A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
نقل استنساخ جزيئي من الحمض النووي الريبوزي للنيجلرية إلى N. gruberi Trophozoites
In This Article
Summary
يصف هذا البروتوكول منهجية لنقل Naegleria gruberi trophozoites مع بنية يتم الحفاظ عليها طوال تمرير trophozoites في المختبر ، وكذلك من خلال encystment و excystment.
Abstract
يتم الاحتفاظ بجميع جينات الريبوسوم في Naegleria trophozoites في الحمض النووي الريبوسومي الدائري المغلق خارج الكروموسومات (rDNA) الذي يحتوي على عنصر (CERE). في حين لا يعرف سوى القليل عن CERE ، فإن تحليل تسلسل الجينوم الكامل لثلاثة أنواع من Naegleria يوضح بوضوح أنه لا توجد صهاريج rDNA في الجينوم النووي. علاوة على ذلك ، تم تعيين أصل DNA واحد للتكرار في N. gruberi CERE ، مما يدعم الفرضية القائلة بأن CERE يتكاثر بشكل مستقل عن الجينوم النووي. تشير خاصية CERE هذه إلى أنه قد يكون من الممكن استخدام CERE الهندسي لإدخال بروتينات غريبة في Naegleria trophozoites. كخطوة أولى في استكشاف استخدام CERE كناقل في Naegleria ، قمنا بتطوير بروتوكول لنقل N. gruberi مع استنساخ جزيئي من N. gruberi CERE المستنسخ إلى pGEM7zf + (pGRUB). بعد النقل ، تم اكتشاف pGRUB بسهولة في N. gruberi trophozoites لمدة سبعة ممرات على الأقل ، وكذلك من خلال الكيس والكيس. كعنصر تحكم ، تم نقل trophozoites مع ناقل العمود الفقري ، pGEM7zf + ، بدون تسلسل N. gruberi (pGEM). لم يتم الكشف عن pGEM بعد المقطع الأول بعد النقل إلى N. gruberi ، مما يشير إلى عدم قدرته على التكاثر في كائن حقيقي النواة. تصف هذه الدراسات بروتوكول نقل Naegleria trophozoites وتثبت أن تسلسل البلازميد البكتيري في pGRUB لا يمنع النقل الناجح وتكرار استنساخ CERE المنقول. علاوة على ذلك ، سيكون بروتوكول النقل هذا حاسما في فهم الحد الأدنى من تسلسل CERE الذي يدفع تكراره في trophozoites ، وكذلك تحديد المناطق التنظيمية في التسلسل غير الريبوسومي (NRS).
Introduction
يحتوي جنس Naegleria على أكثر من 45 نوعا ، على الرغم من أنه من غير المحتمل أن يتم تحديد جميع أعضاء الأنواع1. يمكن أن توجد النيجلرية بأشكال مختلفة: مثل trophozoites (الأميبا) ، أو السوط ، أو عندما تكون الموارد محدودة للغاية ، مثل الخراجات1،2،3،4. يعرف جنس Naegleria بنوعه الوحيد الخطير بشكل خاص ، Naegleria fowleri ، المعروف باسم "الأميبا آكلة الدماغ" (تمت مراجعته في1،2،3،
Protocol
يتم سرد تفاصيل الأنواع والكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد. يتم توفير تسلسل بنية pGRUB لزوج القاعدة 17004 في الملف التكميلي 1.
1. زراعة التروفوزويتات
- قم بإذابة N. gruberi trophozoites المجمدة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- تلقيح التروفوزويتات في قوارير T25 في الببتون المعدل / مستخلص الخميرة / الحمض النووي / حمض الفوليك / الهيمين مع وسائط مصل عجل الجنين بنسبة 10٪ (PYNFH) بالإضافة إلى 2٪ عازلة (فوسفات ثنائي الصوديوم ، فوسفات هيدروجين البوتاسيوم).
- استزرع التروفوزويتات عند 25 درجة مئوية حتى ~ 80٪ متقاربة ، حيث تظهر مورفولوجيا أميبية ....
النتائج
يوضح تفاعل البوليميراز المتسلسل للتروفوزويتات التي تم نقلها باستخدام pGRUB أن CERE المنقول يتم اكتشافه من خلال سبعة ممرات على الأقل من trophozoites ، بالإضافة إلى التكيسات و excystment (الشكل 4). البادئات المستخدمة في تلدين تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل من ناقل pGEM وتسلسل CERE ، وبالتالي ض?.......
Discussion
البروتوكول المبين هنا واضح جدا ، على الرغم من أن كل بناء سيتطلب على الأرجح درجة معينة من التحسين ، لا سيما نسبة كاشف نقل الحمض النووي ، اعتمادا على طبيعة البناء وأنواع النيجلرية المستخدمة. لقد اختبرنا كاشف نقل واحد فقط متاح تجاريا باستخدام هذا البروتوكول ، ولكن من المحتمل أن يكون العد.......
Disclosures
ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح المالية.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسات جزئيا بمنحة من صندوق جورج ف. هاديكس بجامعة كريتون (KMD). يتم إنشاء الشكل 1 في biorender.com ، ويتم إنشاء الشكل 3 في benchling.com.
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Bio Rad | 161-3102 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | A-7330 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C-4901 | |
| Crushed ice | |||
| Culture Flasks, T-75 | Thermo Scientific | 130190 | |
| Culture Plate, 6-well | Corning | 3506 | |
| DNAse | Sigma Aldrich | D-4527 | |
| EDTA, 0.5 M | Affymetrix | 15694 | |
| Electropheresis Gel Apparatus | Amersham Biosciences | 80-6052-45 | |
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Tubes, 2 mL | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol, 100% | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethidium Bromide | Sigma Aldrich | E-8751 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | |
| Folic Acid | Sigma Aldrich | F7876-25G | |
| GeneRuler 1 kb Plus Ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | UN2789 | |
| GoTaq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Heating Block | Thermo Scientific | 88871001 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Hemin | Sigma Aldrich | 51280 | |
| Iron Chloride | Sigma Aldrich | 372870-256 | |
| Ligase | NEB | M2200S | |
| Magneisum Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Microfuge | Thermo Scientific | MySpin 12 | |
| Microscope | Nikon | TMS | |
| N. gruberi | ATCC | 30224 | |
| Nucleic Acid | Chem Impex Int’l | #01625 | |
| Peptone | Gibco | 211677 | |
| pGEM | Promega | P2251 | |
| Potassium Phosphate | Sigma Aldrich | P0662-500G | |
| PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit | Bio Rad | 1645052 | |
| Sodium Chloride | MCB Reagents | SX0420 | |
| Sodium Phosphate, dibasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Tabletop Centrifuge | eppendorf | 5415R | |
| Tris, base | Sigma Aldrich | T1503-1KG | |
| Trypan Blue, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| ViaFect Reagent | Promega | E4981 | |
| Weigh Scale | Denver Instruments | APX-60 | |
| Yeast Extract | Gibco | 212750 |
References
- De Jonckheere, J. F. What do we know by now about the genus Naegleria. Exp Parasitol. 145 (Suppl), S2-S9 (2014).
- De Jonckheere, J. F. A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria. Acta Proto....
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved