Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים את היישום של נשא חמצן פולימרי אנושי מבוסס המוגלובין אנושי (PolyhHb) כפרפוזט ואת הפרוטוקול שבו ניתן לבדוק תמיסת זילוח זו במודל של זילוח ריאות חולדה ex vivo .

Abstract

השתלת ריאות נפגעת בשל היעדר תורמים מתאימים. בעבר, תורמים שנחשבו שוליים או לא מספקים נזרקו. עם זאת, טכנולוגיה חדשה ומלהיבה, כגון זילוח ריאות ex vivo (EVLP), מציעה לספקי השתלות ריאה הערכה מורחבת עבור allografts תורם שולי. פלטפורמת הערכה דינמית זו הובילה לעלייה בהשתלות ריאה ואפשרה לספקים להשתמש בתורמים שנזרקו בעבר, ובכך להרחיב את מאגר התורמים. טכניקות הזילוח הנוכחיות משתמשות בפרפוזות תאיות או אצלולריות, ולשתיהן יתרונות וחסרונות ברורים. הרכב הזילוח חיוני לשמירה על סביבה הומיאוסטטית, מתן תמיכה מטבולית נאותה, הפחתת דלקת ומוות תאי, ובסופו של דבר שיפור תפקוד האיברים. תמיסות זילוח חייבות להכיל ריכוז חלבון מספיק כדי לשמור על לחץ אונקוטי מתאים. עם זאת, תמיסות הזילוח הנוכחיות מובילות לעתים קרובות לאקסטרווסציה של נוזלים דרך האנדותל הריאתי, וכתוצאה מכך לבצקת ריאות לא מכוונת ולנזק. לכן, יש צורך לפתח פתרונות זילוח חדשניים המונעים נזק מוגזם תוך שמירה על הומאוסטזיס תאי תקין. במאמר זה אנו מתארים את היישום של נשא חמצן פולימרי מבוסס המוגלובין אנושי (PolyhHb) כפרפוזט ואת הפרוטוקול שבו ניתן לבדוק את תמיסת הזילוח הזו במודל של EVLP חולדה. מטרת מחקר זה היא לספק לקהילת מושתלי הריאה מידע מרכזי בתכנון ופיתוח פתרונות זילוח חדשניים, כמו גם את הפרוטוקולים המתאימים לבדיקתם במודלים של השתלות תרגומיות רלוונטיות מבחינה קלינית.

Introduction

כמו כל תחום בהשתלות איברים מוצקים, גם השתלת ריאות סובלת ממחסור באיברים תורמים. על מנת להגדיל את מאגר התורמים, הוקדש מחקר משמעותי לחקר הפוטנציאל של אלושתלים שנחשבו בעבר כבלתי מתאימים להשתלה, כלומר תורמי קריטריונים מורחבים (ECD). אלושתלים אלה יכולים להיחשב ECD משלל סיבות, כולל איכות מפוקפקת, תפקוד לקוי, זיהום, טראומה, זמנים איסכמיים חמים או קרים ממושכים, וגיל מתקדם 1,2. במקרים מסוימים, כאשר ריאות אלה מתאימות להשתלה מיידית3, לעתים קרובות כדאי לספקים ולמושתלים כאחד להעריך ריאות אלה למשך זמן נוסף כדי לקבוע את התאמתן להשתלה. זילוח ריאות Ex vivo (EVLP) היא טכנולוגיה כזו המאפשרת הערכה מורחבת של השתלות ריאה פוטנציאליות במעגל סגור מחוץ לתורם 2,4,5,6,7, ומעניקה לספק ההשתלה את היכולת לקבוע התאמה להשתלה. EVLP הראה את היכולת להעריך כראוי איברים תורמים 8,9,10,11, להפחית את ההשפעות של פגיעה איסכמית reperfusion (IRI)12,13 ולהגדיל את מאגר התורמים14,15 ובכך להפוך השתלת ריאות לטיפול נגיש יותר לכולם.

באופן כללי, מערכת EVLP היא מערכת סגורה עם מעגל אוורור (המושג על ידי חיבור מאוורר לקנה הנשימה כדי להכניס אוויר למערכת) ומעגל כלי דם (המושג על ידי חיבור אטריום שמאלי (LA) לעורק הריאה (PA) עם צינורות)7. מעגל כלי הדם יש perfusate זורם דרך הצינורית כדי לתת את הריאה חומרים מזינים חיוניים וחמצן תוך הגבלת הזמן איסכמי קר (CIT) 5,8,16,17. תמיסה זו מבוססת דם (כלומר, באמצעות תוספת של תאי דם אדומים ארוזים (PRBCs))16,17 או מבוססת תאים (כלומר, ללא PRBCs)4,5. עם זאת, ישנם מספר חסרונות בולטים לשימוש PRBCs. אם משתמשים ב-PRBCs מתורמים שמתו מטראומה או מתורמים שמתו מוות מוחי (BDD), נוזלים אלה מכילים לעתים קרובות כמויות גדולות של ציטוקינים דלקתיים, אשר עלולים להגביר את הנזק לתאים במהלך EVLP, כמו גם להעלות את רמות המוגלובין ללא תאים (Hb), הם, ברזל ושברי תאים אשר מספקים נזק נוסף לתאים18,19. יתר על כן, מכיוון שתורמים אלה הם לעתים קרובות מרובי איברים, איסוף PRBCs לפני הרכישה עלול להוביל לירידה בנפח הדם אצל התורם וכתוצאה מכך להגברת האיסכמיה לכל האיברים. אם משתמשים ב- PRBCs ממקור אחר, ספקים עלולים להתמודד עם מחסור בדם מכיוון שזהו חומר נדיר בפני עצמו20,21. לבסוף, PRBCs נוטים לליזה מכנית במעגל EVLP ללא קשר למקור שלהם, ומשחררים Hb ורכיבים אחרים התורמים לנזק תאי.

לכן, מסיבות רבות, זה יכול להיות יתרון להשתמש בתחליף תאי דם אדומים מלאכותיים, כלומר, נשאי חמצן מבוססי המוגלובין (HBOCs), כתוסף perfusate. HBOC מבטיח במיוחד הוא המוגלובין אנושי פולימרי (PolyhHb). PolyhHb מסונתז מ Hb מטוהר מ PRBCs פג תוקף שנחשבו לא מתאימים לעירוי מיידי22. הם הוכחו כתחליפי דם קיימא בהלם דימומי23 והשתלה24 וניתן לייצר אותם בכמויות גדולות22. עם זאת, אימוץ בקנה מידה גדול של PolyhHb לא הצליח עקב סיבוכים בלתי צפויים כגון vasoconstriction, עלייה בלחץ הדם, דום לב23,25. הסיבות מאחורי ממצאים אלה נבעו ככל הנראה מנוכחותם של פולימרי Hb נטולי תאים או פולימרי Hb בעלי משקל מולקולרי נמוך (< 500 kDa) בתמיסת PolyhHb, שכן יש להם נטייה לחדור לחלל הרקמה, מה שהביא לירידה בזמינות תחמוצת החנקן, התכווצות כלי דם לאחר מכן, יתר לחץ דם מערכתי, ובסופו של דבר פגיעה ברקמת חמצון26,27. כדי לשפר בעיות אלה, מעבדת פאלמר עבדה על פיתוח הדור הבא של PolyhHb המכיל מינימום MW נמוך זנים Hb ללא תאים, אשר הוכיח תכונות ביופיזיות משופרות ותגובות in vivo 22,28,29,30. מספר מחקרי עירוי בבעלי חיים הראו כי אם פולימרים Hb בעלי משקל מולקולרי נמוך מסולקים מה- HBOC, ניתן להפחית היצרות כלי דם, יתר לחץ דם מערכתי ונזק חמצוני 28,29,31,32,33,34,35. לכן, מה שהופך את הדור הבא הזה PolyhHb מועמד מבטיח perfusate.

כאן, אנו מתארים את היישום של הדור הבא של PolyhHb לשימוש בפרפוסט, ואת הפרוטוקול שבאמצעותו ניתן לבדוק פתרון זילוח זה במודל של EVLP חולדה. מטרת מחקר זה היא לספק לקהילת מושתלי הריאה מידע מרכזי בתכנון ופיתוח פתרונות זילוח חדשניים, כמו גם לספק פרוטוקולים לבדיקתם במודלים קליניים רלוונטיים להשתלות תרגומות.

Protocol

חולדות ספראג-דולי (300 גרם משקל גוף) הושגו באופן מסחרי ושוכנו בתנאים נטולי פתוגנים במרכז הרפואי וקסנר של אוניברסיטת אוהיו. כל ההליכים בוצעו באופן הומני על פי מדריך ה-NIH ומועצת המחקר הלאומית לטיפול הומני ושימוש בחיות מעבדה ובאישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אוהיו (פרוטוקול IACUC 2023A00000071).

1. סינתזת PolyhHb וטיהור

הערה: הייצור והסינתזה של חומר PolyhHb ששימש לניסויי EVLP הבאים פורסמו לראשונה על ידי Cuddington et al. בשנת 202022. אנא עיין בעבודה זו לקבלת סכמות מעמיקות וניתוח של סינתזת PolyhHb. להלן סיכום של סינתזה וטיהור של PolyhHb בקנה מידה פיילוט והכנתו לאחר מכן כ perfusate.

  1. שטיפת RBC, ליזה וטיהור Hb
    1. רכשו 18 יחידות של PRBCs אנושיים שפג תוקפם ושפכו אותם לתוך כלי סינון בנפח 20 ליטר, תוך דילול עם 0.9 wt% מלוחים עד להמטוקריט סופי של 22% (איור 1B,C).
    2. בצע שישה חילופי נפח מערכת (diacycles) על מודול סינון זרימה משיק (TFF) מפוליאתילן סולפון (mPES) 0.65 מיקרומטר עם 0.9 wt% מלוחים בתמיסת RBC. הערה: המטרה של שלב השטיפה הזה היא להסיר RBCs פגומים, שברי קרום וחומרים חוץ-תאיים אחרים לפני המוליזה (איור 1B,C).
    3. Lyse פתרון RBC עם 10 L של חיץ פוספט (PB, 3.75 mM, pH 7.4) במשך 1 שעה ב 4 ° C עם ערבוב מתמיד.
    4. הסר את שברי הממברנה הליזד וצברים אחרים על-ידי סינון התמיסה מעל מודול TFF של 500 kDa ואיסוף החלחול בכלי הכור באצווה של 30 L (איור 1A-C).
    5. ברגע ש-480 גרם של Hb נמצאים בכור, הוסיפו מטען מלח כדי להמיר PB למלח חוצץ פוספט (PBS).
    6. מחזור Hb דרך מגע גז המוזן בחנקן, כמו גם שמירה על חלל ראש חנקן בכור, כדי להפחית את החמצן של החלבון במשך הלילה. מצננים ל-14°C כדי להגביל היווצרות methemoglobin (metHb).
  2. פילמור Hb
    1. חממו את תמיסת Hb לטמפרטורה פיזיולוגית (37°C) תוך כדי מחזור התמיסה על לולאת מגע גז.
      הערה: המטרה היא לפרק את החמצן של החלבון ל-pO2 בין 0-10 מ"מ כספית כדי להבטיח שרוב ה-Hb יהיה במצב רבעוני מתוח (איור 1A).
    2. הוסף 1 גרם מטען של נתרן dithionite, לפי הצורך, כדי להבטיח deoxygenation יעיל.
    3. תוך שמירה על לולאת המחזור ופירוק הגז של תמיסת Hb, הוסף יחס מולארי של 30:1 של גלוטראלדהיד (GA) ל- Hb מדולל ב- 3 ליטר של PBS לא מחומצן (pH 7.4).
    4. הוסף תמיסה לספינת הכור מעל 3 שעות עם שעה נוספת של זמן תגובה.
    5. להרוות את תגובת הקרוסלינקינג עם יחס מולארי של 7:1 של נתרן ציאנובורוהידריד ל-GA, מדולל ב-3 ליטר PBS (pH 7.4). יש להוסיף לכור למשך יותר מ-10 דקות.
    6. כור קירור ב 14 °C (75 °F) למשך הלילה.
  3. טיהור PolyhHb
    1. יש לשאוב את תכולת הכור לתוך כלי סינון בנפח 10 ליטר ולהתחיל במחזור הדם דרך מודול TFF מסוג פוליאתילן סולפון (PES) בנפח 0.2 מיקרומטר (שלב 1). שלב זה יסיר אגרגטים גדולים ומזהמים לא רצויים.
    2. הזן את החדירה לתוך כלי סינון משני 10 L אשר יסתובב מעל מודול 500 kDa polysulfone (PS) TFF (שלב 2) לאחר מלא. המשיכו עד לריקון הכור (איור 1B,D).
    3. לאחר ריקון הכור לתוך מעגל הטיהור, התחל החלפה מעוררת בשלב 1 עם תמיסת רינגר הנקה שונה (pH 7.4). לאחר כל החלפת נפח מלא, מדדו את ריכוז החלבון בחדירה של שלב 1 באמצעות ספקטרוסקופיית UV-visible .
    4. כאשר לחלחול שלב 1 יש ריכוז של פחות מ-1 מ"ג Hb/mL, העבר את תמיסת הצלצול השונה לשלב 2. כל עיכוב בשלב 1 הוא בזבוז ויש להיפטר ממנו כראוי. בסך הכל, ודא כי 12 החלפות בנפח מלא של פתרון הצלצול המתוקן מבוצעות בשני השלבים.
    5. לאחר השלמת diacycles, לרכז את התוכן של שלב 2 לפחות 10 גרם / ד"ל על מודול 500 kDa TFF.
    6. ארוז את התמיסה המרוכזת בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל ואחסן ב -80 ° C עד לשימוש.

2. ניסוח פרפוזט

  1. מכינים את perfusate לנפח סופי של 165 מ"ל. לדלל PolyhHb לריכוז סופי של 3.7 גרם / ד"ל עם מדיום E של ויליאם.
  2. יש להוסיף אלבומין בסרום אנושי (HSA) לריכוז סופי של 3% HSA לפי משקל. הוסף 1 מ"ל של הפרין לתמיסה הסופית.

3. הגדרת מעגל זילוח ריאות Ex Vivo

  1. הכניסו את PolyhHb למאגר מעגלי EVLP והפעילו את אמבט המים החמים ל-37°C. ודא שהמערבול מסתובב בתוך המעגל על ידי הפעלת משאבות הגלילה.
  2. חבר גז דה-חמצון (כלומר 6% O2, 8% CO2, 84% N2) למחמצן הסיב החלול כדי לנטרל את החמצן של הפרפוזט. זה נעשה כדי להעריך את היכולת של הריאה לחמצן את perfusate.
  3. פתח תוכנה לרכישת נתונים במחשב סמוך. ודא שלחץ עורק הריאה, לחץ דיפרנציאלי בקנה הנשימה, לחץ דיפרנציאלי זרימת נשימה, משקל ריאות ומתמרי מהירות משאבה מחוברים הן למעגל והן לתיבת ממיר הנתונים.
  4. ודאו שאין נזילות בכל המערכת על-ידי בדיקה קפדנית של כל חיבורי הצינורות, ושמים חמים זורמים לכל אורכה (איור 2). לחץ על הפעל בתוכנת רכישת הנתונים כדי לוודא שכל מתמרי הלחץ פועלים. ברגע שהמערכת מתפקדת כראוי, כבה את משאבות הגלילה.

