A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول منهجية لنقل Naegleria gruberi trophozoites مع بنية يتم الحفاظ عليها طوال تمرير trophozoites في المختبر ، وكذلك من خلال encystment و excystment.

Abstract

يتم الاحتفاظ بجميع جينات الريبوسوم في Naegleria trophozoites في الحمض النووي الريبوسومي الدائري المغلق خارج الكروموسومات (rDNA) الذي يحتوي على عنصر (CERE). في حين لا يعرف سوى القليل عن CERE ، فإن تحليل تسلسل الجينوم الكامل لثلاثة أنواع من Naegleria يوضح بوضوح أنه لا توجد صهاريج rDNA في الجينوم النووي. علاوة على ذلك ، تم تعيين أصل DNA واحد للتكرار في N. gruberi CERE ، مما يدعم الفرضية القائلة بأن CERE يتكاثر بشكل مستقل عن الجينوم النووي. تشير خاصية CERE هذه إلى أنه قد يكون من الممكن استخدام CERE الهندسي لإدخال بروتينات غريبة في Naegleria trophozoites. كخطوة أولى في استكشاف استخدام CERE كناقل في Naegleria ، قمنا بتطوير بروتوكول لنقل N. gruberi مع استنساخ جزيئي من N. gruberi CERE المستنسخ إلى pGEM7zf + (pGRUB). بعد النقل ، تم اكتشاف pGRUB بسهولة في N. gruberi trophozoites لمدة سبعة ممرات على الأقل ، وكذلك من خلال الكيس والكيس. كعنصر تحكم ، تم نقل trophozoites مع ناقل العمود الفقري ، pGEM7zf + ، بدون تسلسل N. gruberi (pGEM). لم يتم الكشف عن pGEM بعد المقطع الأول بعد النقل إلى N. gruberi ، مما يشير إلى عدم قدرته على التكاثر في كائن حقيقي النواة. تصف هذه الدراسات بروتوكول نقل Naegleria trophozoites وتثبت أن تسلسل البلازميد البكتيري في pGRUB لا يمنع النقل الناجح وتكرار استنساخ CERE المنقول. علاوة على ذلك ، سيكون بروتوكول النقل هذا حاسما في فهم الحد الأدنى من تسلسل CERE الذي يدفع تكراره في trophozoites ، وكذلك تحديد المناطق التنظيمية في التسلسل غير الريبوسومي (NRS).

Introduction

يحتوي جنس Naegleria على أكثر من 45 نوعا ، على الرغم من أنه من غير المحتمل أن يتم تحديد جميع أعضاء الأنواع1. يمكن أن توجد النيجلرية بأشكال مختلفة: مثل trophozoites (الأميبا) ، أو السوط ، أو عندما تكون الموارد محدودة للغاية ، مثل الخراجات1،2،3،4. يعرف جنس Naegleria بنوعه الوحيد الخطير بشكل خاص ، Naegleria fowleri ، المعروف باسم "الأميبا آكلة الدماغ" (تمت مراجعته في1،2،3،

Protocol

يتم سرد تفاصيل الأنواع والكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد. يتم توفير تسلسل بنية pGRUB لزوج القاعدة 17004 في الملف التكميلي 1.

1. زراعة التروفوزويتات

  1. قم بإذابة N. gruberi trophozoites المجمدة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  2. تلقيح التروفوزويتات في قوارير T25 في الببتون المعدل / مستخلص الخميرة / الحمض النووي / حمض الفوليك / الهيمين مع وسائط مصل عجل الجنين بنسبة 10٪ (PYNFH) بالإضافة إلى 2٪ عازلة (فوسفات ثنائي الصوديوم ، فوسفات هيدروجين البوتاسيوم).
  3. استزرع التروفوزويتات عند 25 درجة مئوية حتى ~ 80٪ متقاربة ، حيث تظهر مورفولوجيا أميبية ....

النتائج

يوضح تفاعل البوليميراز المتسلسل للتروفوزويتات التي تم نقلها باستخدام pGRUB أن CERE المنقول يتم اكتشافه من خلال سبعة ممرات على الأقل من trophozoites ، بالإضافة إلى التكيسات و excystment (الشكل 4). البادئات المستخدمة في تلدين تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل من ناقل pGEM وتسلسل CERE ، وبالتالي ض?.......

Discussion

البروتوكول المبين هنا واضح جدا ، على الرغم من أن كل بناء سيتطلب على الأرجح درجة معينة من التحسين ، لا سيما نسبة كاشف نقل الحمض النووي ، اعتمادا على طبيعة البناء وأنواع النيجلرية المستخدمة. لقد اختبرنا كاشف نقل واحد فقط متاح تجاريا باستخدام هذا البروتوكول ، ولكن من المحتمل أن يكون العد.......

Disclosures

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح المالية.

Acknowledgements

تم تمويل هذه الدراسات جزئيا بمنحة من صندوق جورج ف. هاديكس بجامعة كريتون (KMD). يتم إنشاء الشكل 1 في biorender.com ، ويتم إنشاء الشكل 3 في benchling.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseBio Rad161-3102
Ammonium AcetateSigma AldrichA-7330
Calcium ChlorideSigma AldrichC-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75Thermo Scientific130190
Culture Plate, 6-wellCorning3506
DNAseSigma AldrichD-4527
EDTA, 0.5 MAffymetrix15694
Electropheresis Gel ApparatusAmersham Biosciences80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mLFisher Scientific05-408-138
Ethanol, 100%Decon Laboratories2716
Ethidium BromideSigma AldrichE-8751
Fetal Bovine SerumGibco26140
Folic AcidSigma AldrichF7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus LadderThermo ScientificSM1331
Glacial Acetic AcidFisher ScientificUN2789
GoTaq Green PCR Master MixPromegaM7122
Heating BlockThermo Scientific88871001
HemacytometerHausser Scientific1483
HeminSigma Aldrich51280
Iron ChlorideSigma Aldrich372870-256
LigaseNEBM2200S
Magneisum ChlorideFisher ScientificM33-500
MicrofugeThermo ScientificMySpin 12
MicroscopeNikonTMS
N. gruberiATCC30224
Nucleic AcidChem Impex Int’l#01625
PeptoneGibco211677
pGEMPromegaP2251
Potassium PhosphateSigma AldrichP0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply UnitBio Rad1645052
Sodium ChlorideMCB ReagentsSX0420
Sodium Phosphate, dibasicSigma AldrichS2554
Tabletop Centrifugeeppendorf5415R
Tris, baseSigma AldrichT1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%Gibco15250-061
ViaFect ReagentPromegaE4981
Weigh ScaleDenver InstrumentsAPX-60
Yeast ExtractGibco212750

References

  1. De Jonckheere, J. F. What do we know by now about the genus Naegleria. Exp Parasitol. 145 (Suppl), S2-S9 (2014).
  2. De Jonckheere, J. F. A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria. Acta Proto....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Naegleria groberi RDNA CERE Transfection PGRUB PGEM7zf Trophozoites Encystment Excystment NRS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved