Esplorazione di soluzioni alternative di perfusione utilizzando vettori di ossigeno polimerizzati a base di emoglobina di nuova generazione in un modello di perfusione polmonare ex vivo di ratto

Riepilogo

Qui, descriviamo l'applicazione di un vettore di ossigeno polimerizzato a base di emoglobina umana (PolyhHb) come perfusato e il protocollo in cui questa soluzione di perfusione può essere testata in un modello di perfusione polmonare ex vivo di ratto.

Abstract

Il trapianto di polmone è ostacolato dalla mancanza di donatori idonei. In precedenza, i donatori ritenuti marginali o inadeguati venivano scartati. Tuttavia, nuove ed entusiasmanti tecnologie, come la perfusione polmonare ex vivo (EVLP), offrono ai fornitori di trapianti di polmone una valutazione estesa per gli allotrapianti di donatori marginali. Questa piattaforma di valutazione dinamica ha portato a un aumento dei trapianti di polmone e ha permesso ai fornitori di utilizzare donatori precedentemente scartati, ampliando così il pool di donatori. Le attuali tecniche di perfusione utilizzano perfusi cellulari o acellulari ed entrambi presentano vantaggi e svantaggi distinti. La composizione della perfusione è fondamentale per mantenere un ambiente omeostatico, fornire un adeguato supporto metabolico, ridurre l'infiammazione e la morte cellulare e, in ultima analisi, migliorare la funzione degli organi. Le soluzioni di perfusione devono contenere una concentrazione proteica sufficiente a mantenere un'adeguata pressione oncotica. Tuttavia, le attuali soluzioni di perfusione spesso portano a stravaso di liquidi attraverso l'endotelio polmonare, con conseguente edema polmonare involontario e danno. Pertanto, è necessario sviluppare nuove soluzioni di perfusione che prevengano danni eccessivi mantenendo una corretta omeostasi cellulare. Qui, descriviamo l'applicazione di un vettore di ossigeno a base di emoglobina umana polimerizzata (PolyhHb) come perfusato e il protocollo in cui questa soluzione di perfusione può essere testata in un modello di EVLP di ratto. L'obiettivo di questo studio è fornire alla comunità dei trapianti di polmone informazioni chiave nella progettazione e nello sviluppo di nuove soluzioni di perfusione, nonché i protocolli appropriati per testarle in modelli di trapianto traslazionale clinicamente rilevanti.

Introduzione

Come ogni campo del trapianto di organi solidi, il trapianto di polmone soffre di una carenza di organi da donatori. Al fine di aumentare il pool di donatori, è stata dedicata una ricerca significativa allo studio del potenziale degli allotrapianti che una volta si pensava non fossero adatti al trapianto, ovvero i donatori con criteri estesi (ECD). Questi allotrapianti possono essere considerati ECD per una serie di motivi, tra cui qualità discutibile, scarsa funzionalità, infezione, traumi, periodi ischemici caldi o freddi prolungati ed età avanzata^{di 1,2} anni. In alcuni casi, in cui questi polmoni sono adatti per il trapianto immediato³, è spesso vantaggioso sia per i fornitori che per i riceventi valutare questi polmoni per un ulteriore periodo di tempo per determinare la loro idoneità al trapianto. La perfusione polmonare ex vivo (EVLP) è una tecnologia che consente una valutazione estesa dei potenziali allotrapianti polmonari in un circuito chiuso al di fuori del donatore 2,4,5,6,7, offrendo al fornitore del trapianto la possibilità di determinare l'idoneità al trapianto. L'EVLP ha dimostrato la capacità di valutare adeguatamente gli organi dei donatori 8,9,10,11, di ridurre gli effetti del danno da riperfusione ischemica (IRI)^12,13 e di aumentare il pool di donatori^14,15, rendendo così il trapianto di polmone un trattamento più accessibile per tutti.

