Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, polimerize insan hemoglobin (PolyhHb) bazlı bir oksijen taşıyıcısının bir perfüzat olarak uygulanmasını ve bu perfüzyon çözeltisinin bir sıçan ex vivo akciğer perfüzyonu modelinde test edilebileceği protokolü açıklıyoruz.

Özet

Akciğer nakli, uygun donör eksikliği nedeniyle engellenir. Daha önce marjinal veya yetersiz olduğu düşünülen bağışçılar atılıyordu. Bununla birlikte, ex vivo akciğer perfüzyonu (EVLP) gibi yeni ve heyecan verici teknoloji, akciğer nakli sağlayıcılarına marjinal donör allogreftleri için genişletilmiş bir değerlendirme sunmaktadır. Bu dinamik değerlendirme platformu, akciğer naklinde bir artışa yol açmış ve sağlayıcıların daha önce atılan donörleri kullanmasına izin vererek donör havuzunu genişletmiştir. Mevcut perfüzyon teknikleri, hücresel veya aselüler perfüzatları kullanır ve her ikisinin de belirgin avantajları ve dezavantajları vardır. Perfüzyon bileşimi, homeostatik bir ortamın korunması, yeterli metabolik destek sağlanması, iltihabın ve hücresel ölümün azaltılması ve nihayetinde organ fonksiyonunun iyileştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Perfüzyon çözeltileri, uygun onkotik basıncı korumak için yeterli protein konsantrasyonu içermelidir. Bununla birlikte, mevcut perfüzyon solüsyonları sıklıkla pulmoner endotel yoluyla sıvı ekstravazasyonuna yol açarak yanlışlıkla pulmoner ödem ve hasara neden olur. Bu nedenle, uygun hücresel homeostazı korurken aşırı hasarı önleyen yeni perfüzyon solüsyonları geliştirmek gereklidir. Burada, polimerize insan hemoglobin (PolyhHb) bazlı bir oksijen taşıyıcısının bir perfüzat olarak uygulanmasını ve bu perfüzyon çözeltisinin bir sıçan EVLP modelinde test edilebileceği protokolü açıklıyoruz. Bu çalışmanın amacı, akciğer nakli topluluğuna yeni perfüzyon solüsyonlarının tasarlanması ve geliştirilmesinde temel bilgilerin yanı sıra bunları klinik olarak ilgili translasyonel nakil modellerinde test etmek için uygun protokolleri sağlamaktır.

Giriş

Katı organ naklindeki herhangi bir alan gibi, akciğer nakli de donör organ sıkıntısından muzdariptir. Donör havuzunu artırmak için, bir zamanlar transplantasyon için uygun olmadığı düşünülen allogreftlerin, yani genişletilmiş kriterli donörlerin (ECD) potansiyelini araştırmaya önemli araştırmalar yapılmıştır. Bu allogreftler, şüpheli kalite, kötü fonksiyon, enfeksiyon, travma, uzun süreli sıcak veya soğuk iskemik zamanlar ve ileri yaş 1,2 gibi çeşitli nedenlerle ECD olarak kabul edilebilir. Bu akciğerlerin acil nakil3 için uygun olduğu bazı durumlarda, nakil için uygunluklarını belirlemek için bu akciğerleri ek bir süre değerlendirmek hem sağlayıcılar hem de alıcılar için genellikle avantajlıdır. Ex vivo akciğer perfüzyonu (EVLP), donör 2,4,5,6,7 dışındaki kapalı bir devrede potansiyel akciğer allogreftlerinin genişletilmiş değerlendirmesine izin veren ve nakil sağlayıcısına nakil uygunluğunu belirleme yeteneği veren bir teknolojidir. EVLP, donör organları 8,9,10,11 yeterince değerlendirme, iskemik reperfüzyon hasarının (IRI)12,13 etkilerini azaltma ve donör havuzunuartırma 14,15 yeteneğini göstermiştir, böylece akciğer naklini herkes için daha erişilebilir bir tedavi haline getirmiştir.