4. רכישת בלוק ריאות של חולדה תורמת

  1. ערוך את שולחן הניתוחים ופרוס את המכשירים (איור 3). Autoclave כל המכשירים ב 121 ° C במשך 30 דקות.
  2. הכינו 1200 U/kg הפרין, תערובת קטמין/קסילזין להרדמה (60 מ"ג/ק"ג קטמין ו-5 מ"ג/ק"ג), וכן תפרי משי באורך 5-10 ס"מ (3-0 או 4-0).
  3. הזריקו תמיסת קטמין/קסילזין תוך צפקית לתוך החולדה. המתינו 5-10 דקות עד שמטוס ההרדמה יתפתח. כדי להבטיח רמה נאותה של הרדמה, צבטו את החולדה כדי לעורר תגובה. אם אין תגובה, אז רמת ההרדמה הנכונה נפגשה.
  4. לגלח את הבטן של החולדה ולהניח את החולדה במצב שכיבה על לוח הניתוחים. נקו את הבטן עם פובידון-יוד ו-70% אתנול. יש להניח משחה אופתלמית מתחת לעיני החולדה כדי למנוע יובש.
  5. העבירו את החולדה לקרש הניתוחים ואבטחו את החולדה במקומה (איור 4A). הפעל תוכנה לרכישת נתונים והתחל להקליט. הפעל את מכונת ההנשמה ב 4 מ"ל / ק"ג וודא לחץ expiratory סוף חיובי (PEEP) הוא סביב 2 ס"מ / שעה2O.
    הערה: הגדרות ראשוניות אלה הן ספציפיות לניסוי. על כל החוקרים לקבוע את אסטרטגיות האוורור הטובות ביותר לניסויים בודדים.
  6. לאחר שעומק ההרדמה הנכון נפגש, בצע לפרוטומיה בקו האמצע מתהליך הקסיפואיד לסימפיזיס הערווה באמצעות זוג מספריים. לאחר מכן, בצעו סיבוב ויסצרלי מדיאלי-לטרלי ודמיינו את הווריד הנבוב התחתון בכבד באמצעות מכשיר קהה (IVC)36,37,38 (איור 4B). הזריקו הפרין לתוך IVC באמצעות מחט 20G (איור 4C).
  7. הפנה את תשומת הלב לצוואר וחתך את העור מחריץ עצם החזה ממש מתחת לזווית הלסת התחתונה עם זוג מספריים. לאחר מכן, התחילו לנתח לכיוון קנה הנשימה (איור 5A).
  8. בצוואר, נתחו בבוטות את שרירי הרצועה הדרושים כדי לחשוף את קנה הנשימה (איור 5B). בצע חתך רוחבי עם זוג מספריים בקנה הנשימה הקדמי בין טבעות הסחוס גדול מספיק עבור צינור endotracheal (ET) (כמה מילימטרים), אבל לא לחתוך דרך החלק האחורי של קנה הנשימה. הניחו תפר משי 5-0 סביב קנה הנשימה (איור 5C).
  9. הכנס את הצינור האנדוטרכאלי וחבר אותו למקומו באמצעות תפר משי 5-0 שהוזכר לעיל (איור 5D). חבר את צינור החוצן למכונת ההנשמה וודא התרוממות חזה תקינה.
  10. בצע sternotomy החציוני ולהיכנס לחלל החזה שוב באמצעות מספריים. הניחו מסירי קיר חזה כדי לחשוף את הלב והריאות (איור 6A). הימנע מכל מניפולציה בשוגג של הריאות, כפי שהם פריכים להפליא.
  11. הסר את בלוטת התימוס מהמדיאסטינום הקדמי על ידי שילוב של דיסקציה חדה (מספריים) וקהה. היזהר לא לפגוע בכלי דם גדולים או בריאות.
  12. זיהוי עורק הריאה (PA; איור 6B) והניחו סביבו תפר משי 5-0 כדי להתכונן לקנולציה (איור 6C). בשל האנטומיה המיקרוסקופית של כלי הדם הגדולים של החולדה, לעתים קרובות קל יותר למקם את התפר סביב הרשות הפלסטינית ואבי העורקים בו זמנית.
  13. בצעו חתך בקוטר 2-3 מ"מ במסלול יציאת החדר הימני (RVOT) באמצעות זוג מספריים (איור 6D-E) כדי למקם את צינורית העורקים בתוך הרשות הפלסטינית ולאבטח אותה במקומה בתפר 5-0 שתואר שלב קודם לכן (איור 6F).
  14. בצע חתך 5 מ"מ בחדר השמאלי (LV) וכן IVC אינפרא כבד באמצעות זוג מספריים כדי להרדים את החולדה. חברו במהירות את נוזל שימור הריאה לצינורית העורקית כדי לשטוף את הריאות בכ-20 מ"ל (איור 7A-B). יש לוודא שנוזל שימור הריאות מנותק לפני חיבורו לצינורית העורקית, שכן אמבולי אוויר מזיק מאוד לריאות.
  15. חבר את צינורית העורקים למעגל EVLP. הפעל את משאבת הרולר ואפשר לכמות קטנה של פרפוזט לזרום דרך הריאה והחוצה מהחדר השמאלי לתוך חלל בית החזה. ברגע שהשקע מתחיל לזרום החוצה מהאטריום השמאלי, כבו את משאבת הגלילה (איור 7C). תוך מתן אפשרות לפרבוסט לזרום, יש לוודא שלחץ הרשות אינו מזנק - מה שמעיד על חסימה או מיקום שגוי.
  16. הניחו מלקחיים קטנים ב-LV ומתחו בעדינות את טבעת המסתם המיטרלי, מה שיאפשר החדרה של צינורית האטריום השמאלית (LA) (איור 8A). הניחו עניבת משי 5-0 סביב הלב וקשרו באופן רופף (איור 8B).
  17. הכניסו את צינורית LA לתוך LV וקדמו את צינורית LA עד שניתן יהיה לראות אותה בתוך האטריום. סיימו את אבטחת לוס אנג'לס עם תפר 5-0 (איור 8C).
  18. זהה את הוושט ומהדק אותו עם hemostat קרוב ככל האפשר לסרעפת. חתכו את הוושט מתחת להמוסטאט כדי לוודא שאין שפך לתוך חלל בית החזה (איור 9A).
  19. בעזרת עמוד השדרה כקו מנחה, חתכו את כל חיבורי הרצועות המחברים את גוש הלב-ריאה למבנים הסובבים אותו באמצעות זוג מספריים (איור 9B). ברגע שבלוק הלב-ריאה נייד באופן חופשי, נתחו את קנה הנשימה מהצוואר ולבסוף חתכו את קנה הנשימה שמעל צינור החוצנים באמצעות זוג מספריים כדי לשחרר את בלוק הלב-ריאה (איור 9C).
  20. העבירו את בלוק הלב-ריאה למעיל החזה בתוך מעגל ה-EVLP וחברו את צינורית LA למעגל ה-EVLP (איור 9D). הפעל את משאבת הגלילה וחבר את צג ההנשמה.
  21. בדוק את מלכודת הבועות כדי לוודא שלא מוכנסים אמבולי אוויר למערכת.
  22. שנה באיטיות את הגדרות האוורור והזילוח לרמות הניסוי הרצויות במהלך 15 הדקות הראשונות 36,37,38. בנוסף, במהלך שלב ההאצה הראשוני הזה, הגדילו את קצב זרימת הזילוח לקצב ו/או ללחץ הרצויים.
  23. בנקודות זמן שנקבעו לניסוי, בדקו את רמות גזי הפרבוסט וכן בדיקות תפקודי ריאה.

תוצאות

האימות של הפרפוזט מבוסס PolyhHb שלנו, ויתרה מכך, היציבות של הפרבוסט הזה במשך מספר שעות, מודגם באיור 10. במהלך 1 השעות הראשונות, כל הפרפוזטים שנבדקו (PolyhHb, Control (Williams Media + 5% HSA), מבוססי RBC) הראו ירידה קלה ב- LA pO2 (Post pO2). עם זאת, פרפוזט מבוסס RBC הראה ירידה משמעו...

Discussion

הפיתוח והבדיקות של פתרונות זילוח הוא מאמץ חדשני שרבים ברחבי העולם יוצאים אליו. באופן מסורתי, perfusates סטנדרטי להציע את היכולת להשעות זמן איסכמי ולהפחית את הפציעות הקשורות עם איסכמיה, כמו גם זילוח18. עם זאת, האבולוציה הבאה של EVLP היא לשפר את טכנולוגיית הפרפוזאט הנ...

Disclosures

עבור החומר המוצג בעבודה זו, A.F.P., A.G. ו- C.C. הם ממציאים בבקשת הפטנט האמריקאית PCT/US2022/041743. A.F.P., C.C., B.A.W. ו-S.M.B. הם ממציאים של בקשת פטנט אמריקאית PCT/US2023/017765.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך בנדיבות על ידי קרן משפחת ג'ול ופרנק בנסון ופרופסורת המחקר ג'ול ופרנק בנסון. B.A.W. נתמך חלקית על ידי R01HL143000 המענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). A.F.P. נתמך על ידי מענקי NIH R01HL126945, R01EB021926, R01HL131720 ו- R01HL138116 ומענק מחקר רפואי ופיקוד הציוד של צבא ארה"ב W81XWH1810059. S.M.B. נתמך על ידי NIH R01 DK123475.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needleB-D309301
30 L Glass Batch BioreactorAce Glass
30g NeedleMed NeedlesBD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial TabletsElancoNA
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O)Sigma Aldrich10035-04-8For modified Ringer's lactate
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672Harvard Apparatus731747
Connect kit D150Cole-Parmer VK 73-3763
Dumont #5 ForcepsFine Science tools11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45°Fine Science tools11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Water HeaterLaudaLCK 1879
Expired human leukoreduced, packed RBC unitsWexner Medical Center
Canadian Blood Services
Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150Hugo Sachs ElektronikPY2 73-3762
ForcepsFine Science tools11027-12
Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%)Sigma Aldrich111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito HemostatRoboz SurgicalRS-7112
Heparin 30,000 units per 30 mlAPP Pharmaceuticals
Human Serum Albumin (HSA)OctaPharma PlasmaPerfusate additive
IL2 Tube set for perfusateHarvard Apparatus733842
IPL-2 Basic Lung Perfusion SystemHarvard Apparatus
Ketamine 500 mg per 5 mlJHP Pharmaceuticals
Left Atrium cannulaHarvard Apparatus730712
Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor3MG420gas contactor
low potassium dextran glucose solution (perfadex)XVIVOsolution flushing the lung
Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24)Cole-Palmer
N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S)Sigma Aldrich616-91-1 (A7250)For modified Ringer's lactate
Nalgene Vessels (10L, 20L)NalgeneFiltration vessels
Peristaltic Pump Ismatec ISM 827B
PES, 0.65 µm TFF moduleRepligenN02-E65U-07-N
PhysioSuiteKent Scientific CorporationPS-MSTAT-RT
polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF moduleRepligenN02-S20U-05-N
Polysulfone (PS), 500 kDa TFF moduleRepligenN02-P500-05-N
Potassium Chloride (KCl)Fisher Scientific7447-40-7For PBS
PowerLab 8/35 ADInstruments730045
Pulmonary Artery cannulaHarvard Apparatus730710
Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24)PharMed BPT
Puralube Ophthalmic OintmentDechraNA
ScissorsFine Science tools14090-11
SCP Servo controller for perfusion type 704Harvard Apparatus732806
Small Animal Ventilator model 683Harvard Apparatus55-000
Sodium Chloride (NaCl)Fisher Scientific7647-14-5 (S271-10)For PBS and saline
Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3)Sigma Aldrich25895-60-7
Sodium Dithionite (Na2S2O4)Sigma Aldrich7775-14-6
Sodium Hydroxide (NaOH)Fisher Scientific1310-73-2For modified Ringer's lactate
Sodium Lactate (NaC3H5O3)Sigma Aldrich867-56-1For modified Ringer's lactate
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)Fisher Scientific7558-79-4For PBS
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Fisher Scientific7558-80-7For PBS
SomnoSuite Small Animal Anesthesia SystemKent Scientific CorporationSS-MVG-Module
Sprague-Dawley ratsEnvigo
TAM-A transducer amplifier module type 705/1Harvard Apparatus73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2Harvard Apparatus 73-1793
TCM time control module type 686Harvard Apparatus731750
Tracheal cannulaHarvard Apparatus733557
Tube set for moist chamberHarvard Apparatus 73V83157
Tubing CassetteCole-ParmerIS 0649
Tweezer #5 DumostarKent Scientific Corporation INS500085-A
Tweezer #5 stainless steel, curvedKent Scientific CorporationIND500232
Tweezer #7 TitaniumKent Scientific Corporation INS600187
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm IDHarvard Apparatus721017perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm IDHarvard Apparatus721019perfusate line leaving lung
Vannas-Tubingen Spring ScissorsFine Science Tools15008-08
VCM ventilator control module type 681Harvard Apparatus731741
William's E MediaGibco, ThermoFisher ScientificA12176-01Perfusate additive
Xylazine 100 mg per 1 mlAkorn