In generale, un sistema EVLP è un sistema chiuso con un circuito ventilatorio (ottenuto collegando un ventilatore alla trachea per introdurre aria nel sistema) e un circuito vascolare (ottenuto collegando l'atrio sinistro (LA) all'arteria polmonare (PA) con un tubo)⁷. Il circuito vascolare ha il perfusato che scorre attraverso il tubo per fornire al polmone nutrienti vitali e ossigeno, limitando al contempo il tempo ischemico freddo (CIT)5,8,16,17. Questa soluzione è a base ematica (cioè tramite l'aggiunta di globuli rossi concentrati (PRBC))^16,17 o acellulare (cioè senza PRBC)^4,5. Tuttavia, ci sono diversi svantaggi notevoli nell'utilizzo dei PRBC. Se si utilizzano PRBC da donatori deceduti a causa di traumi o donatori cerebralmente morti (BDD), questi fluidi contengono spesso grandi quantità di citochine infiammatorie, che possono aumentare il danno cellulare durante l'EVLP e aumentare i livelli di emoglobina libera da cellule (Hb), eme, ferro e frammenti cellulari che infliggono ulteriori danni alle cellule^18,19. Inoltre, poiché questi donatori sono spesso multiorgano, la raccolta di PRBC prima dell'approvvigionamento potrebbe portare a una diminuzione del volume di sangue nel donatore e successivamente ad un aumento dell'ischemia in tutti gli organi. Se si utilizzano PRBC da un'altra fonte, i fornitori potrebbero affrontare carenze di sangue poiché questo è un materiale scarso in sé e per sé^20,21. Infine, i PRBC sono inclini alla lisi meccanica sul circuito EVLP indipendentemente dalla loro fonte, rilasciando Hb e altri componenti che contribuiscono al danno cellulare.

Pertanto, per molte ragioni, potrebbe essere vantaggioso utilizzare un sostituto artificiale dei globuli rossi, cioè i trasportatori di ossigeno a base di emoglobina (HBOC), come integratore di perfusato. Un HBOC particolarmente promettente è l'emoglobina umana polimerizzata (PolyhHb). Il polihHb è sintetizzato a partire da Hb purificato da PRBC scaduti che sono stati ritenuti non idonei alla trasfusione immediata²². Hanno dimostrato di essere validi sostituti del sangue nello shock emorragico²³ e nel trapianto²⁴ e possono essere prodotti in grandi quantitಲ. Tuttavia, l'adozione su larga scala di PolyhHb non ha avuto successo a causa di complicazioni impreviste come la vasocostrizione, l'aumento della pressione sanguigna e l'arresto cardiaco^23,25. Le ragioni alla base di questi risultati erano probabilmente dovute alla presenza di Hb libero da cellule o polimeri di Hb a basso peso molecolare (< 500 kDa) nella soluzione di PolyhHb, poiché hanno una propensione a stravasare nello spazio tissutale, con conseguente diminuzione della disponibilità di ossido nitrico, conseguente vasocostrizione, ipertensione sistemica e, infine, danno ossidativo del tessuto^26,27. Per migliorare questi problemi, il Palmer Laboratory ha lavorato allo sviluppo di una nuova generazione di PolyhHb che contiene specie minime a basso MW e Hb priva di cellule, che ha dimostrato caratteristiche biofisiche migliorate e risposte in vivo 22,28,29,30. Diversi studi trasfusionali sugli animali hanno dimostrato che se i polimeri di Hb a basso peso molecolare vengono eliminati dall'HBOC, la vasocostrizione, l'ipertensione sistemica e il danno ossidativo possono essere mitigati 28,29,31,32,33,34,35. Pertanto, questo PolyhHb di nuova generazione è un promettente candidato perfusato.

Qui, descriviamo l'applicazione di un PolyhHb di nuova generazione da utilizzare in un perfusato e il protocollo con cui questa soluzione di perfusione può essere testata in un modello di EVLP di ratto. L'obiettivo di questo studio è fornire alla comunità dei trapianti di polmone informazioni chiave nella progettazione e nello sviluppo di nuove soluzioni di perfusione, nonché fornire protocolli per testarle in modelli di trapianto traslazionale clinicamente rilevanti.

Protocollo

I ratti Sprague-Dawley (300 g di peso corporeo) sono stati ottenuti commercialmente e ospitati in condizioni prive di agenti patogeni presso l'Ohio State University Wexner Medical Center Animal Facility. Tutte le procedure sono state eseguite umanamente secondo il NIH e la Guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura e l'uso umano degli animali da laboratorio e con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Ohio State University (Protocollo IACUC 2023A00000071).

1. Sintesi e purificazione del polihHb

NOTA: La produzione e la sintesi del materiale PolyhHb utilizzato per i seguenti esperimenti EVLP sono state inizialmente pubblicate da Cuddington et al. nel 2020²². Si prega di fare riferimento a questo lavoro per schemi approfonditi e analisi della sintesi di PolyhHb. Quello che segue è un riassunto della sintesi e purificazione del PolyhHb su scala pilota e della sua successiva preparazione come perfusato.

1. Lavaggio, lisi e purificazione dell'Hb con globuli rossi
   1. Procurarsi 18 unità di PRBC umani scaduti e versarle in un recipiente di filtrazione da 20 L, diluire con soluzione fisiologica allo 0,9% in peso fino a un ematocrito finale del 22% (Figura 1B, C).
   2. Esecuzione di sei scambi di volume del sistema (diacicli) su un modulo di filtrazione a flusso tangenziale (TFF) in polietilene solfone modificato (mPES) da 0,65 μm con soluzione salina allo 0,9% in peso sulla soluzione di globuli rossi. NOTA: Lo scopo di questa fase di lavaggio è quello di rimuovere i globuli rossi danneggiati, i frammenti di membrana e altri materiali extracellulari prima dell'emolisi (Figura 1B, C).
   3. Lisi la soluzione di globuli rossi con 10 L di tampone fosfato (PB, 3,75 mM, pH 7,4) per 1 ora a 4 °C agitando costantemente.
   4. Rimuovere i frammenti di membrana lisata e altri aggregati filtrando la soluzione su un modulo TFF da 500 kDa e raccogliendo il permeato nel recipiente del reattore batch da 30 L (Figura 1A-C).
   5. Una volta che 480 g di Hb sono nel reattore, aggiungere una carica di sale per convertire il PB in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   6. Ricircolare l'Hb attraverso un contattore di gas alimentato con azoto, oltre a mantenere uno spazio di testa dell'azoto nel reattore, per deossigenare la proteina durante la notte. Raffreddare a 14 °C per limitare la formazione di metaemoglobina (metHb).
2. Polimerizzazione Hb
   1. Riscaldare la soluzione di Hb alla temperatura fisiologica (37 °C) mentre si fa ricircolare la soluzione su un circuito di contattore del gas.
      NOTA: L'obiettivo è quello di deossigenare la proteina a un pO₂ tra 0-10 mmHg per garantire che la maggior parte dell'Hb sia nello stato quaternario teso (Figura 1A).
   2. Aggiungere 1 g di carica di ditionito di sodio, se necessario, per garantire un'efficace deossigenazione.
   3. Mantenendo il circuito di ricircolo e degassando la soluzione di Hb, aggiungere un rapporto molare 30:1 di glutaraldeide (GA) a Hb diluito in 3 L di PBS deossigenato (pH 7,4).
   4. Aggiungere la soluzione al recipiente del reattore nell'arco di 3 ore con un'ora aggiuntiva di tempo di reazione.
   5. Estinguere la reazione di reticolazione con un rapporto molare 7:1 di cianoboroidruro di sodio a GA, diluito in 3 L di PBS (pH 7,4). Aggiungere al reattore per oltre 10 min.
   6. Raffreddare il reattore a 14 °C durante la notte.
3. Purificazione di PolyhHb
   1. Pompare il contenuto del reattore in un recipiente di filtrazione da 10 L e iniziare la circolazione attraverso un modulo TFF in polietilene solfone (PES) da 0,2 μm (Stage 1). Questa fase rimuoverà gli aggregati di grandi dimensioni e i contaminanti indesiderati.
   2. Alimentare il permeato in un recipiente di filtrazione secondario da 10 L che, una volta pieno, farà circolare su un modulo TFF in polisulfone (PS) da 500 kDa (Fase 2). Continuare fino a svuotare il reattore (Figura 1B, D).
   3. Una volta che il reattore è stato svuotato nel circuito di purificazione, iniziare lo scambio dell'eccipiente allo stadio 1 con una soluzione di Ringer lattato modificata (pH 7,4). Dopo ogni scambio di volume completo, misurare la concentrazione di proteine nel permeato dello Stadio 1 utilizzando la spettroscopia UV-visibile.
   4. Quando il permeato di stadio 1 ha una concentrazione inferiore a 1 mg di Hb/mL, trasferire la soluzione di Ringer modificata allo stadio 2. Qualsiasi rapina nella fase 1 è un rifiuto e deve essere smaltita in modo appropriato. In totale, assicurarsi che vengano eseguiti 12 scambi di volumi completi della soluzione di Ringer modificata in entrambe le fasi.
   5. Dopo il completamento dei diacicli, concentrare il contenuto della Fase 2 ad almeno 10 g/dL sul modulo TFF da 500 kDa.
   6. Confezionare la soluzione concentrata in provette coniche da 50 mL e conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.

2. Formulazione in perfusato

1. Preparare il perfusato fino a un volume finale di 165 ml. Diluire PolyhHb a una concentrazione finale di 3,7 g/dL con William's E Medium.
2. Aggiungere albumina sierica umana (HSA) a una concentrazione finale del 3% di HSA in peso. Aggiungere 1 mL di eparina alla soluzione finale.

3. Configurazione del circuito di perfusione polmonare Ex Vivo

1. Posizionare PolyhHb perfusato nel serbatoio del circuito EVLP e aprire il bagno di acqua calda a 37 °C. Assicurarsi che il perfusato circoli all'interno del circuito accendendo le pompe a rulli.
2. Collegare il gas di deossigenazione (cioè 6% O₂, 8% CO₂, 84% N₂) all'ossigenatore a fibra cava per deossigenare il perfusato. Questo viene fatto per valutare la capacità del polmone di ossigenare il perfusato.
3. Aprire il software di acquisizione dati su un computer nelle vicinanze. Assicurarsi che la pressione dell'arteria polmonare, la pressione differenziale tracheale, la pressione differenziale del flusso respiratorio, il peso polmonare e i trasduttori di velocità della pompa siano collegati sia al circuito che alla scatola del convertitore dati.
4. Assicurarsi che non siano presenti perdite in tutto il sistema esaminando attentamente tutti i collegamenti dei tubi e che l'acqua calda circoli ovunque (Figura 2). Premere Esegui sul software di acquisizione dati per assicurarsi che tutti i trasduttori di pressione funzionino. Una volta che il sistema funziona correttamente, spegnere le pompe a rulli.

4. Approvvigionamento di blocco polmonare di ratto da donatore

1. Impostare il tavolo operatorio e disporre gli strumenti (Figura 3). Autoclavare tutti gli strumenti a 121 °C per 30 min.
2. Preparare 1200 U/kg di eparina, una miscela di ketamina/xilazina per anestetico (60 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg), nonché suture di seta lunghe 5-10 cm (3-0 o 4-0).
3. Iniettare la soluzione di ketamina/xilazina per via intraperitoneale nel ratto. Attendere 5-10 minuti affinché il piano anestetico si sviluppi. Per garantire un livello adeguato di anestesia, pizzicare il ratto per provocare una reazione. Se non c'è reazione, è stato raggiunto il livello corretto di anestesia.
4. Radere l'addome del ratto e posizionare il ratto in posizione supina sulla tavola chirurgica. Pulire l'addome con iodio povidone ed etanolo al 70%. Metti un unguento oftalmico sotto gli occhi del ratto per prevenire la secchezza.
5. Spostare il ratto sulla tavola chirurgica e fissarlo in posizione (Figura 4A). Attiva il software di acquisizione dati e inizia la registrazione. Accendere il ventilatore a 4 ml/kg e assicurarsi che la pressione positiva di fine espirazione (PEEP) sia di circa 2 cm/H₂O.
   NOTA: Queste impostazioni iniziali sono specifiche dell'esperimento. Spetta a tutti i ricercatori determinare le migliori strategie ventilatorie per i singoli esperimenti.
6. Una volta raggiunta la corretta profondità dell'anestesia, eseguire una laparotomia della linea mediana dal processo xifoideo alla sinfisi pubica utilizzando un paio di forbici. Successivamente, eseguire una rotazione viscerale mediale-laterale e visualizzare la vena cava inferiore infra-epatica utilizzando uno strumento smussato (IVC)36,37,38 (Figura 4B). Iniettare l'eparina nell'IVC con un ago da 20G (Figura 4C).
7. Sposta l'attenzione sul collo e taglia la pelle dalla tacca sternale fino a poco sotto l'angolo della mandibola con un paio di forbici. Quindi, inizia a sezionare verso la trachea (Figura 5A).
8. Nel collo, sezionare senza mezzi termini i muscoli della cinghia necessari per esporre la trachea (Figura 5B). Praticare un'incisione trasversale con un paio di forbici sulla trachea anteriore tra gli anelli cartilaginei abbastanza grandi per il tubo endotracheale (ET) (diversi millimetri), ma non tagliare la parte posteriore della trachea. Posizionare una sutura di seta 5-0 attorno alla trachea (Figura 5C).
9. Inserire il tubo endotracheale e fissarlo in posizione con la suddetta sutura di seta 5-0 (Figura 5D). Collegare il tubo ET al ventilatore e assicurarsi che il torace si alzi correttamente.
10. Eseguire una sternotomia mediana ed entrare nuovamente nella cavità toracica usando le forbici. Posizionare i divaricatori della parete toracica per esporre il cuore e i polmoni (Figura 6A). Evita qualsiasi manipolazione involontaria dei polmoni, poiché sono incredibilmente friabili.
11. Rimuovere il timo dal mediastino anteriore con una combinazione di dissezione affilata (forbice) e smussata. Fare attenzione a non danneggiare i grandi vasi o i polmoni.
12. Identificare l'arteria polmonare (PA; Figura 6B) e posizionare una sutura di seta 5-0 attorno ad essa per prepararsi all'incannulamento (Figura 6C). A causa dell'anatomia microscopica dei grandi vasi del ratto, è spesso più facile posizionare la sutura attorno all'AP e all'aorta allo stesso tempo.
13. Praticare un'incisione di 2-3 mm nel percorso di efflusso ventricolare destro (RVOT) utilizzando un paio di forbici (Figura 6D-E) per posizionare la cannula arteriosa all'interno del PA e fissarla in posizione con la sutura 5-0 descritta un passaggio prima (Figura 6F).
14. Praticare un'incisione di 5 mm nel ventricolo sinistro (LV) e nell'IVC infraepatica utilizzando un paio di forbici per sopprimere il ratto. Collegare rapidamente il liquido di conservazione polmonare alla cannula arteriosa per gravità, lavare i polmoni con circa 20 ml (Figura 7A-B). Assicurarsi che il liquido di conservazione polmonare sia disaerato prima di collegarlo alla cannula arteriosa poiché gli emboli d'aria sono molto dannosi per i polmoni.
15. Collegare la cannula arteriosa al circuito EVLP. Accendere la pompa a rulli e lasciare che una piccola quantità di perfusato fluisca attraverso il polmone e fuori dal ventricolo sinistro nella cavità toracica. Una volta che il perfusato inizia a fuoriuscire dall'atrio sinistro, spegnere la pompa a rulli (Figura 7C). Pur consentendo il flusso del perfusato, assicurarsi che la pressione PA non aumenti, il che indicherebbe un blocco o un posizionamento errato.
16. Posizionare una piccola pinza nel ventricolo sinistro e allungare delicatamente l'anulus della valvola mitrale, che consentirà l'introduzione della cannula dell'atrio sinistro (LA) (Figura 8A). Metti una cravatta di seta 5-0 intorno al cuore e legala senza stringere (Figura 8B).
17. Inserire la cannula LA nel ventricolo sinistro e far avanzare la cannula LA fino a quando non può essere vista all'interno dell'atrio. Terminare il fissaggio del LA con la sutura 5-0 pre-legata (Figura 8C).
18. Identificare l'esofago e bloccarlo con un emostatico il più vicino possibile al diaframma. Tagliare l'esofago sotto l'emostatico per assicurarsi che non vi siano fuoriuscite nella cavità toracica (Figura 9A).
19. Utilizzando la colonna vertebrale come guida, tagliare con un paio di forbici tutti gli attacchi legamentosi che collegano il blocco cuore-polmone alle strutture circostanti (Figura 9B). Una volta che il blocco cuore-polmone è liberamente mobile, sezionare la trachea dal collo e infine tagliare la trachea sopra il tubo ET usando un paio di forbici per liberare il blocco cuore-polmone (Figura 9C).
20. Spostare il blocco cuore-polmone sulla camicia toracica all'interno del circuito EVLP e collegare la cannula LA al circuito EVLP (Figura 9D). Accendere la pompa a rulli e collegare il monitor del ventilatore.
21. Controllare la trappola per bolle per assicurarsi che non vengano introdotti emboli d'aria nel sistema.
22. Modificare lentamente le impostazioni di ventilazione e perfusione ai livelli sperimentali desiderati durante i primi 15 minuti 36,37,38. Inoltre, durante questa fase iniziale di ramp-up, aumentare la portata di perfusione alla velocità e/o alla pressione desiderate.
23. Nei punti temporali designati dall'esperimento, controllare i livelli di gas perfusato e i test di funzionalità polmonare.

Risultati

La validazione del nostro perfusato a base di PolyhHb e, inoltre, la stabilità di questo perfusato per diverse ore, è dimostrata nella Figura 10. Durante la prima 1 ora, tutti i perfusi testati (PolyhHb, Control (Williams Media + 5% HSA), a base di globuli rossi) hanno mostrato una leggera diminuzione di LA pO₂ (Post pO₂). Tuttavia, il perfusato a base di globuli rossi ha mostrato una diminuzione significativa a 1 ora rispetto al Poly...

Discussione

Lo sviluppo e la sperimentazione di soluzioni di perfusione è un'impresa innovativa che molti in tutto il mondo stanno intraprendendo. Tradizionalmente, i perfusi standard offrono la capacità di sospendere il tempo ischemico e mitigare le lesioni associate all'ischemia, nonché alla riperfusione¹⁸. Tuttavia, la prossima evoluzione dell'EVLP è quella di migliorare l'attuale tecnologia del perfusato e di incorporare terapie di riparazione e ricondizionamento 39,4...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle	B-D	309301
30 L Glass Batch Bioreactor	Ace Glass
30g Needle	Med Needles	BD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets	Elanco	NA
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O)	Sigma Aldrich	10035-04-8	For modified Ringer's lactate
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672	Harvard Apparatus	731747
Connect kit D150	Cole-Parmer	VK 73-3763
Dumont #5 Forceps	Fine Science tools	11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45°	Fine Science tools	11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Water Heater	Lauda	LCK 1879
Expired human leukoreduced, packed RBC units	Wexner Medical Center Canadian Blood Services Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150	Hugo Sachs Elektronik	PY2 73-3762
Forceps	Fine Science tools	11027-12
Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%)	Sigma Aldrich	111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito Hemostat	Roboz Surgical	RS-7112
Heparin 30,000 units per 30 ml	APP Pharmaceuticals
Human Serum Albumin (HSA)	OctaPharma Plasma		Perfusate additive
IL2 Tube set for perfusate	Harvard Apparatus	733842
IPL-2 Basic Lung Perfusion System	Harvard Apparatus
Ketamine 500 mg per 5 ml	JHP Pharmaceuticals
Left Atrium cannula	Harvard Apparatus	730712
Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor	3M	G420	gas contactor
low potassium dextran glucose solution (perfadex)	XVIVO		solution flushing the lung
Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24)	Cole-Palmer
N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S)	Sigma Aldrich	616-91-1 (A7250)	For modified Ringer's lactate
Nalgene Vessels (10L, 20L)	Nalgene		Filtration vessels
Peristaltic Pump	Ismatec	ISM 827B
PES, 0.65 µm TFF module	Repligen	N02-E65U-07-N
PhysioSuite	Kent Scientific Corporation	PS-MSTAT-RT
polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF module	Repligen	N02-S20U-05-N
Polysulfone (PS), 500 kDa TFF module	Repligen	N02-P500-05-N
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	7447-40-7	For PBS
PowerLab 8/35	ADInstruments	730045
Pulmonary Artery cannula	Harvard Apparatus	730710
Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24)	PharMed BPT
Puralube Ophthalmic Ointment	Dechra	NA
Scissors	Fine Science tools	14090-11
SCP Servo controller for perfusion type 704	Harvard Apparatus	732806
Small Animal Ventilator model 683	Harvard Apparatus	55-000
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	7647-14-5 (S271-10)	For PBS and saline
Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3)	Sigma Aldrich	25895-60-7
Sodium Dithionite (Na2S2O4)	Sigma Aldrich	7775-14-6
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	1310-73-2	For modified Ringer's lactate
Sodium Lactate (NaC3H5O3)	Sigma Aldrich	867-56-1	For modified Ringer's lactate
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Fisher Scientific	7558-79-4	For PBS
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Fisher Scientific	7558-80-7	For PBS
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SS-MVG-Module
Sprague-Dawley rats	Envigo
TAM-A transducer amplifier module type 705/1	Harvard Apparatus	73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2	Harvard Apparatus	73-1793
TCM time control module type 686	Harvard Apparatus	731750
Tracheal cannula	Harvard Apparatus	733557
Tube set for moist chamber	Harvard Apparatus	73V83157
Tubing Cassette	Cole-Parmer	IS 0649
Tweezer #5 Dumostar	Kent Scientific Corporation	INS500085-A
Tweezer #5 stainless steel, curved	Kent Scientific Corporation	IND500232
Tweezer #7 Titanium	Kent Scientific Corporation	INS600187
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID	Harvard Apparatus	721017	perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID	Harvard Apparatus	721019	perfusate line leaving lung
Vannas-Tubingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15008-08
VCM ventilator control module type 681	Harvard Apparatus	731741
William's E Media	Gibco, ThermoFisher Scientific	A12176-01	Perfusate additive
Xylazine 100 mg per 1 ml	Akorn