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在大鼠离体肺灌注模型中使用下一代聚合基于血红蛋白的氧载体探索替代灌注解决方案
* 这些作者具有相同的贡献
摘要
在这里，我们描述了基于聚合人血红蛋白 （PolyhHb） 的氧载体作为灌注液的应用，以及可以在大鼠 离体 肺灌注模型中测试该灌注溶液的方案。
摘要
由于缺乏合适的供体，肺移植受到阻碍。以前，被认为边缘或不充分的供体被丢弃。然而，令人兴奋的新技术，如 离体 肺灌注 （EVLP），为肺移植提供者提供了对边缘供体同种异体移植物的扩展评估。这个动态评估平台导致了肺移植的增加，并允许提供者使用以前被丢弃的供体，从而扩大了供体库。目前的灌注技术使用细胞或无细胞灌注，两者都有明显的优点和缺点。灌注组合物对于维持稳态环境、提供足够的代谢支持、减少炎症和细胞死亡以及最终改善器官功能至关重要。灌注溶液必须含有足够的蛋白质浓度以维持适当的渗透压。然而，目前的灌注溶液通常会导致液体通过肺内皮外渗，从而导致意外的肺水肿和损伤。因此，有必要开发新的灌注解决方案，以防止过度损伤，同时保持适当的细胞稳态。在这里，我们描述了基于聚合人血红蛋白 （PolyhHb） 的氧载体作为灌注液的应用，以及可以在大鼠 EVLP 模型中测试该灌注溶液的方案。本研究的目的是为肺移植界提供设计和开发新型灌注解决方案的关键信息，以及在临床相关的转化移植模型中测试它们的适当方案。
引言
与实体器官移植的任何领域一样，肺移植也存在供体器官短缺的问题。为了增加供体库，人们进行了大量研究，以调查曾经被认为不适合移植的同种异体移植物的潜力，即扩展标准供体 （ECD）。这些同种异体移植物可以被认为是 ECD，原因有很多，包括质量有问题、功能差、感染、创伤、长时间的热或冷缺血时间以及高龄 1,2。在某些情况下，如果这些肺适合立即移植3，则对提供者和接受者来说，多花点时间评估这些肺以确定它们是否适合移植通常是有利的。离体肺灌注 （EVLP） 是一种技术，允许在供体外部的封闭回路中对潜在的肺同种异体移植物进行扩展评估 2,4,5,6,7，使移植提供者能够确定移植的适用性。EVLP 已显示出充分评估供体器官 8,9,10,11，
研究方案
Sprague-Dawley 大鼠 （300 g 体重） 是商业获得的，并在无病原体的条件下饲养在俄亥俄州立大学韦克斯纳医学中心动物设施。所有程序均根据 NIH 和国家研究委员会的实验动物人道护理和使用指南，并经俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC 协议 2023A00000071）的批准以人道方式执行。
1. PolyhHb 合成和纯化
注：用于以下 EVLP 实验的 PolyhHb 材料的生产和合成最初由 Cuddington 等人于 2020年 22 发表。请参考这项工作以获得 PolyhHb 合成的深入示意图和分析。以下是中试规模 PolyhHb 的合成和纯化及其随后作为灌注液制备的总结。
- RBC 洗涤、裂解和 Hb 纯化
- 采购 18 单位过期的人 PRBC 并将它们倒入 20 L 过滤容器中，用 0.9 wt% 盐水稀释至最终血细胞比容为 22%（图 1B，C）。
- 在 RBC 溶液上用 0.9 wt% 盐水在 0.65 μm 改性聚乙烯砜 （mPES） 切向流过滤 （TFF） 模块上进行六次系统体积交换....
代表性结果
图 10 展示了我们基于 PolyhHb 的灌注液的验证，以及这种灌注液在数小时内的稳定性。在最初的 1 小时内，所有测试的灌注液 （PolyhHb，对照 （Williams Media + 5% HSA），基于 RBC）显示 LA pO2 （后 pO2） 略有降低。然而，与 PolyhHb 相比，基于 RBC 的灌注液在 1 小时时显示显着降低 （p < 0.05）。在接下来的几个小时内进行测试时，PolyhHb 和对?.......
讨论
灌流解决方案的开发和测试是全球许多人都在进行的一项创新尝试。传统上，标准灌注液能够暂停缺血时间并减轻与缺血以及再灌注18 相关的损伤。然而，EVLP 的下一步发展是改进当前的灌注液技术，并结合修复和修复疗法 39,40,41,42,43。
披露声明
对于本文中介绍的材料，A.F.P.、A.G. 和 CC 是美国专利申请 PCT/US2022/041743 的发明人。A.F.P.、C.C.、B.A.W. 和 S.M.B. 是美国专利申请 PCT/US2023/017765 的发明人。
致谢
这项研究得到了 Jewel and Frank Benson Family Endowment 和 Jewel and Frank Benson 研究教授职位的慷慨支持。B.A.W. 得到了美国国立卫生研究院 （NIH） 资助R01HL143000的部分支持。AFP 得到了 NIH 赠款 R01HL126945、R01EB021926、R01HL131720 和 R01HL138116 以及美国陆军医学研究和物资司令部赠款 W81XWH1810059 的支持。SMB 由 NIH R01 DK123475 提供支持。
....材料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle | B-D | 309301 | |
| 30 L Glass Batch Bioreactor | Ace Glass | ||
| 30g Needle | Med Needles | BD-305106 | |
| Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets | Elanco | NA | |
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma Aldrich | 10035-04-8 | For modified Ringer's lactate |
| CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 | Harvard Apparatus | 731747 | |
| Connect kit D150 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11252-50 | |
| Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45° | Fine Science tools | 11253-25 | |
| Ecoline Star Edition 003, E100 Water Heater | Lauda | LCK 1879 | |
| Expired human leukoreduced, packed RBC units | Wexner Medical Center Canadian Blood Services Zen-Bio Inc | ||
| Fiberoxygenator D150 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
| Forceps | Fine Science tools | 11027-12 | |
| Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%) | Sigma Aldrich | 111-30-8 (G7776) | |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Roboz Surgical | RS-7112 | |
| Heparin 30,000 units per 30 ml | APP Pharmaceuticals | ||
| Human Serum Albumin (HSA) | OctaPharma Plasma | Perfusate additive | |
| IL2 Tube set for perfusate | Harvard Apparatus | 733842 | |
| IPL-2 Basic Lung Perfusion System | Harvard Apparatus | ||
| Ketamine 500 mg per 5 ml | JHP Pharmaceuticals | ||
| Left Atrium cannula | Harvard Apparatus | 730712 | |
| Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor | 3M | G420 | gas contactor |
| low potassium dextran glucose solution (perfadex) | XVIVO | solution flushing the lung | |
| Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24) | Cole-Palmer | ||
| N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S) | Sigma Aldrich | 616-91-1 (A7250) | For modified Ringer's lactate |
| Nalgene Vessels (10L, 20L) | Nalgene | Filtration vessels | |
| Peristaltic Pump | Ismatec | ISM 827B | |
| PES, 0.65 µm TFF module | Repligen | N02-E65U-07-N | |
| PhysioSuite | Kent Scientific Corporation | PS-MSTAT-RT | |
| polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF module | Repligen | N02-S20U-05-N | |
| Polysulfone (PS), 500 kDa TFF module | Repligen | N02-P500-05-N | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For PBS |
| PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
| Pulmonary Artery cannula | Harvard Apparatus | 730710 | |
| Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24) | PharMed BPT | ||
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | NA | |
| Scissors | Fine Science tools | 14090-11 | |
| SCP Servo controller for perfusion type 704 | Harvard Apparatus | 732806 | |
| Small Animal Ventilator model 683 | Harvard Apparatus | 55-000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 7647-14-5 (S271-10) | For PBS and saline |
| Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3) | Sigma Aldrich | 25895-60-7 | |
| Sodium Dithionite (Na2S2O4) | Sigma Aldrich | 7775-14-6 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | 1310-73-2 | For modified Ringer's lactate |
| Sodium Lactate (NaC3H5O3) | Sigma Aldrich | 867-56-1 | For modified Ringer's lactate |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | 7558-79-4 | For PBS |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Fisher Scientific | 7558-80-7 | For PBS |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-MVG-Module | |
| Sprague-Dawley rats | Envigo | ||
| TAM-A transducer amplifier module type 705/1 | Harvard Apparatus | 73-0065 | |
| TAM-D transducer amplifier type 705/2 | Harvard Apparatus | 73-1793 | |
| TCM time control module type 686 | Harvard Apparatus | 731750 | |
| Tracheal cannula | Harvard Apparatus | 733557 | |
| Tube set for moist chamber | Harvard Apparatus | 73V83157 | |
| Tubing Cassette | Cole-Parmer | IS 0649 | |
| Tweezer #5 Dumostar | Kent Scientific Corporation | INS500085-A | |
| Tweezer #5 stainless steel, curved | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
| Tweezer #7 Titanium | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
| Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID | Harvard Apparatus | 721017 | perfusate line entering lung |
| Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID | Harvard Apparatus | 721019 | perfusate line leaving lung |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| VCM ventilator control module type 681 | Harvard Apparatus | 731741 | |
| William's E Media | Gibco, ThermoFisher Scientific | A12176-01 | Perfusate additive |
| Xylazine 100 mg per 1 ml | Akorn |
参考文献
- Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2021 annual data report: Lung. Am J Transplant. 23, S379-S442 (2023).
- Gouchoe, D. A., et al. Ex vivo l....
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