References

  1. Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2021 annual data report: Lung. Am J Transplant. 23, S379-S442 (2023).
  2. Gouchoe, D. A., et al. Ex vivo lung perfusion in donation after circulatory death: A post hoc analysis of the normothermic Ex Vivo lung perfusion as an assessment of extended/marginal donors lungs trial. J Thorac Cardiovasc Surg. , (2024).
  3. Bobba, C. M., et al. Trends in donation after circulatory death in lung transplantation in the United States: Impact of era. Transpl Int. 35, 10172 (2022).
  4. Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).
  5. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. N Engl J Med. 364 (15), 1431-1440 (2011).
  6. Cypel, M., Neyrinck, A., Machuca, T. N. Ex vivo perfusion techniques: state of the art and potential applications. Intens Care Med. 45 (3), 354-356 (2019).
  7. Gouchoe, D. A., et al. XPS™ Jensen lung as a low-cost, high-fidelity training adjunct to ex-vivo lung perfusion. Artif Organs. , (2023).
  8. Van Raemdonck, D., Rega, F., Rex, S., Neyrinck, A. Machine perfusion of thoracic organs. J Thorac Dis. 10, S910-S923 (2018).
  9. Andreasson, A. S., Dark, J. H., Fisher, A. J. Ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation--state of the art. Eur J Cardiothorac Surg. 46 (5), 779-788 (2014).
  10. Ahmad, K., Pluhacek, J. L., Brown, A. W. Ex vivo lung perfusion: A review of current and future application in lung transplantation. Pulm Ther. 8 (2), 149-165 (2022).
  11. Kim, J. L., et al. Biometric profiling to quantify lung injury through ex vivo lung perfusion following warm ischemia. Asaio j. 69 (8), e368-e375 (2023).
  12. Jeon, J. E., et al. Acellular ex vivo lung perfusate silences pro-inflammatory signaling in human lung endothelial and epithelial cells. J Transl Med. 21 (1), 729 (2023).
  13. Baciu, C., et al. Altered purine metabolism at reperfusion affects clinical outcome in lung transplantation. Thorax. 78 (3), 249-257 (2023).
  14. Peel, J. K., et al. Evaluating the impact of ex vivo lung perfusion on organ transplantation: A retrospective cohort study. Ann Surg. 278 (2), 288-296 (2023).
  15. Peel, J. K., et al. Determining the impact of ex vivo lung perfusion on hospital costs for lung transplantation: A retrospective cohort study. J Heart Lung Transpl. 42 (3), 356-367 (2023).
  16. Warnecke, G., et al. Normothermic ex vivo preservation with the portable Organ Care System Lung device for bilateral lung transplantation (INSPIRE): a randomised, open-label, non-inferiority, phase 3 study. Lancet Respir Med. 6 (5), 357-367 (2018).
  17. Loor, G., et al. Portable normothermic ex vivo lung perfusion, ventilation, and functional assessment with the Organ Care System on donor lung use for transplantation from extended-criteria donors (EXPAND): a single-arm, pivotal trial. Lancet Resp Med. 7 (11), 975-984 (2019).
  18. Loor, G., et al. Prolonged EVLP using OCS lung: Cellular and acellular perfusates. Transplantation. 101 (10), 2303-2311 (2017).
  19. Bansal, S., Biswas, G., Avadhani, N. G. Mitochondria-targeted heme oxygenase-1 induces oxidative stress and mitochondrial dysfunction in macrophages, kidney fibroblasts and in chronic alcohol hepatotoxicity. Redox Biol. 2, 273-283 (2014).
  20. Park, S., et al. Initial investigation on the feasibility of porcine red blood cells from genetically modified pigs as an alternative to human red blood cells for transfusion. Front Immunol. 14, 1298035 (2023).
  21. Ellingson, K. D., et al. Continued decline in blood collection and transfusion in the United States-2015. Transfusion. 57, 1588-1598 (2017).
  22. Cuddington, C. T., et al. Pilot scale production and characterization of next generation high molecular weight and tense quaternary state polymerized human hemoglobin. Biotechnol Bioeng. 119 (12), 3447-3461 (2022).
  23. Moore, E. E., et al. Human polymerized hemoglobin for the treatment of hemorrhagic shock when blood is unavailable: the USA multicenter trial. J Am Coll Surg. 208 (1), 1-13 (2009).
  24. Shonaka, T., et al. Impact of human-derived hemoglobin based oxygen vesicles as a machine perfusion solution for liver donation after cardiac death in a pig model. PLoS One. 14 (12), e0226183 (2019).
  25. Chen, G., Palmer, A. F. Hemoglobin-based oxygen carrier and convection enhanced oxygen transport in a hollow fiber bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102 (6), 1603-1612 (2009).
  26. Bucci, E., Kwansa, H., Koehler, R. C., Matheson, B. Development of zero-link polymers of hemoglobin, which do not extravasate and do not induce pressure increases upon infusion. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 35 (1), 11-18 (2007).
  27. Schaer, C. A., et al. Haptoglobin preserves vascular nitric oxide signaling during hemolysis. Am J Respir Crit Care Med. 193 (10), 1111-1122 (2016).
  28. Muller, C. R., et al. Safety and efficacy of human polymerized hemoglobin on guinea pig resuscitation from hemorrhagic shock. Sci Rep. 12 (1), 20480 (2022).
  29. Greenfield, A., et al. Biophysical analysis and preclinical pharmacokinetics-pharmacodynamics of tangential flow filtration fractionated polymerized human hemoglobin as a red blood cell substitute. Biomacromolecules. 24 (4), 1855-1870 (2023).
  30. Cuddington, C., et al. Polymerized human hemoglobin-based oxygen carrier preserves lung allograft function during normothermic ex vivo lung perfusion. Asaio j. , (2024).
  31. Cabrales, P., et al. Effects of the molecular mass of tense-state polymerized bovine hemoglobin on blood pressure and vasoconstriction. J Appl Physiol. 107 (5), 1548-1558 (2009).
  32. Baek, J. H., et al. Down selection of polymerized bovine hemoglobins for use as oxygen releasing therapeutics in a guinea pig model. Toxicol Sci. 127 (2), 567-581 (2012).
  33. Williams, A. T., et al. Resuscitation from hemorrhagic shock with fresh and stored blood and polymerized hemoglobin. Shock. 54 (4), 464-473 (2020).
  34. Muller, C. R., et al. Resuscitation from hemorrhagic shock after traumatic brain injury with polymerized hemoglobin. Sci Rep. 11 (1), 2509 (2021).
  35. Lamb, D. R., et al. The molecular size of bioengineered oxygen carriers determines tissue oxygenation in a hypercholesterolemia guinea pig model of hemorrhagic shock and resuscitation. Mol Pharm. 20 (11), 5739-5752 (2023).
  36. Bobba, C. M., et al. A novel negative pressure-flow waveform to ventilate lungs for normothermic ex vivo lung perfusion. Asaio j. 67 (1), 96-103 (2021).
  37. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. J Vis Exp. (96), e52309 (2015).
  38. Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), 7-15 (2014).
  39. Wong, A., et al. Potential therapeutic targets for lung repair during human ex vivo lung perfusion. Eur Respir J. 55 (4), 1902222 (2020).
  40. Machuca, T. N., et al. The role of the endothelin-1 pathway as a biomarker for donor lung assessment in clinical ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transpl. 34 (6), 849-857 (2015).
  41. Gouchoe, D. A., et al. Mitsugumin 53 Mitigation of ischemia reperfusion injury in a mouse model. J Thorac Cardiovasc Surg. 10, (2023).
  42. Gouchoe, D. A., Whitson, B. A., Zhu, H. The next frontier in lung transplantation: Protecting the endothelium and repairing organs for transplant utilizing MG53. Clin Transl Dis. 3 (6), e255 (2023).
  43. Gouchoe, D. A., et al. MG53 mitigates warm ischemic lung injury in a murine model of transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg. , (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Ex Vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved