Esplorazione di soluzioni alternative di perfusione utilizzando vettori di ossigeno polimerizzati a base di emoglobina di nuova generazione in un modello di perfusione polmonare ex vivo di ratto

Riepilogo

Qui, descriviamo l'applicazione di un vettore di ossigeno polimerizzato a base di emoglobina umana (PolyhHb) come perfusato e il protocollo in cui questa soluzione di perfusione può essere testata in un modello di perfusione polmonare ex vivo di ratto.

Abstract

Il trapianto di polmone è ostacolato dalla mancanza di donatori idonei. In precedenza, i donatori ritenuti marginali o inadeguati venivano scartati. Tuttavia, nuove ed entusiasmanti tecnologie, come la perfusione polmonare ex vivo (EVLP), offrono ai fornitori di trapianti di polmone una valutazione estesa per gli allotrapianti di donatori marginali. Questa piattaforma di valutazione dinamica ha portato a un aumento dei trapianti di polmone e ha permesso ai fornitori di utilizzare donatori precedentemente scartati, ampliando così il pool di donatori. Le attuali tecniche di perfusione utilizzano perfusi cellulari o acellulari ed entrambi presentano vantaggi e svantaggi distinti. La composizione della perfusione è fondamentale per mantenere un ambiente omeostatico, fornire un adeguato supporto metabolico, ridurre l'infiammazione e la morte cellulare e, in ultima analisi, migliorare la funzione degli organi. Le soluzioni di perfusione devono contenere una concentrazione proteica sufficiente a mantenere un'adeguata pressione oncotica. Tuttavia, le attuali soluzioni di perfusione spesso portano a stravaso di liquidi attraverso l'endotelio polmonare, con conseguente edema polmonare involontario e danno. Pertanto, è necessario sviluppare nuove soluzioni di perfusione che prevengano danni eccessivi mantenendo una corretta omeostasi cellulare. Qui, descriviamo l'applicazione di un vettore di ossigeno a base di emoglobina umana polimerizzata (PolyhHb) come perfusato e il protocollo in cui questa soluzione di perfusione può essere testata in un modello di EVLP di ratto. L'obiettivo di questo studio è fornire alla comunità dei trapianti di polmone informazioni chiave nella progettazione e nello sviluppo di nuove soluzioni di perfusione, nonché i protocolli appropriati per testarle in modelli di trapianto traslazionale clinicamente rilevanti.

Introduzione

Come ogni campo del trapianto di organi solidi, il trapianto di polmone soffre di una carenza di organi da donatori. Al fine di aumentare il pool di donatori, è stata dedicata una ricerca significativa allo studio del potenziale degli allotrapianti che una volta si pensava non fossero adatti al trapianto, ovvero i donatori con criteri estesi (ECD). Questi allotrapianti possono essere considerati ECD per una serie di motivi, tra cui qualità discutibile, scarsa funzionalità, infezione, traumi, periodi ischemici caldi o freddi prolungati ed età avanzata^{di 1,2} anni. In alcuni casi....

Protocollo

I ratti Sprague-Dawley (300 g di peso corporeo) sono stati ottenuti commercialmente e ospitati in condizioni prive di agenti patogeni presso l'Ohio State University Wexner Medical Center Animal Facility. Tutte le procedure sono state eseguite umanamente secondo il NIH e la Guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura e l'uso umano degli animali da laboratorio e con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Ohio State University (Protocollo IACUC 2023A00000071).

1. Sintesi e purificazione del polihHb

NOTA: La produz....

