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摘要

在这里，我们描述了基于聚合人血红蛋白 （PolyhHb） 的氧载体作为灌注液的应用，以及可以在大鼠 离体 肺灌注模型中测试该灌注溶液的方案。

摘要

由于缺乏合适的供体，肺移植受到阻碍。以前，被认为边缘或不充分的供体被丢弃。然而，令人兴奋的新技术，如 离体 肺灌注 （EVLP），为肺移植提供者提供了对边缘供体同种异体移植物的扩展评估。这个动态评估平台导致了肺移植的增加，并允许提供者使用以前被丢弃的供体，从而扩大了供体库。目前的灌注技术使用细胞或无细胞灌注，两者都有明显的优点和缺点。灌注组合物对于维持稳态环境、提供足够的代谢支持、减少炎症和细胞死亡以及最终改善器官功能至关重要。灌注溶液必须含有足够的蛋白质浓度以维持适当的渗透压。然而，目前的灌注溶液通常会导致液体通过肺内皮外渗，从而导致意外的肺水肿和损伤。因此，有必要开发新的灌注解决方案，以防止过度损伤，同时保持适当的细胞稳态。在这里，我们描述了基于聚合人血红蛋白 （PolyhHb） 的氧载体作为灌注液的应用，以及可以在大鼠 EVLP 模型中测试该灌注溶液的方案。本研究的目的是为肺移植界提供设计和开发新型灌注解决方案的关键信息，以及在临床相关的转化移植模型中测试它们的适当方案。

引言

与实体器官移植的任何领域一样，肺移植也存在供体器官短缺的问题。为了增加供体库，人们进行了大量研究，以调查曾经被认为不适合移植的同种异体移植物的潜力，即扩展标准供体 （ECD）。这些同种异体移植物可以被认为是 ECD，原因有很多，包括质量有问题、功能差、感染、创伤、长时间的热或冷缺血时间以及高龄 1,2。在某些情况下，如果这些肺适合立即移植3，则对提供者和接受者来说，多花点时间评估这些肺以确定它们是否适合移植通常是有利的。离体肺灌注 （EVLP） 是一种技术，允许在供体外部的封闭回路中对潜在的肺同种异体移植物进行扩展评估 2,4,5,6,7，使移植提供者能够确定移植的适用性。EVLP 已显示出充分评估供体器官 8,9,10,11，减少缺血再灌注损伤 （IRI） 的影响 12,13 并增加供体库14,15，从而使肺移植成为所有人更容易获得的治疗方法。

一般来说，EVLP 系统是一个封闭的系统，具有通气回路（通过将呼吸机连接到气管以将空气引入系统来实现）和血管回路（通过管道将左心房 （LA） 连接到肺动脉 （PA） 来实现）7。血管回路有灌注液流经管道，为肺部提供重要的营养和氧气，同时限制冷缺血时间 （CIT）5,8,16,17。该解决方案是基于血液的（即通过添加浓缩红细胞 （PRBC））16,17 或基于无细胞的（即无 PRBC）4,5。但是，使用 PRBC 有几个明显的缺点。如果使用来自因创伤而死亡的供体或脑死亡供体 （BDD） 的 PRBC，这些液体通常含有大量的炎性细胞因子，这可能会增加 EVLP 期间的细胞损伤，并增加游离血红蛋白 （Hb）、血红素、铁和细胞碎片的水平，从而对细胞造成额外损伤18,19.此外，由于这些供体通常是多器官的，因此在采购前收集 PRBC 可能导致供体的血容量减少，随后增加所有器官的缺血。如果使用其他来源的 PRBC，提供者可能会面临血液短缺，因为这本身就是一种稀缺材料20,21。最后，PRBC 容易在 EVLP 回路上发生机械裂解，无论其来源如何，都会释放 Hb 和其他导致细胞损伤的成分。

因此，出于多种原因，使用人工红细胞替代品，即基于血红蛋白的氧载体 （HBOC） 作为灌注液补充剂可能是有利的。一种特别有前途的 HBOC 是聚合人血红蛋白 （PolyhHb）。PolyhHb 是由被认为不适合立即输血的过期 PRBC 纯化的 Hb 合成的 22。它们已被证明是出血性休克23 和移植24 中可行的血液替代品，并且可以大量生产22。然而，由于血管收缩、血压升高和心脏骤停等不可预见的并发症，PolyhHb 的大规模采用未能成功23,25。这些发现背后的原因可能是由于 PolyhHb 溶液中存在无细胞 Hb 或低分子量 Hb 聚合物 （< 500 kDa），因为它们倾向于外渗到组织空间，从而导致一氧化氮可用性降低、随后的血管收缩、全身性高血压，并最终导致氧化性组织损伤26,27.为了改善这些问题，Palmer 实验室致力于开发下一代 PolyhHb，其中包含最少的低 MW 物质和无细胞 Hb，其生物物理特性和体内反应已得到改善 22,28,29,30。几项动物输血研究表明，如果从 HBOC 中消除低分子量 Hb 聚合物，则可以减轻血管收缩、全身性高血压和氧化损伤 28,29,31,32,33,34,35。因此，使这种下一代 PolyhHb 成为有前途的灌注液候选者。

在这里，我们描述了用于灌注液的下一代 PolyhHb 的应用，以及可以在大鼠 EVLP 模型中测试该灌注溶液的方案。本研究的目标是为肺移植界提供设计和开发新型灌注解决方案的关键信息，并提供在临床相关的转化移植模型中测试它们的方案。

研究方案

Sprague-Dawley 大鼠 （300 g 体重） 是商业获得的，并在无病原体的条件下饲养在俄亥俄州立大学韦克斯纳医学中心动物设施。所有程序均根据 NIH 和国家研究委员会的实验动物人道护理和使用指南，并经俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC 协议 2023A00000071）的批准以人道方式执行。

1. PolyhHb 合成和纯化

注：用于以下 EVLP 实验的 PolyhHb 材料的生产和合成最初由 Cuddington 等人于 2020年 22 发表。请参考这项工作以获得 PolyhHb 合成的深入示意图和分析。以下是中试规模 PolyhHb 的合成和纯化及其随后作为灌注液制备的总结。

  1. RBC 洗涤、裂解和 Hb 纯化
    1. 采购 18 单位过期的人 PRBC 并将它们倒入 20 L 过滤容器中，用 0.9 wt% 盐水稀释至最终血细胞比容为 22%（图 1B，C）。
    2. 在 RBC 溶液上用 0.9 wt% 盐水在 0.65 μm 改性聚乙烯砜 （mPES） 切向流过滤 （TFF） 模块上进行六次系统体积交换（diacycles）。注意：此洗涤步骤的目的是在溶血前去除受损的红细胞、膜碎片和其他细胞外物质（图 1B、C）。
    3. 用 10 L 磷酸盐缓冲液（PB，3.75 mM，pH 7.4）在 4 °C 下不断搅拌裂解 RBC 溶液 1 小时。
    4. 通过在 500 kDa TFF 模块上过滤溶液并在 30 L 间歇式反应器容器中收集渗透液，去除裂解的膜碎片和其他聚集体（图 1A-C）。
    5. 一旦 480 g Hb 进入反应器中，加入盐装料以将 PB 转化为磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
    6. 通过供氮的气体接触器再循环 Hb，并在反应器中保持氮气顶部空间，以在夜间对蛋白质进行脱氧。冷却至 14 °C 以限制高铁血红蛋白 （metHb） 的形成。
  2. Hb 聚合
    1. 将 Hb 溶液加热至生理温度 （37 °C），同时在气体接触器回路上再循环溶液。
      注意：目标是将蛋白质脱氧至 0-10 mmHg 之间的 pO2 ，以确保大部分 Hb 处于紧张的四元状态（图 1A）。
    2. 根据需要加入 1 g 连二亚硫酸钠，以确保有效脱氧。
    3. 在保持再循环回路和对 Hb 溶液进行脱气的同时，将戊二醛 （GA） 的摩尔比为 30：1 添加到用 3 L 脱氧 PBS （pH 7.4） 稀释的 Hb 中。
    4. 在 3 小时内将溶液添加到反应容器中，并额外增加一小时的反应时间。
    5. 用 7：1 摩尔比的氰基硼氢化钠与 GA 淬灭交联反应，在 3 L PBS （pH 7.4） 中稀释。加入反应器中 10 分钟以上。
    6. 将反应器在 14 °C 下冷却过夜。
  3. PolyhHb 纯化
    1. 将反应器内容物泵入 10 L 过滤容器中，并开始通过 0.2 μm 聚乙烯砜 （PES） TFF 模块（第 1 阶段）进行循环。此步骤将去除大聚集体和不需要的污染物。
    2. 将渗透液送入二级 10 L 过滤容器，该容器装满后将在 500 kDa 聚砜 （PS） TFF 模块（第 2 阶段）上循环。继续直到反应器排空（图 1B、D）。
    3. 反应器排空到纯化回路中后，在第 1 阶段用改良的乳酸林格氏液 （pH 7.4） 开始赋形剂交换。每次全体积交换后，使用紫外可见光谱法测量第 1 阶段渗透液中的蛋白质浓度。
    4. 当第 1 阶段渗透液的浓度低于 1 mg Hb/mL 时，将改性的林格氏溶液转移到第 2 阶段。第 1 阶段的任何滞留都是废物，应妥善处理。总的来说，确保在两个阶段中执行修改后的 Ringer 溶液的 12 次全体积交换。
    5. 透析周期完成后，将第 2 阶段的内容物浓缩至至少 10 g/dL 的 500 kDa TFF 模块中。
    6. 将浓缩溶液包装在 50 mL 锥形管中，并在 -80 °C 下储存直至使用。

2. 灌注液配方

  1. 将灌注液制备至最终体积为 165 mL。用 William's E 培养基将 PolyhHb 稀释至终浓度为 3.7 g/dL。
  2. 加入人血清白蛋白 （HSA） 至终浓度为 3% HSA（按重量计）。向最终溶液中加入 1 mL 肝素。

3. 体外 肺灌注回路设置

  1. 将 PolyhHb 灌注液放入 EVLP 回路储液器中，并将温水浴打开 37 °C。 通过打开滚轮泵，确保灌注液在回路内循环。
  2. 将脱氧气体（即 6% O2、8% CO2、84% N2）连接到中空纤维氧合器以对灌注液进行脱氧。这样做是为了评估肺对灌注液充氧的能力。
  3. 在附近的计算机上打开数据采集软件。确保肺动脉压、气管压差、呼吸血流压差、肺重量和泵速传感器连接到回路和数据转换器盒。
  4. 仔细检查所有管道连接，确保整个系统没有泄漏，并且温水在整个系统中循环（图 2）。在数据采集软件上按 运行 以确保所有压力传感器都正常工作。系统正常运行后，关闭滚轮泵。

4. 供体大鼠肺阻滞剂的采购

  1. 设置手术台并布置器械（图 3）。将所有仪器在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。
  2. 准备 1200 U/kg 肝素，用于麻醉的氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（60 mg/kg 氯胺酮和 5 mg/kg），以及 5-10 厘米长的丝线（3-0 或 4-0）。
  3. 将氯胺酮/甲苯噻嗪溶液腹膜内注射到大鼠体内。等待 5-10 分钟让麻醉平面发育。为确保适当的麻醉水平，用脚趾捏住大鼠以引起反应。如果没有反应，则已达到适当的麻醉水平。
  4. 剃掉大鼠的腹部，将大鼠置于手术板上的仰卧位。用聚维酮碘和 70% 乙醇清洁腹部。将眼药膏放在大鼠的眼睛下方以防止干燥。
  5. 将大鼠移至手术板上并将大鼠固定到位（图 4A）。打开数据采集软件并开始记录。以 4 mL/kg 的速度打开呼吸机，确保呼气末正压 （PEEP） 约为 2 cm/H2O。
    注意：这些初始设置是特定于实验的。所有研究人员都有责任为单个实验确定最佳通气策略。
  6. 一旦达到适当的麻醉深度，使用一把剪刀进行从剑突到耻骨联合的中线剖腹手术。接下来，进行内侧-外侧内脏旋转，并使用钝器械 （IVC） 36,37,38 可视化肝下腔静脉（图 4B）。用 20G 针头将肝素注射到 IVC 中（图 4C）。
  7. 将注意力转向颈部，用剪刀从胸骨切迹到下颌骨角度下方的皮肤。接下来，开始解剖气管（图 5A）。
  8. 在颈部，钝切开必要的带状肌肉以露出气管（图 5B）。用一把剪刀在软骨环之间的气管前部做一个横向切口，足够大，足以容纳气管内 （ET） 管（几毫米），但不要切开气管的后部。在气管周围放置 5-0 丝缝合线（图 5C）。
  9. 插入气管插管并用上述 5-0 丝缝合线将其固定到位（图 5D）。将 ET 管连接到呼吸机并确保胸部正确起伏。
  10. 进行正中胸骨切开术，并使用剪刀再次进入胸腔。放置胸壁牵开器以暴露心脏和肺（图 6A）。避免对肺部进行任何无意的操作，因为它们非常脆弱。
  11. 通过锋利（剪刀）和钝器解剖相结合，从前纵隔去除胸腺。小心不要损坏大血管或肺。
  12. 识别肺动脉 （PA; 图 6B）并在其周围放置 5-0 丝缝合线以准备插管（图 6C）。由于大鼠大血管的微观解剖结构，通常更容易同时将缝合线放在 PA 和主动脉周围。
  13. 使用一把剪刀在右心室流出道 （RVOT） 上做一个 2-3 毫米的切口（图 6D-E），将动脉插管放入 PA 内，并用前面描述的 5-0 缝合线将其固定到位（图 6F）。
  14. 用剪刀在左心室 （LV） 和肝下 IVC 上做一个 5 毫米的切口，对大鼠实施安乐死。快速将肺保存液连接到动脉插管，以重力冲洗约 20 mL（图 7A-B）。确保在将肺保留液连接到动脉插管之前将其脱气，因为空气栓塞对肺部的伤害很大。
  15. 将动脉插管连接到 EVLP 回路。打开滚轮泵，让少量灌注液流经肺部，从左心室流入胸腔。一旦灌注液开始从左心房流出，关闭滚轮泵（图 7C）。在允许灌注液流动时，确保 PA 压力不会飙升 - 这可能表明堵塞或放置不正确。
  16. 将小镊子放入 LV 中并轻轻拉伸二尖瓣环，这将允许引入左心房 （LA） 套管（图 8A）。将 5-0 的丝绸领带绕在心形周围并松散地系带（图 8B）。
  17. 将 LA 套管插入 LV 并推进 LA 套管，直到可以在心房内看到它。用预先打结的 5-0 缝合线完成固定 LA（图 8C）。
  18. 识别食道并用止血钳将其夹在尽可能靠近隔膜的位置。切开止血钳下方的食道，以确保没有溢出到胸腔中（图 9A）。
  19. 以脊柱为导向，用一把剪刀剪断所有将心肺阻滞连接到周围结构的韧带附件（图 9B）。一旦心肺阻滞可以自由移动，从颈部解剖气管，最后用剪刀剪断 ET 管上方的气管以释放心肺阻滞（图 9C）。
  20. 将心肺阻滞移动到 EVLP 电路内的胸套上，并将 LA 套管连接到 EVLP 回路（图 9D）。打开滚轮泵并连接呼吸机监视器。
  21. 检查气泡捕集器，确保没有空气栓塞进入系统。
  22. 在最初的 15 分钟内缓慢将通气和灌注设置更改为所需的实验水平 36,37,38。此外，在这个初始升温阶段，将灌注流速增加到所需的速率和/或压力。
  23. 在实验指定的时间点，检查灌注液气体水平以及肺功能测试。

结果

图 10 展示了我们基于 PolyhHb 的灌注液的验证，以及这种灌注液在数小时内的稳定性。在最初的 1 小时内，所有测试的灌注液 （PolyhHb，对照 （Williams Media + 5% HSA），基于 RBC）显示 LA pO2 （后 pO2） 略有降低。然而，与 PolyhHb 相比，基于 RBC 的灌注液在 1 小时时显示显着降低 （p < 0.05）。在接下来的几个小时内进行测试时，PolyhHb 和对?...

讨论

灌流解决方案的开发和测试是全球许多人都在进行的一项创新尝试。传统上，标准灌注液能够暂停缺血时间并减轻与缺血以及再灌注18 相关的损伤。然而，EVLP 的下一步发展是改进当前的灌注液技术，并结合修复和修复疗法 39,40,41,42,43。

披露声明

对于本文中介绍的材料，A.F.P.、A.G. 和 CC 是美国专利申请 PCT/US2022/041743 的发明人。A.F.P.、C.C.、B.A.W. 和 S.M.B. 是美国专利申请 PCT/US2023/017765 的发明人。

致谢

这项研究得到了 Jewel and Frank Benson Family Endowment 和 Jewel and Frank Benson 研究教授职位的慷慨支持。B.A.W. 得到了美国国立卫生研究院 （NIH） 资助R01HL143000的部分支持。AFP 得到了 NIH 赠款 R01HL126945、R01EB021926、R01HL131720 和 R01HL138116 以及美国陆军医学研究和物资司令部赠款 W81XWH1810059 的支持。SMB 由 NIH R01 DK123475 提供支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needleB-D309301
30 L Glass Batch BioreactorAce Glass
30g NeedleMed NeedlesBD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial TabletsElancoNA
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O)Sigma Aldrich10035-04-8For modified Ringer's lactate
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672Harvard Apparatus731747
Connect kit D150Cole-Parmer VK 73-3763
Dumont #5 ForcepsFine Science tools11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45°Fine Science tools11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Water HeaterLaudaLCK 1879
Expired human leukoreduced, packed RBC unitsWexner Medical Center
Canadian Blood Services
Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150Hugo Sachs ElektronikPY2 73-3762
ForcepsFine Science tools11027-12
Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%)Sigma Aldrich111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito HemostatRoboz SurgicalRS-7112
Heparin 30,000 units per 30 mlAPP Pharmaceuticals
Human Serum Albumin (HSA)OctaPharma PlasmaPerfusate additive
IL2 Tube set for perfusateHarvard Apparatus733842
IPL-2 Basic Lung Perfusion SystemHarvard Apparatus
Ketamine 500 mg per 5 mlJHP Pharmaceuticals
Left Atrium cannulaHarvard Apparatus730712
Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor3MG420gas contactor
low potassium dextran glucose solution (perfadex)XVIVOsolution flushing the lung
Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24)Cole-Palmer
N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S)Sigma Aldrich616-91-1 (A7250)For modified Ringer's lactate
Nalgene Vessels (10L, 20L)NalgeneFiltration vessels
Peristaltic Pump Ismatec ISM 827B
PES, 0.65 µm TFF moduleRepligenN02-E65U-07-N
PhysioSuiteKent Scientific CorporationPS-MSTAT-RT
polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF moduleRepligenN02-S20U-05-N
Polysulfone (PS), 500 kDa TFF moduleRepligenN02-P500-05-N
Potassium Chloride (KCl)Fisher Scientific7447-40-7For PBS
PowerLab 8/35 ADInstruments730045
Pulmonary Artery cannulaHarvard Apparatus730710
Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24)PharMed BPT
Puralube Ophthalmic OintmentDechraNA
ScissorsFine Science tools14090-11
SCP Servo controller for perfusion type 704Harvard Apparatus732806
Small Animal Ventilator model 683Harvard Apparatus55-000
Sodium Chloride (NaCl)Fisher Scientific7647-14-5 (S271-10)For PBS and saline
Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3)Sigma Aldrich25895-60-7
Sodium Dithionite (Na2S2O4)Sigma Aldrich7775-14-6
Sodium Hydroxide (NaOH)Fisher Scientific1310-73-2For modified Ringer's lactate
Sodium Lactate (NaC3H5O3)Sigma Aldrich867-56-1For modified Ringer's lactate
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)Fisher Scientific7558-79-4For PBS
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Fisher Scientific7558-80-7For PBS
SomnoSuite Small Animal Anesthesia SystemKent Scientific CorporationSS-MVG-Module
Sprague-Dawley ratsEnvigo
TAM-A transducer amplifier module type 705/1Harvard Apparatus73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2Harvard Apparatus 73-1793
TCM time control module type 686Harvard Apparatus731750
Tracheal cannulaHarvard Apparatus733557
Tube set for moist chamberHarvard Apparatus 73V83157
Tubing CassetteCole-ParmerIS 0649
Tweezer #5 DumostarKent Scientific Corporation INS500085-A
Tweezer #5 stainless steel, curvedKent Scientific CorporationIND500232
Tweezer #7 TitaniumKent Scientific Corporation INS600187
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm IDHarvard Apparatus721017perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm IDHarvard Apparatus721019perfusate line leaving lung
Vannas-Tubingen Spring ScissorsFine Science Tools15008-08
VCM ventilator control module type 681Harvard Apparatus731741
William's E MediaGibco, ThermoFisher ScientificA12176-01Perfusate additive
Xylazine 100 mg per 1 mlAkorn

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