Genel olarak, bir EVLP sistemi, bir ventilasyon devresi (sisteme hava vermek için trakeaya bir ventilatör bağlanarak elde edilir) ve bir vasküler devre (sol atriyumun (LA) pulmoner artere (PA) boru ile bağlanmasıyla elde edilir) kapalı bir sistemdir7. Vasküler devre, soğuk iskemik zamanı (CIT) sınırlarken akciğere hayati besinler ve oksijen vermek için borudan geçen perfüzata sahiptir5,8,16,17. Bu çözelti ya kan bazlıdır (ör., paketlenmiş kırmızı kan hücrelerinin eklenmesi yoluyla (PRBC'ler))16,17 ya da hücre bazlıdır (ör., PRBC'ler yok)4,5. Bununla birlikte, PRBC'leri kullanmanın birkaç önemli dezavantajı vardır. Travmadan ölen donörlerden veya beyin ölümü gerçekleşen donörlerden (BDD) PRBC'ler kullanılıyorsa, bu sıvılar genellikle büyük miktarlarda inflamatuar sitokin içerir, bu da EVLP sırasında hücresel hasarı artırabilir ve ayrıca hücresiz hemoglobin (Hb), heme, demir ve hücrelere ek hasar veren hücre fragmanlarının seviyelerini artırabilir18,19. Ayrıca, bu donörler genellikle çok organlı olduğundan, tedarikten önce PRBC'lerin toplanması, donördeki kan hacminin azalmasına ve ardından tüm organlarda iskeminin artmasına neden olabilir. PRBC'leri başka bir kaynaktan kullanıyorsanız, sağlayıcılar kan kıtlığı ile karşı karşıya kalabilir, çünkü bu kendi başına kıt bir malzemedir20,21. Son olarak, PRBC'ler, kaynaklarından bağımsız olarak EVLP devresinde mekanik parçalanmaya eğilimlidir ve Hb ve hücresel hasara katkıda bulunan diğer bileşenleri serbest bırakır.

Bu nedenle, birçok nedenden dolayı, yapay bir kırmızı kan hücresi ikamesi, yani hemoglobin bazlı oksijen taşıyıcıları (HBOC'ler) bir perfüzat takviyesi olarak kullanmak avantajlı olabilir. Özellikle umut verici bir HBOC, polimerize insan hemoglobinidir (PolyhHb). PolihHb, hemen transfüzyon için uygun olmadığı düşünülen süresi dolmuş PRBC'lerden saflaştırılmış Hb'den sentezlenir22. Hemorajik şok23 ve transplantasyon24'te canlı kan ikameleri oldukları ve büyük miktarlarda üretilebildiklerigösterilmiştir 22. Bununla birlikte, vazokonstriksiyon, artan kan basıncı ve kalp durması gibi öngörülemeyen komplikasyonlar nedeniyle PolyhHb'nin geniş çaplı benimsenmesi başarısız olmuştur23,25. Bu bulguların arkasındaki nedenler muhtemelen PolyhHb çözeltisinde hücresiz Hb veya düşük moleküler ağırlıklı Hb polimerlerinin (500 kDa'dan <) varlığından kaynaklanıyordu, çünkü bunlar doku boşluğuna ekstravaze olma eğilimindedir, bu da nitrik oksit mevcudiyetinin azalmasına, müteakip vazokonstriksiyona, sistemik hipertansiyona ve nihayetinde oksidatif doku hasarına neden olmuştur26,27. Bu sorunları iyileştirmek için Palmer Laboratuvarı, minimum düşük MW türleri ve hücresiz Hb içeren, gelişmiş biyofiziksel özellikler ve in vivo yanıtlar gösteren yeni nesil bir PolyhHb geliştirmek için çalıştı 22,28,29,30. Hayvanlarda yapılan çeşitli transfüzyon çalışmaları, düşük moleküler ağırlıklı Hb polimerlerinin HBOC'den elimine edilmesi durumunda vazokonstriksiyon, sistemik hipertansiyon ve oksidatif hasarın hafifletilebileceğini göstermiştir 28,29,31,32,33,34,35. Bu nedenle, bu yeni nesil PolyhHb'yi umut verici bir perfüzat adayı haline getiriyor.

Burada, bir perfüzatta kullanılacak yeni nesil bir PolyhHb'nin uygulamasını ve bu perfüzyon solüsyonunun bir sıçan EVLP modelinde test edilebileceği protokolü açıklıyoruz. Bu çalışmanın amacı, akciğer nakli topluluğuna yeni perfüzyon solüsyonları tasarlama ve geliştirme konusunda temel bilgiler sağlamak ve bunları klinik olarak ilgili translasyonel nakil modellerinde test etmek için protokoller sağlamaktır.

Protokol

Sprague-Dawley sıçanları (300 g vücut ağırlığı) ticari olarak elde edildi ve Ohio Eyalet Üniversitesi Wexner Tıp Merkezi Hayvan Tesisi'nde patojen içermeyen koşullar altında barındırıldı. Tüm prosedürler, NIH ve Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre ve Ohio Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (IACUC Protokolü 2023A00000071) onayıyla insancıl bir şekilde gerçekleştirildi.

1. PolyhHb sentezi ve saflaştırılması

NOT: Aşağıdaki EVLP deneyleri için kullanılan PolyhHb malzemesinin üretimi ve sentezi ilk olarak Cuddington ve ark. 2020'de22. PolyhHb sentezinin derinlemesine şemaları ve analizi için lütfen bu çalışmaya bakın. Aşağıda, PolyhHb'nin pilot ölçekte sentezi ve saflaştırılmasının ve ardından bir perfüzat olarak hazırlanmasının bir özeti yer almaktadır.

  1. RBC yıkama, lizis ve Hb saflaştırma
    1. 18 ünite son kullanma tarihi geçmiş insan PRBC'si temin edin ve bunları 20 L'lik bir filtrasyon kabına dökün, ağırlıkça% 0.9 salin ile% 22'lik bir nihai hematokrit ile seyreltin (Şekil 1B, C).
    2. RBC çözeltisi üzerinde ağırlıkça %0,9 tuzlu su ile 0,65 μm modifiye polietilen sülfon (mPES) teğetsel akış filtrasyon (TFF) modülünde altı sistem hacmi değişimi (diyasikl) gerçekleştirin. NOT: Bu yıkama adımının amacı, hemolizden önce hasarlı eritrositleri, membran parçalarını ve diğer hücre dışı materyalleri uzaklaştırmaktır (Şekil 1B,C).
    3. RBC çözeltisini 10 L fosfat tamponu (PB, 3.75 mM, pH 7.4) ile 4 ° C'de 1 saat boyunca sürekli karıştırarak parçalayın.
    4. Çözeltiyi 500 kDa'lık bir TFF modülü üzerinde filtreleyerek ve süzüntüyü 30 L'lik kesikli reaktör kabında toplayarak parçalanmış membran parçalarını ve diğer agregaları çıkarın (Şekil 1A-C).
    5. Reaktöre 480 g Hb girdikten sonra, PB'yi fosfat tamponlu saline (PBS) dönüştürmek için bir tuz yükü ekleyin.
    6. Proteini gece boyunca oksijenden arındırmak için Hb'yi nitrojenle beslenen bir gaz kontaktörü aracılığıyla yeniden dolaştırın ve reaktörde bir nitrojen kafa boşluğunu koruyun. Methemoglobin (metHb) oluşumunu sınırlamak için 14 °C'ye soğutun.
  2. Hb polimerizasyonu
    1. Çözeltiyi bir gaz kontaktör döngüsü üzerinde yeniden dolaştırırken Hb çözeltisini fizyolojik sıcaklığa (37 ° C) ısıtın.
      NOT: Amaç, Hb'nin çoğunun gergin kuaterner durumda olmasını sağlamak için proteini 0-10 mmHg arasında bir pO2'ye oksijenden arındırmaktır (Şekil 1A).
    2. Etkili deoksijenasyonu sağlamak için gerektiği gibi 1 g sodyum ditiyonit yükü ekleyin.
    3. Devridaim döngüsünü korurken ve Hb çözeltisini gazdan arındırırken, 3 L oksijeni giderilmiş PBS (pH 7.4) içinde seyreltilmiş Hb'ye 30:1 molar oranda glutaraldehit (GA) ekleyin.
    4. Ek bir saatlik reaksiyon süresi ile reaktör kabına 3 saat boyunca çözelti ekleyin.
    5. Çapraz bağlanma reaksiyonunu, 3 L PBS (pH 7.4) içinde seyreltilmiş 7: 1 molar sodyum siyanoborohidrit GA oranı ile söndürün. Reaktöre 10 dakikadan fazla ekleyin.
    6. Reaktörü gece boyunca 14 °C'de soğutun.
  3. PolyhHb arıtma
    1. Reaktör içeriğini 10 L'lik bir filtrasyon kabına pompalayın ve 0,2 μm polietilen sülfon (PES) TFF modülü (Aşama 1) aracılığıyla sirkülasyona başlayın. Bu adım, büyük agregaları ve istenmeyen kirleticileri ortadan kaldıracaktır.
    2. Süzüntüyü, dolduğunda 500 kDa'lık bir polisülfon (PS) TFF modülü (Aşama 2) üzerinde dolaşacak olan 10 L'lik ikincil bir filtrasyon kabına besleyin. Reaktör boşalana kadar devam edin (Şekil 1B,D).
    3. Reaktör arıtma devresine boşaltıldıktan sonra, modifiye edilmiş laktasyonlu Ringer çözeltisi (pH 7.4) ile Aşama 1'de eksipiyan değişimini başlatın. Her tam hacim değişiminden sonra, UV görünür spektroskopi kullanarak Aşama 1'in süzüntüsündeki protein konsantrasyonunu ölçün.
    4. Aşama 1 süzüntüsü 1 mg Hb / mL'den daha düşük bir konsantrasyona sahip olduğunda, modifiye edilmiş Ringer çözeltisini Aşama 2'ye aktarın. Aşama 1'deki herhangi bir bekletme bir israftır ve uygun şekilde imha edilmelidir. Toplamda, değiştirilmiş Ringer çözümünün 12 tam hacimli değişiminin her iki aşamada da gerçekleştirildiğinden emin olun.
    5. Diyasikllerin tamamlanmasının ardından, Aşama 2'nin içeriğini 500 kDa TFF modülü üzerinde en az 10 g/dL'ye konsantre edin.
    6. Konsantre çözeltiyi 50 mL konik tüplerde paketleyin ve kullanana kadar -80 ° C'de saklayın.

