente, apague las bombas de rodillos.

4. Obtención de un bloque pulmonar de rata donante

  1. Coloque la mesa quirúrgica y coloque los instrumentos (Figura 3). Autoclave todos los instrumentos a 121 °C durante 30 min.
  2. Preparar 1200 U/kg de heparina, una mezcla de ketamina y xilacina anestésica (60 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg), así como suturas de seda de 5-10 cm de largo (3-0 o 4-0).
  3. Inyecte la solución de ketamina/xilacina por vía intraperitoneal en la rata. Espere de 5 a 10 minutos para que se desarrolle el plano anestésico. Para asegurar un nivel adecuado de anestesia, pellizca la rata con los dedos de los pies para provocar una reacción. Si no hay reacción, entonces se ha alcanzado el nivel adecuado de anestesia.
  4. Afeitar el abdomen de la rata y colocarla en posición supina sobre la tabla quirúrgica. Limpiar el abdomen con povidona yodada y etanol al 70%. Coloque ungüento oftálmico debajo de los ojos de la rata para prevenir la sequedad.
  5. Mueva la rata a la tabla quirúrgica y asegúrela en su lugar (Figura 4A). Encienda el software de adquisición de datos y comience a grabar. Encienda el ventilador a 4 mL/kg y asegúrese de que la presión positiva al final de la espiración (PEEP) esté en torno a los 2 cm/H2O.
    NOTA: Estos ajustes iniciales son específicos del experimento. Corresponde a todos los investigadores determinar las mejores estrategias ventilatorias para los experimentos individuales.
  6. Una vez que se alcanza la profundidad anestésica adecuada, realice una laparotomía de línea media desde el proceso xifoides hasta la sínfisis púbica con un par de tijeras. A continuación, realizar una rotación visceral medial-lateral y visualizar la vena cava inferior infrahepática mediante un instrumento contundente (VCI)36,37,38 (Figura 4B). Inyecte heparina en la VCI con una aguja de 20 g (Figura 4C).
  7. Dirige la atención al cuello y corta la piel desde la muesca esternal hasta justo debajo del ángulo de la mandíbula con unas tijeras. A continuación, comience a diseccionar hacia la tráquea (Figura 5A).
  8. En el cuello, diseccione sin rodeos los músculos de la correa necesarios para exponer la tráquea (Figura 5B). Haga una incisión transversal con un par de tijeras en la tráquea anterior entre los anillos cartilaginosos lo suficientemente grandes para el tubo endotraqueal (ET) (varios milímetros), pero no corte a través de la porción posterior de la tráquea. Coloque una sutura de seda 5-0 alrededor de la tráquea (Figura 5C).
  9. Inserte el tubo endotraqueal y asegúrelo en su lugar con la sutura de seda 5-0 antes mencionada (Figura 5D). Conecte el tubo endotraqueal al ventilador y asegúrese de que el tórax se eleve correctamente.
  10. Realizar una esternotomía mediana y volver a entrar en la cavidad torácica con unas tijeras. Coloque retractores de la pared torácica para exponer el corazón y los pulmones (figura 6A). Evite cualquier manipulación inadvertida de los pulmones, ya que son increíblemente friables.
  11. Extirpar el timo del mediastino anterior mediante una combinación de disecciones afiladas (tijeras) y romas. Tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos grandes o los pulmones.
  12. Identificar la arteria pulmonar (AP; Figura 6B) y coloque una sutura de seda 5-0 a su alrededor para prepararse para la canulación (Figura 6C). Debido a la anatomía microscópica de los grandes vasos de la rata, a menudo es más fácil colocar la sutura alrededor de la PA y la aorta al mismo tiempo.
  13. Realizar una incisión de 2-3 mm en la vía de salida del ventrículo derecho (TSVD) con unas tijeras (Figura 6D-E) para colocar la cánula arterial dentro de la AP y asegurarla con la sutura 5-0 descrita un paso antes (Figura 6F).
  14. Realice una incisión de 5 mm en el ventrículo izquierdo (VI) y en la VCI infrahepática con unas tijeras para aplicar la eutanasia a la rata. Conecte rápidamente el líquido de preservación pulmonar a la cánula arterial para lavar los pulmones por gravedad con aproximadamente 20 mL (Figura 7A-B). Asegúrese de que el líquido de preservación pulmonar se desairee antes de conectarlo a la cánula arterial, ya que los émbolos aéreos son muy dañinos para los pulmones.
  15. Conecte la cánula arterial al circuito EVLP. Encienda la bomba de rodillo y permita que una pequeña cantidad de perfusión fluya a través del pulmón y salga del ventrículo izquierdo hacia la cavidad torácica. Una vez que la perfusión comience a fluir fuera de la aurícula izquierda, apague la bomba de rodillo (Figura 7C). Al mismo tiempo que permite que fluya la perfusión, asegúrese de que la presión de PA no aumente, lo que indicaría un bloqueo o una ubicación incorrecta.
  16. Coloque pinzas pequeñas en el ventrículo izquierdo y estire suavemente el anillo de la válvula mitral, lo que permitirá la introducción de la cánula de la aurícula izquierda (AI) (Figura 8A). Coloque una corbata de seda 5-0 alrededor del corazón y átela sin apretar (Figura 8B).
  17. Inserte la cánula LA en el ventrículo izquierdo y avance la cánula AI hasta que se pueda ver dentro de la aurícula. Termine de asegurar el AI con la sutura 5-0 preatada (Figura 8C).
  18. Identifique el esófago y sujételo con un hemostático lo más cerca posible del diafragma. Corte el esófago por debajo del hemostático para asegurarse de que no haya derrames en la cavidad torácica (Figura 9A).
  19. Usando la columna vertebral como guía, corte todas las uniones ligamentosas que conectan el bloqueo corazón-pulmón con las estructuras circundantes con un par de tijeras (Figura 9B). Una vez que el bloqueo corazón-pulmón se haya movido libremente, diseccione la tráquea desde el cuello y, finalmente, corte la tráquea por encima del tubo endotraqueal con unas tijeras para liberar el bloqueo corazón-pulmón (Figura 9C).
  20. Mueva el bloqueo corazón-pulmón a la cubierta torácica dentro del circuito EVLP y conecte la cánula LA al circuito EVLP (Figura 9D). Encienda la bomba de rodillos y conecte el monitor del ventilador.
  21. Revise la trampa de burbujas para asegurarse de que no se introduzcan émbolos de aire en el sistema.
  22. Cambie lentamente los ajustes de ventilación y perfusión a los niveles experimentales deseados durante los 15 minutos iniciales 36,37,38. Además, durante esta fase inicial de aceleración, aumente el caudal de perfusión hasta la tasa y/o presión deseadas.
  23. En los puntos de tiempo designados por el experimento, verifique los niveles de gas de perfusión, así como las pruebas de función pulmonar.

Resultados

En la Figura 10 se demuestra la validación de nuestra perfusión basada en PolyhHb y, además, la estabilidad de esta perfusión durante varias horas. Durante la primera 1 h, todas las perfusionadas probadas (PolyhHb, Control (Williams Media + 5% HSA), basadas en RBC) mostraron una ligera disminución de LA pO2 (Post pO2). Sin embargo, la perfusión basada en glóbulos rojos mostró una disminución significativa a 1 h en comparación ...

Discusión

El desarrollo y las pruebas de soluciones de perfusión es un esfuerzo novedoso en el que se están embarcando muchas personas en todo el mundo. Tradicionalmente, las perfusiones estándar ofrecen la capacidad de suspender el tiempo isquémico y mitigar las lesiones asociadas a la isquemia, así como la reperfusión18. Sin embargo, la próxima evolución de la EVLP es mejorar la tecnología actual de perfusión, así como incorporar terapias de reparación y reaco...

Divulgaciones

Para el material presentado en este trabajo, A.F.P., A.G. y C.C. son inventores en la solicitud de patente de EE. UU. PCT/US2022/041743. A.F.P., C.C., B.A.W. y S.M.B. son inventores en la solicitud de patente estadounidense PCT/US2023/017765.

Agradecimientos

Esta investigación fue generosamente apoyada por el Jewel and Frank Benson Family Endowment y la Cátedra de Investigación Jewel and Frank Benson. B.A.W. cuenta con el apoyo parcial de la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) R01HL143000. A.F.P. cuenta con el apoyo de las subvenciones de los NIH R01HL126945, R01EB021926, R01HL131720 y R01HL138116 y de la W81XWH1810059 de subvenciones del Comando de Investigación Médica y Material del Ejército de los EE. UU. S.M.B. cuenta con el apoyo de la DK123475 NIH R01.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needleB-D309301
30 L Glass Batch BioreactorAce Glass
30g NeedleMed NeedlesBD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial TabletsElancoNA
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O)Sigma Aldrich10035-04-8For modified Ringer's lactate
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672Harvard Apparatus731747
Connect kit D150Cole-Parmer VK 73-3763
Dumont #5 ForcepsFine Science tools11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45°Fine Science tools11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Water HeaterLaudaLCK 1879
Expired human leukoreduced, packed RBC unitsWexner Medical Center
Canadian Blood Services
Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150Hugo Sachs ElektronikPY2 73-3762
ForcepsFine Science tools11027-12
Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%)Sigma Aldrich111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito HemostatRoboz SurgicalRS-7112
Heparin 30,000 units per 30 mlAPP Pharmaceuticals
Human Serum Albumin (HSA)OctaPharma PlasmaPerfusate additive
IL2 Tube set for perfusateHarvard Apparatus733842
IPL-2 Basic Lung Perfusion SystemHarvard Apparatus
Ketamine 500 mg per 5 mlJHP Pharmaceuticals
Left Atrium cannulaHarvard Apparatus730712
Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor3MG420gas contactor
low potassium dextran glucose solution (perfadex)XVIVOsolution flushing the lung
Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24)Cole-Palmer
N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S)Sigma Aldrich616-91-1 (A7250)For modified Ringer's lactate
Nalgene Vessels (10L, 20L)NalgeneFiltration vessels
Peristaltic Pump Ismatec ISM 827B
PES, 0.65 µm TFF moduleRepligenN02-E65U-07-N
PhysioSuiteKent Scientific CorporationPS-MSTAT-RT
polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF moduleRepligenN02-S20U-05-N
Polysulfone (PS), 500 kDa TFF moduleRepligenN02-P500-05-N
Potassium Chloride (KCl)Fisher Scientific7447-40-7For PBS
PowerLab 8/35 ADInstruments730045
Pulmonary Artery cannulaHarvard Apparatus730710
Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24)PharMed BPT
Puralube Ophthalmic OintmentDechraNA
ScissorsFine Science tools14090-11
SCP Servo controller for perfusion type 704Harvard Apparatus732806
Small Animal Ventilator model 683Harvard Apparatus55-000
Sodium Chloride (NaCl)Fisher Scientific7647-14-5 (S271-10)For PBS and saline
Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3)Sigma Aldrich25895-60-7
Sodium Dithionite (Na2S2O4)Sigma Aldrich7775-14-6
Sodium Hydroxide (NaOH)Fisher Scientific1310-73-2For modified Ringer's lactate
Sodium Lactate (NaC3H5O3)Sigma Aldrich867-56-1For modified Ringer's lactate
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)Fisher Scientific7558-79-4For PBS
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Fisher Scientific7558-80-7For PBS
SomnoSuite Small Animal Anesthesia SystemKent Scientific CorporationSS-MVG-Module
Sprague-Dawley ratsEnvigo
TAM-A transducer amplifier module type 705/1Harvard Apparatus73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2Harvard Apparatus 73-1793
TCM time control module type 686Harvard Apparatus731750
Tracheal cannulaHarvard Apparatus733557
Tube set for moist chamberHarvard Apparatus 73V83157
Tubing CassetteCole-ParmerIS 0649
Tweezer #5 DumostarKent Scientific Corporation INS500085-A
Tweezer #5 stainless steel, curvedKent Scientific CorporationIND500232
Tweezer #7 TitaniumKent Scientific Corporation INS600187
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm IDHarvard Apparatus721017perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm IDHarvard Apparatus721019perfusate line leaving lung
Vannas-Tubingen Spring ScissorsFine Science Tools15008-08
VCM ventilator control module type 681Harvard Apparatus731741
William's E MediaGibco, ThermoFisher ScientificA12176-01Perfusate additive
Xylazine 100 mg per 1 mlAkorn

Referencias

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