Discussione

Lo sviluppo e la sperimentazione di soluzioni di perfusione è un'impresa innovativa che molti in tutto il mondo stanno intraprendendo. Tradizionalmente, i perfusi standard offrono la capacità di sospendere il tempo ischemico e mitigare le lesioni associate all'ischemia, nonché alla riperfusione¹⁸. Tuttavia, la prossima evoluzione dell'EVLP è quella di migliorare l'attuale tecnologia del perfusato e di incorporare terapie di riparazione e ricondizionamento 39,4.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle	B-D	309301
30 L Glass Batch Bioreactor	Ace Glass
30g Needle	Med Needles	BD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets	Elanco	NA
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2.2H2O)	Sigma Aldrich	10035-04-8	For modified Ringer's lactate
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672	Harvard Apparatus	731747
Connect kit D150	Cole-Parmer	VK 73-3763
Dumont #5 Forceps	Fine Science tools	11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45°	Fine Science tools	11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Water Heater	Lauda	LCK 1879
Expired human leukoreduced, packed RBC units	Wexner Medical Center Canadian Blood Services Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150	Hugo Sachs Elektronik	PY2 73-3762
Forceps	Fine Science tools	11027-12
Glutaraldehyde (C5H8O2 70 wt%)	Sigma Aldrich	111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito Hemostat	Roboz Surgical	RS-7112
Heparin 30,000 units per 30 ml	APP Pharmaceuticals
Human Serum Albumin (HSA)	OctaPharma Plasma		Perfusate additive
IL2 Tube set for perfusate	Harvard Apparatus	733842
IPL-2 Basic Lung Perfusion System	Harvard Apparatus
Ketamine 500 mg per 5 ml	JHP Pharmaceuticals
Left Atrium cannula	Harvard Apparatus	730712
Liqui-Cel EXF Series G420 Membrane Contactor	3M	G420	gas contactor
low potassium dextran glucose solution (perfadex)	XVIVO		solution flushing the lung
Masterflex Platinum Coated Tubing(Size: 73,17,16,24)	Cole-Palmer
N-Acetyl-L-cysteine (NALC, C5H9NO3S)	Sigma Aldrich	616-91-1 (A7250)	For modified Ringer's lactate
Nalgene Vessels (10L, 20L)	Nalgene		Filtration vessels
Peristaltic Pump	Ismatec	ISM 827B
PES, 0.65 µm TFF module	Repligen	N02-E65U-07-N
PhysioSuite	Kent Scientific Corporation	PS-MSTAT-RT
polyethersulfone (PES), 0.2 µm TFF module	Repligen	N02-S20U-05-N
Polysulfone (PS), 500 kDa TFF module	Repligen	N02-P500-05-N
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	7447-40-7	For PBS
PowerLab 8/35	ADInstruments	730045
Pulmonary Artery cannula	Harvard Apparatus	730710
Pump Head tubing (Size: 73,17,16,24)	PharMed BPT
Puralube Ophthalmic Ointment	Dechra	NA
Scissors	Fine Science tools	14090-11
SCP Servo controller for perfusion type 704	Harvard Apparatus	732806
Small Animal Ventilator model 683	Harvard Apparatus	55-000
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	7647-14-5 (S271-10)	For PBS and saline
Sodium cyanoborohydride (NaCNBH3)	Sigma Aldrich	25895-60-7
Sodium Dithionite (Na2S2O4)	Sigma Aldrich	7775-14-6
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	1310-73-2	For modified Ringer's lactate
Sodium Lactate (NaC3H5O3)	Sigma Aldrich	867-56-1	For modified Ringer's lactate
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Fisher Scientific	7558-79-4	For PBS
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Fisher Scientific	7558-80-7	For PBS
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SS-MVG-Module
Sprague-Dawley rats	Envigo
TAM-A transducer amplifier module type 705/1	Harvard Apparatus	73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2	Harvard Apparatus	73-1793
TCM time control module type 686	Harvard Apparatus	731750
Tracheal cannula	Harvard Apparatus	733557
Tube set for moist chamber	Harvard Apparatus	73V83157
Tubing Cassette	Cole-Parmer	IS 0649
Tweezer #5 Dumostar	Kent Scientific Corporation	INS500085-A
Tweezer #5 stainless steel, curved	Kent Scientific Corporation	IND500232
Tweezer #7 Titanium	Kent Scientific Corporation	INS600187
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID	Harvard Apparatus	721017	perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID	Harvard Apparatus	721019	perfusate line leaving lung
Vannas-Tubingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15008-08
VCM ventilator control module type 681	Harvard Apparatus	731741
William's E Media	Gibco, ThermoFisher Scientific	A12176-01	Perfusate additive
Xylazine 100 mg per 1 ml	Akorn