2. Perfüzat formülasyonu

  1. Perfüzatı 165 mL'lik son hacme hazırlayın. PolyhHb'yi William's E Medium ile 3.7 g / dL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
  2. İnsan serum albüminini (HSA) ağırlıkça% 3 HSA'lık bir nihai konsantrasyona ekleyin. Son çözeltiye 1 mL heparin ekleyin.

3. Ex Vivo akciğer perfüzyon devresi kurulumu

  1. PolyhHb perfüzatını EVLP devre rezervuarına yerleştirin ve ılık su banyosunu 37 °C'ye getirin. Makaralı pompaları açarak perfüzatın devre içinde dolaştığından emin olun.
  2. Perfüzatın oksijenini gidermek için oksijenden arındırma gazını (yani %6 O2, %8 CO2, %84 N2) içi boş fiber oksijenatöre bağlayın. Bu, akciğerin perfüzatı oksijenlendirme yeteneğini değerlendirmek için yapılır.
  3. Yakındaki bir bilgisayarda veri toplama yazılımını açın. Pulmoner arter basıncı, trakeal diferansiyel basınç, solunum akışı diferansiyel basıncı, akciğer ağırlığı ve pompa hızı dönüştürücülerinin hem devreye hem de veri dönüştürücü kutusuna bağlı olduğundan emin olun.
  4. Tüm boru bağlantılarını dikkatlice inceleyerek sistem genelinde sızıntı olmadığından ve her yerde ılık suyun dolaştığından emin olun (Şekil 2). Tüm basınç transdüserlerinin çalıştığından emin olmak için veri toplama yazılımında Çalıştır'a basın. Sistem düzgün bir şekilde çalıştığında, makaralı pompaları kapatın.

4. Donör sıçan akciğer bloğu alımı

  1. Ameliyat masasını kurun ve aletleri yerleştirin (Şekil 3). Tüm aletleri 121 °C'de 30 dakika otoklavlayın.
  2. 1200 U/kg heparin, anestezik için bir ketamin/ksilazin karışımı (60 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg) ve ayrıca 5-10 cm uzunluğunda ipek sütürler (3-0 veya 4-0) hazırlayın.
  3. Ketamin / ksilazin çözeltisini sıçanın içine intraperitoneal olarak enjekte edin. Anestezik düzlemin gelişmesi için 5-10 dakika bekleyin. Uygun bir anestezi seviyesi sağlamak için, bir reaksiyon ortaya çıkarmak için fareyi ayak parmağınızla sıkıştırın. Herhangi bir reaksiyon yoksa, uygun anestezi seviyesi karşılanmıştır.
  4. Sıçanın karnını tıraş edin ve sıçanı cerrahi tahta üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Karnı povidon-iyot ve% 70 etanol ile temizleyin. Kuruluğu önlemek için farenin gözlerinin altına oftalmik merhem yerleştirin.
  5. Fareyi cerrahi tahtaya taşıyın ve fareyi yerine sabitleyin (Şekil 4A). Veri toplama yazılımını açın ve kaydetmeye başlayın. Ventilatörü 4 mL/kg'da açın ve pozitif son ekspiratuar basıncın (PEEP) yaklaşık 2 cm/sa2O olduğundan emin olun.
    NOT: Bu başlangıç ayarları deneye özeldir. Bireysel deneyler için en iyi ventilasyon stratejilerini belirlemek tüm araştırmacılara bağlıdır.
  6. Uygun anestezik derinliğe ulaşıldığında, bir makas kullanarak ksifoid prosesten kasık simfizine kadar bir orta hat laparotomisi yapın. Daha sonra, medial-lateral viseral rotasyon gerçekleştirin ve künt bir alet (IVC) kullanarak infra-hepatik inferior vena kava'yı görselleştirin36,37,38 (Şekil 4B). Heparini 20G'lik bir iğne ile IVC'ye enjekte edin (Şekil 4C).
  7. Dikkati boyuna çevirin ve cildi sternal çentikten mandibula açısının hemen altına kadar bir makasla kesin. Ardından, trakeaya doğru incelemeye başlayın (Şekil 5A).
  8. Bboyunda, trakeayı ortaya çıkarmak için gerekli kayış kaslarını künt bir şekilde inceleyin (Şekil 5B). Endotrakeal (ET) tüp (birkaç milimetre) için yeterince büyük kıkırdaklı halkalar arasındaki ön trakea üzerinde bir makasla enine bir kesi yapın, ancak trakeanın arka kısmını kesmeyin. Soluk borusunun etrafına 5-0 ipek sütür yerleştirin (Şekil 5C).
  9. Endotrakeal tüpü yerleştirin ve yukarıda belirtilen 5-0 ipek sütür ile yerine sabitleyin (Şekil 5D). ET tüpünü ventilatöre bağlayın ve göğsün uygun şekilde yükseldiğinden emin olun.
  10. Medyan sternotomi yapın ve makas kullanarak tekrar göğüs boşluğuna girin. Kalbi ve akciğerleri açığa çıkarmak için göğüs duvarı ekartörlerini yerleştirin (Şekil 6A). İnanılmaz derecede kırılgan oldukları için akciğerlerin yanlışlıkla manipüle edilmesinden kaçının.
  11. Keskin (makas) ve künt diseksiyon kombinasyonu ile timusu anterior mediastenden çıkarın. Büyük damarlara veya akciğerlere zarar vermemeye dikkat edin.
  12. Pulmoner arteri tanımlayın (PA; Şekil 6B) ve kanülasyona hazırlanmak için etrafına 5-0 ipek sütür yerleştirin (Şekil 6C). Sıçanın büyük damarlarının mikroskobik anatomisi nedeniyle, sütürü aynı anda PA ve aort etrafına yerleştirmek genellikle daha kolaydır.
  13. Arteriyel kanülü PA içine yerleştirmek için bir makas (Şekil 6D-E) kullanarak sağ ventrikül çıkış yolunda (RVOT) 2-3 mm'lik bir kesi yapın ve bir adım önce açıklanan 5-0 sütür ile yerine sabitleyin (Şekil 6F).
  14. Sıçanı ötenazi yapmak için bir makas kullanarak sol ventrikülde (LV) ve ayrıca infra-hepatik IVC'de 5 mm'lik bir kesi yapın. Akciğer koruma sıvısını hızlı bir şekilde arteriyel kanüle bağlayın, akciğerleri yaklaşık 20 mL ile yerçekimi ile yıkayın (Şekil 7A-B). Hava embolileri akciğerlere çok zarar verdiğinden, arteriyel kanüle bağlamadan önce akciğer koruma sıvısının havasının alındığından emin olun.
  15. Arteriyel kanülü EVLP devresine bağlayın. Silindir pompasını açın ve az miktarda perfüzatın akciğerden ve sol ventrikülden göğüs boşluğuna akmasına izin verin. Perfüzat sol atriyumdan dışarı akmaya başladığında, silindir pompasını kapatın (Şekil 7C). Perfüzatın akmasına izin verirken, PA basıncının yükselmediğinden emin olun - bu tıkanıklığı veya yanlış yerleştirmeyi gösterir.
  16. LV'ye küçük forsepsler yerleştirin ve mitral kapak halkasını hafifçe gerin, bu da sol atriyum (LA) kanülünün girmesine izin verecektir (Şekil 8A). Kalbin etrafına 5-0 ipek bir bağ yerleştirin ve gevşek bir şekilde bağlayın (Şekil 8B).
  17. LA kanülünü LV'ye yerleştirin ve LA kanülünü atriyum içinde görünene kadar ilerletin. LA'yı önceden bağlanmış 5-0 sütür ile sabitlemeyi bitirin (Şekil 8C).
  18. Yemek borusunu tanımlayın ve diyaframa mümkün olduğunca yakın bir hemostat ile klempleyin. Göğüs boşluğuna dökülme olmadığından emin olmak için yemek borusunu kanama durdurucunun altından kesin (Şekil 9A).
  19. Omurgayı kılavuz olarak kullanarak, kalp-akciğer bloğunu çevredeki yapılara bağlayan tüm ligamentöz ekleri bir makas kullanarak kesin (Şekil 9B). Kalp-akciğer bloğu serbestçe hareket edebildiğinde, trakeayı boyundan diseke edin ve son olarak kalp-akciğer bloğunu serbest bırakmak için bir makas kullanarak trakeayı ET tüpünün üzerinden kesin (Şekil 9C).
  20. Kalp-akciğer bloğunu EVLP devresi içindeki torasik cekete taşıyın ve LA kanülünü EVLP devresine takın (Şekil 9D). Silindir pompasını açın ve vantilatör monitörünü bağlayın.
  21. Sisteme hava embolisi girmediğinden emin olmak için kabarcık kapanını kontrol edin.
  22. İlk 15 dakikaboyunca ventilasyon ve perfüzyon ayarlarını yavaşça istenen deneysel seviyelere değiştirin 36,37,38. Ek olarak, bu ilk hızlandırma aşamasında, perfüzyon akış hızını istenen hıza ve/veya basınca yükseltin.
  23. Deney tarafından belirlenen zaman noktalarında, solunum fonksiyon testlerinin yanı sıra perfüze gaz seviyelerini kontrol edin.

Sonuçlar

PolyhHb bazlı perfüzatımızın doğrulanması ve ayrıca bu perfüzatın birkaç saat boyunca stabilitesi Şekil 10'da gösterilmiştir. İlk 1 saat boyunca, test edilen tüm perfüzatlar (PolyhHb, Kontrol (Williams Media +% 5 HSA), RBC bazlı) LA pO2'de (Post pO2) hafif bir azalma gösterdi. Bununla birlikte, RBC bazlı perfüzat, PolyhHb'ye kıyasla 1 saatte önemli bir azalma göstermiştir (p < 0.05). Önümüzdeki birkaç saat b...

Tartışmalar

Perfüzyon solüsyonlarının geliştirilmesi ve test edilmesi, dünya çapında birçok kişinin başlattığı yeni bir çabadır. Geleneksel olarak, standart perfüzatlar iskemik zamanı askıya alma ve iskemi ile ilişkili yaralanmaları hafifletme ve ayrıca reperfüzyon18 yeteneği sunar. Bununla birlikte, EVLP'nin bir sonraki evrimi, mevcut perfüzat teknolojisini iyileştirmenin yanı sıra onarım ve yenileme terapilerini 39,40,41,...

Açıklamalar

Bu çalışmada sunulan materyal için A.F.P., A.G. ve C.C., ABD patent başvurusu PCT/US2022/041743'in mucitleridir. AFP, CC, BOW ve SMB, ABD patent başvurusu PCT/US2023/017765'in mucitleridir.

Teşekkürler

Bu araştırma, Jewel ve Frank Benson Aile Vakfı ve Jewel ve Frank Benson Araştırma Profesörlüğü tarafından cömertçe desteklenmiştir. B.A.W. kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe R01HL143000 tarafından desteklenmektedir. AFP, NIH hibeleri R01HL126945, R01EB021926, R01HL131720 ve R01HL138116 ve ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı hibe W81XWH1810059 tarafından desteklenmektedir. S.M.B., NIH R01 DK123475 tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needleB-D309301
30 L Glass Batch BioreactorAce Glass
30g NeedleMed NeedlesBD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial TabletsElancoNA
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O)Sigma Aldrich10035-04-8For modified Ringer's lactate
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672Harvard Apparatus731747
Connect kit D150Cole-Parmer VK 73-3763
Dumont #5 ForcepsFine Science tools11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45°Fine Science tools11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Water HeaterLaudaLCK 1879
Expired human leukoreduced, packed RBC unitsWexner Medical Center
Canadian Blood Services
Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150Hugo Sachs ElektronikPY2 73-3762
ForcepsFine Science tools11027-12
Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%)Sigma Aldrich111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito HemostatRoboz SurgicalRS-7112
Heparin 30,000 units per 30 mlAPP Pharmaceuticals
Human Serum Albumin (HSA)OctaPharma PlasmaPerfusate additive
IL2 Tube set for perfusateHarvard Apparatus733842
IPL-2 Basic Lung Perfusion SystemHarvard Apparatus
Ketamine 500 mg per 5 mlJHP Pharmaceuticals
Left Atrium cannulaHarvard Apparatus730712
Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor3MG420gas contactor
low potassium dextran glucose solution (perfadex)XVIVOsolution flushing the lung
Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24)Cole-Palmer
N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S)Sigma Aldrich616-91-1 (A7250)For modified Ringer's lactate
Nalgene Vessels (10L, 20L)NalgeneFiltration vessels
Peristaltic Pump Ismatec ISM 827B
PES, 0.65 µm TFF moduleRepligenN02-E65U-07-N
PhysioSuiteKent Scientific CorporationPS-MSTAT-RT
polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF moduleRepligenN02-S20U-05-N
Polysulfone (PS), 500 kDa TFF moduleRepligenN02-P500-05-N
Potassium Chloride (KCl)Fisher Scientific7447-40-7For PBS
PowerLab 8/35 ADInstruments730045
Pulmonary Artery cannulaHarvard Apparatus730710
Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24)PharMed BPT
Puralube Ophthalmic OintmentDechraNA
ScissorsFine Science tools14090-11
SCP Servo controller for perfusion type 704Harvard Apparatus732806
Small Animal Ventilator model 683Harvard Apparatus55-000
Sodium Chloride (NaCl)Fisher Scientific7647-14-5 (S271-10)For PBS and saline
Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3)Sigma Aldrich25895-60-7
Sodium Dithionite (Na2S2O4)Sigma Aldrich7775-14-6
Sodium Hydroxide (NaOH)Fisher Scientific1310-73-2For modified Ringer's lactate
Sodium Lactate (NaC3H5O3)Sigma Aldrich867-56-1For modified Ringer's lactate
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)Fisher Scientific7558-79-4For PBS
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Fisher Scientific7558-80-7For PBS
SomnoSuite Small Animal Anesthesia SystemKent Scientific CorporationSS-MVG-Module
Sprague-Dawley ratsEnvigo
TAM-A transducer amplifier module type 705/1Harvard Apparatus73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2Harvard Apparatus 73-1793
TCM time control module type 686Harvard Apparatus731750
Tracheal cannulaHarvard Apparatus733557
Tube set for moist chamberHarvard Apparatus 73V83157
Tubing CassetteCole-ParmerIS 0649
Tweezer #5 DumostarKent Scientific Corporation INS500085-A
Tweezer #5 stainless steel, curvedKent Scientific CorporationIND500232
Tweezer #7 TitaniumKent Scientific Corporation INS600187
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm IDHarvard Apparatus721017perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm IDHarvard Apparatus721019perfusate line leaving lung
Vannas-Tubingen Spring ScissorsFine Science Tools15008-08
VCM ventilator control module type 681Harvard Apparatus731741
William's E MediaGibco, ThermoFisher ScientificA12176-01Perfusate additive
Xylazine 100 mg per 1 mlAkorn

Referanslar

  1. Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2021 annual data report: Lung. Am J Transplant. 23, S379-S442 (2023).
  2. Gouchoe, D. A., et al. Ex vivo lung perfusion in donation after circulatory death: A post hoc analysis of the normothermic Ex Vivo lung perfusion as an assessment of extended/marginal donors lungs trial. J Thorac Cardiovasc Surg. , (2024).
  3. Bobba, C. M., et al. Trends in donation after circulatory death in lung transplantation in the United States: Impact of era. Transpl Int. 35, 10172 (2022).
  4. Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).
  5. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. N Engl J Med. 364 (15), 1431-1440 (2011).
  6. Cypel, M., Neyrinck, A., Machuca, T. N. Ex vivo perfusion techniques: state of the art and potential applications. Intens Care Med. 45 (3), 354-356 (2019).
  7. Gouchoe, D. A., et al. XPS™ Jensen lung as a low-cost, high-fidelity training adjunct to ex-vivo lung perfusion. Artif Organs. , (2023).
  8. Van Raemdonck, D., Rega, F., Rex, S., Neyrinck, A. Machine perfusion of thoracic organs. J Thorac Dis. 10, S910-S923 (2018).
  9. Andreasson, A. S., Dark, J. H., Fisher, A. J. Ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation--state of the art. Eur J Cardiothorac Surg. 46 (5), 779-788 (2014).
  10. Ahmad, K., Pluhacek, J. L., Brown, A. W. Ex vivo lung perfusion: A review of current and future application in lung transplantation. Pulm Ther. 8 (2), 149-165 (2022).
  11. Kim, J. L., et al. Biometric profiling to quantify lung injury through ex vivo lung perfusion following warm ischemia. Asaio j. 69 (8), e368-e375 (2023).
  12. Jeon, J. E., et al. Acellular ex vivo lung perfusate silences pro-inflammatory signaling in human lung endothelial and epithelial cells. J Transl Med. 21 (1), 729 (2023).
  13. Baciu, C., et al. Altered purine metabolism at reperfusion affects clinical outcome in lung transplantation. Thorax. 78 (3), 249-257 (2023).
  14. Peel, J. K., et al. Evaluating the impact of ex vivo lung perfusion on organ transplantation: A retrospective cohort study. Ann Surg. 278 (2), 288-296 (2023).
  15. Peel, J. K., et al. Determining the impact of ex vivo lung perfusion on hospital costs for lung transplantation: A retrospective cohort study. J Heart Lung Transpl. 42 (3), 356-367 (2023).
  16. Warnecke, G., et al. Normothermic ex vivo preservation with the portable Organ Care System Lung device for bilateral lung transplantation (INSPIRE): a randomised, open-label, non-inferiority, phase 3 study. Lancet Respir Med. 6 (5), 357-367 (2018).
  17. Loor, G., et al. Portable normothermic ex vivo lung perfusion, ventilation, and functional assessment with the Organ Care System on donor lung use for transplantation from extended-criteria donors (EXPAND): a single-arm, pivotal trial. Lancet Resp Med. 7 (11), 975-984 (2019).
  18. Loor, G., et al. Prolonged EVLP using OCS lung: Cellular and acellular perfusates. Transplantation. 101 (10), 2303-2311 (2017).
  19. Bansal, S., Biswas, G., Avadhani, N. G. Mitochondria-targeted heme oxygenase-1 induces oxidative stress and mitochondrial dysfunction in macrophages, kidney fibroblasts and in chronic alcohol hepatotoxicity. Redox Biol. 2, 273-283 (2014).
  20. Park, S., et al. Initial investigation on the feasibility of porcine red blood cells from genetically modified pigs as an alternative to human red blood cells for transfusion. Front Immunol. 14, 1298035 (2023).
  21. Ellingson, K. D., et al. Continued decline in blood collection and transfusion in the United States-2015. Transfusion. 57, 1588-1598 (2017).
  22. Cuddington, C. T., et al. Pilot scale production and characterization of next generation high molecular weight and tense quaternary state polymerized human hemoglobin. Biotechnol Bioeng. 119 (12), 3447-3461 (2022).
  23. Moore, E. E., et al. Human polymerized hemoglobin for the treatment of hemorrhagic shock when blood is unavailable: the USA multicenter trial. J Am Coll Surg. 208 (1), 1-13 (2009).
  24. Shonaka, T., et al. Impact of human-derived hemoglobin based oxygen vesicles as a machine perfusion solution for liver donation after cardiac death in a pig model. PLoS One. 14 (12), e0226183 (2019).
  25. Chen, G., Palmer, A. F. Hemoglobin-based oxygen carrier and convection enhanced oxygen transport in a hollow fiber bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102 (6), 1603-1612 (2009).
  26. Bucci, E., Kwansa, H., Koehler, R. C., Matheson, B. Development of zero-link polymers of hemoglobin, which do not extravasate and do not induce pressure increases upon infusion. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 35 (1), 11-18 (2007).
  27. Schaer, C. A., et al. Haptoglobin preserves vascular nitric oxide signaling during hemolysis. Am J Respir Crit Care Med. 193 (10), 1111-1122 (2016).
  28. Muller, C. R., et al. Safety and efficacy of human polymerized hemoglobin on guinea pig resuscitation from hemorrhagic shock. Sci Rep. 12 (1), 20480 (2022).
  29. Greenfield, A., et al. Biophysical analysis and preclinical pharmacokinetics-pharmacodynamics of tangential flow filtration fractionated polymerized human hemoglobin as a red blood cell substitute. Biomacromolecules. 24 (4), 1855-1870 (2023).
  30. Cuddington, C., et al. Polymerized human hemoglobin-based oxygen carrier preserves lung allograft function during normothermic ex vivo lung perfusion. Asaio j. , (2024).
  31. Cabrales, P., et al. Effects of the molecular mass of tense-state polymerized bovine hemoglobin on blood pressure and vasoconstriction. J Appl Physiol. 107 (5), 1548-1558 (2009).
  32. Baek, J. H., et al. Down selection of polymerized bovine hemoglobins for use as oxygen releasing therapeutics in a guinea pig model. Toxicol Sci. 127 (2), 567-581 (2012).
  33. Williams, A. T., et al. Resuscitation from hemorrhagic shock with fresh and stored blood and polymerized hemoglobin. Shock. 54 (4), 464-473 (2020).
  34. Muller, C. R., et al. Resuscitation from hemorrhagic shock after traumatic brain injury with polymerized hemoglobin. Sci Rep. 11 (1), 2509 (2021).
  35. Lamb, D. R., et al. The molecular size of bioengineered oxygen carriers determines tissue oxygenation in a hypercholesterolemia guinea pig model of hemorrhagic shock and resuscitation. Mol Pharm. 20 (11), 5739-5752 (2023).
  36. Bobba, C. M., et al. A novel negative pressure-flow waveform to ventilate lungs for normothermic ex vivo lung perfusion. Asaio j. 67 (1), 96-103 (2021).
  37. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. J Vis Exp. (96), e52309 (2015).
  38. Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), 7-15 (2014).
  39. Wong, A., et al. Potential therapeutic targets for lung repair during human ex vivo lung perfusion. Eur Respir J. 55 (4), 1902222 (2020).
  40. Machuca, T. N., et al. The role of the endothelin-1 pathway as a biomarker for donor lung assessment in clinical ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transpl. 34 (6), 849-857 (2015).
  41. Gouchoe, D. A., et al. Mitsugumin 53 Mitigation of ischemia reperfusion injury in a mouse model. J Thorac Cardiovasc Surg. 10, (2023).
  42. Gouchoe, D. A., Whitson, B. A., Zhu, H. The next frontier in lung transplantation: Protecting the endothelium and repairing organs for transplant utilizing MG53. Clin Transl Dis. 3 (6), e255 (2023).
  43. Gouchoe, D. A., et al. MG53 mitigates warm ischemic lung injury in a murine model of transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg. , (2023).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Ex Vivo Akci er Perf zyonuAkci er NakliPolimerize HemoglobinOksijen Ta y c larPerf zyon Sol syonlarMarjinal Don rlerPulmoner demHomeostazS an Modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır