Trasfezione di un clone molecolare di rDNA di Naegleria gruberi in trofozoiti di N. gruberi

Riepilogo

Questo protocollo descrive una metodologia per trasfettare i trofozoiti di Naegleria gruberi con un costrutto che viene mantenuto per tutta la durata del passaggio dei trofozoiti in vitro, nonché attraverso l'incistamento e l'escissione.

Abstract

Tutti i geni ribosomiali dei trofozoiti di Naegleria sono mantenuti in un elemento circolare chiuso contenente DNA ribosomiale extracromosomico (rDNA) (CERE). Mentre si sa poco sul CERE, un'analisi completa della sequenza del genoma di tre specie di Naegleria dimostra chiaramente che non ci sono cistrroni di rDNA nel genoma nucleare. Inoltre, una singola origine di replicazione del DNA è stata mappata nel CERE di N. gruberi , supportando l'ipotesi che il CERE si replichi indipendentemente dal genoma nucleare. Questa caratteristica del CERE suggerisce che potrebbe essere possibile utilizzare il CERE ingegnerizzato per introdurre proteine estranee nei trofozoiti di Naegleria . Come primo passo nell'esplorazione dell'uso di un CERE come vettore in Naegleria, abbiamo sviluppato un protocollo per trasfettare N. gruberi con un clone molecolare di N. gruberi CERE clonato in pGEM7zf+ (pGRUB). Dopo la trasfezione, pGRUB è stato prontamente rilevato nei trofozoiti di N. gruberi per almeno sette passaggi, nonché attraverso incistamento ed escissione. Come controllo, i trofozoiti sono stati trasfettati con il vettore backbone, pGEM7zf+, senza le sequenze di N. gruberi (pGEM). Il pGEM non è stato rilevato dopo il primo passaggio successivo alla trasfezione in N. gruberi, indicando la sua incapacità di replicarsi in un organismo eucariotico. Questi studi descrivono un protocollo di trasfezione per i trofozoiti di Naegleria e dimostrano che la sequenza plasmidica batterica in pGRUB non inibisce la trasfezione e la replicazione del clone CERE trasfettato. Inoltre, questo protocollo di trasfezione sarà fondamentale per comprendere la sequenza minima del CERE che guida la sua replicazione nei trofozoiti, nonché per identificare le regioni regolatorie nella sequenza non ribosomiale (NRS).

Introduzione

Il genere Naegleria contiene oltre 45 specie, anche se è improbabile che tutti i membri della specie siano stati identificati¹. La Naegleria può esistere in diverse forme: come trofozoiti (amebe), come flagellati o, quando le risorse sono fortemente limitate, come cisti 1,2,3,4. Il genere Naegleria è noto per la sua specie particolarmente pericolosa, Naegleria fowleri, nota come "l'ameba mangia-cervello" (recensita in ^{1,2,3,4,5,6,7}), che è la causa della meningoencefalite amebica primaria quasi universalmente fatale.

Naegleria codifica il loro rDNA sul CERE situato nel nucleolo. Il sequenziamento completo dei genomi di tre specie di Naegleria conferma l'assenza di rDNA nel genoma nucleare ^8,9,10,11. Sulla base delle limitate sequenze CERE a lunghezza intera, il CERE varia da circa 10 kbp a 18 kbp di lunghezza. I CERE di ogni specie di Naegleria portano un singolo cistrone di rDNA (contenente il DNA ribosomiale 5,8, 18 e 28S) su ciascuno dei circa 4.000 CERE per cellula 12,13,14. Oltre all'rDNA, ogni CERE ha una grande sequenza non di rDNA (NRS). Le dimensioni del CERE variano da specie a specie; le differenze sono dovute principalmente alla lunghezza variabile dell'NRS, poiché le sequenze di rDNA sono altamente conservate in tutto il genere 1,15,16,17,18,19,20. La mappatura di una singola origine della replicazione del DNA all'interno di N. gruberi CERE NRS²¹ fornisce un forte supporto all'ipotesi che Naegleria CERE si replichi indipendentemente dal genoma nucleare.

N. gruberi è un'ameba non patogena spesso utilizzata per studiare la biologia della Naegleria . Abbiamo sviluppato una metodologia per trasformare i trofozoiti di N. gruberi con un clone di CERE della stessa specie per testare l'ipotesi che le amebe Naegleria tollerino e replichino indipendentemente il CERE all'interno dei trofozoiti. Ciò è stato ottenuto trasformando N. gruberi con un clone completo di N. gruberi CERE in trofozoiti e seguendo i destini del clone CERE donatore mediante reazione a catena della polimerasi (PCR). Una panoramica generale del protocollo è illustrata nella Figura 1. I dati qui presentati dimostrano che il clone donatore può essere rilevato attraverso almeno sette passaggi in coltura tissutale, nonché essere mantenuto attraverso incistamento ed escissione. Questi studi costituiscono la base per analizzare il modo in cui CERE si replica, nonché per esplorare il suo uso come vettore per trasfettare Naegleria.

Protocollo

I dettagli delle specie, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali. La sequenza del costrutto pGRUB di 17.004 coppie di basi è fornita nel File supplementare 1.

1. Allevamento di trofozoiti

1. Scongelare i trofozoiti di N. gruberi congelati a 37 °C per 3 min.
2. Inoculare i trofozoiti in fiasche T25 in peptone/estratto di lievito/acido nucleico/acido folico/emina modificati con il 10% di siero fetale di vitello (PYNFH) più il 2% di tampone (fosfato disodico, fosfato monobasico di potassio).
3. Coltivare i trofozoiti a 25 °C fino a ~80% confluenti, dove mostrano una morfologia ameboide (Figura 2A).
   NOTA: Quando si fa inizialmente rivivere una coltura di trofozoiti dal loro stato congelato, possono essere necessari fino a 5-7 giorni prima che un T25 diventi confluente. Decantare il supporto ogni 3-4 giorni e sostituirlo con un supporto nuovo.
4. Posizionare i palloni confluenti sul ghiaccio per 5-10 minuti per rilasciare i trofozoiti aderiti dalla plastica. Agitare delicatamente il pallone per rimuovere le cellule aderenti rimanenti. I trofozoiti hanno ora una morfologia "arrotondata" (Figura 2B).
5. Suddividere le colture da 1:2 a 1:4 in nuovi flaconi per colture tissutali.
6. Rimuovere il PYNFH e sostituirlo con mezzi di incistamento sterili (120 mM di cloruro di sodio, 0,03 mM di cloruro di magnesio, 1 mM di fosfato disodico, 1 mM di fosfato monobasico di potassio, 0,03 mM di cloruro di calcio, 0,02 mM di cloruro di ferro, pH 6,8)²² per incistare il N. gruberi.
   NOTA: La maggior parte dei trofozoiti diventa incistata entro 72 ore (Figura 2C). L'escussione deve essere completata entro 72 ore.
7. Rimuovere le cisti dai palloni, centrifugare a 600 x g per 10 minuti a 20 °C e risospendere le cisti in terreno PYNFH con il 10% di siero fetale di vitello per asportare le cellule. Incubare a 25 °C per 24 ore fino a quando i trofozoiti iniziano a emergere.

2. Trasfezione dei trofozoiti

1. Preparare i trofozoiti in una piastra di coltura tissutale a fondo piatto a 6 pozzetti (1 mL di 1 x 10⁶ trofozoiti/mL) e coltivare a 25 °C.
2. Trasfettare le cellule quando raggiungono il 70%-80% di confluenza (~10,4 x 10⁴ cellule/cm² in cluster a 6 pozzetti). Riscaldare il reagente di trasfezione a temperatura ambiente prima dell'uso.
3. Preparare la miscela di reagenti plasmidico-trasfezione come segue: 75 ng di DNA plasmidico e 0,225 μL di reagente di trasfezione in 200 μL di terreno PYNFH senza FBS. Preparare una miscela di reagenti plasmide-trasfezione sufficiente per eseguire la trasfezione in duplicato.
   NOTA: In questo studio è stato utilizzato un plasmide batterico contenente un clone completo di N. gruberi CERE (pGRUB). Il plasmide vuoto (pGEM) è stato utilizzato come controllo negativo (Figura 3).
4. Incubare la miscela di reagenti plasmidi-trasfezione a temperatura ambiente per 10 minuti.
5. Rimuovere ~800 μL di terreno dai monostrati di trofozoite appena prima della trasfezione.
6. Mettere la miscela di reagenti plasmidi-trasfezione sui trofozoiti.
7. Agitare delicatamente la lastra ogni 15 minuti per evitare che il supporto si aggreghi ai bordi della lastra.
8. Lavare i monostrati una volta con 2 mL di terreno di crescita dopo 1 ora di incubazione a 25 ^°C.
9. Trattare i monostrati con 10 U DNasi in 1 mL di tampone DNasi 10x per 15 minuti a 37 °C per rimuovere il DNA plasmidico residuo, lavare una volta con terreno di crescita, aggiungere 2 mL di terreno fresco e posizionare a 25°C. Incubare la piastra per 24-36 ore.
10. Mettere la piastra sul ghiaccio per 10 minuti per rilasciare le cellule.
11. Dividi un pozzo (1:2) in due nuovi pozzi.
12. Raccogli i trofozoiti dai pozzi rimanenti per scopi sperimentali.
    NOTA: tutte le impostazioni cultura vengono eseguite in duplicato. Per ogni condizione, 1 pozzetto viene utilizzato per il passaggio e 1 viene utilizzato per l'isolamento CERE.

3. Isolamento di CERE da Naegleria

1. Calcolare il numero di trofozoiti in ciascun pozzetto utilizzato per l'isolamento CERE mediante colorazione di esclusione con blu di tripano e un emocitometro²³.
2. Mettere i trofozoiti in una provetta da 2,0 mL.
3. Lavare i trofozoiti una volta ogni 100 mM di cloruro di sodio (pH 7,5) mediante centrifugazione (600 x g, 10 min, 4 °C).
   NOTA: Il cloruro di sodio impedisce ai trofozoiti di aderire ai lati del tubo.
4. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 100 μL di EDTA 100 mM (pH 7,5).
5. Mettere la provetta in un blocco termico per 15 minuti a 98 °C per lisare le cellule e inattivare gli enzimi nei trofozoiti.
   NOTA: Questo passaggio inattiva le DNasi, che sono abbondanti nei trofozoiti di Naegleria . Le DNasi possono interferire con la capacità di rilevare il CERE nativo e il clone molecolare nella fase 4. La resa del DNA diminuisce quando vengono utilizzate oltre ~3 x 10⁶ celle nel passaggio 3.4.
6. Centrifugare le provette alla massima velocità (16.000 x g) a 4 °C per 10 minuti per pellettare i detriti.
7. Trasferire i surnatanti in una nuova provetta.
8. L'etanolo precipita i surnatanti con 0,5 volumi di acetato di ammonio 7,5 M (pH 7,5), 3 volumi di etanolo assoluto e 1 μL di glicogeno 10 mg/mL come vettore.
9. Capovolgere la provetta più volte e posizionarla a -80 °C per almeno 1 ora o durante la notte.
10. Riscaldare i campioni a temperatura ambiente.
11. Centrifugare le provette a temperatura ambiente per 10 minuti a 16.000 x g.
12. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con etanolo al 70% mediante centrifugazione per 5 minuti a 16.000 x g (a temperatura ambiente).
13. Rimuovere l'etanolo e asciugare il pellet all'aria per 5 minuti.
14. Risospendere il pellet essiccato in acqua deionizzata sterile (DI). Normalizzare il volume a 10.000 trofozoiti per μL.
15. Conservare a -80 °C fino all'uso in PCR.

4. Rilevamento PCR di trofozoiti trasformati

1. Utilizzare 20.000 cellule equivalenti di DNA, primer da 600 nM (Tabella 1) e Taq polimerasi ed eseguire la PCR²⁴.
   NOTA: I primer che distinguono tra CERE nativo e CERE clonato sono elencati nella Tabella 1, così come le condizioni di PCR. La Figura 3 mostra la posizione degli inneschi sui costrutti. La PCR richiederà un'ottimizzazione a seconda dei primer utilizzati e della specifica miscela PCR utilizzata.
2. Microonde 0,8% di agarosio in 1x Tris base, acido acetico e tampone EDTA (TAE) fino a quando l'agarosio non si è sciolto.
3. Raffreddare l'agarosio a ~50 °C a temperatura ambiente.
4. Versare la soluzione in una vaschetta di colata di gel contenente un pettine per formare dei pozzetti.
5. Lascia riposare il gel a temperatura ambiente fino a quando non si sarà solidificato.
6. Posizionare il gel nell'apparecchio per elettroforesi.
7. Decantare 1x TAE nella camera di elettroforesi fino a coprire il gel.
8. Rimuovere il pettine.
9. Aggiungere 6 coloranti di caricamento (0,25% blu di bromfenolo, 0,25% xilene cianolo, 30% glicerolo) ai campioni e caricare il gel. Utilizzare una scala del DNA per determinare le dimensioni del prodotto PCR.
10. Collegare l'elettrodo, accendere l'alimentatore e far funzionare il gel a 80 V per ~1,5-2 ore.
11. Spegnere l'alimentazione e rimuovere il gel.
12. Colorare il gel con colorante DNA (ad es. 10 μL di 10 mg/mL di bromuro di etidio) in 100 mL di acqua deionizzata per 10 minuti.
13. Lasciare il gel per 20 minuti in acqua deionizzata.
14. Visualizza il gel su un sistema a luce ultravioletta (UV) e documenta i risultati.

Risultati

La PCR dei trofozoiti che sono stati trasfettati con pGRUB dimostra che il CERE trasfettato viene rilevato attraverso almeno sette passaggi dei trofozoiti, nonché incistamento ed escisto (Figura 4). I primer utilizzati nella PCR ricottura sia al vettore pGEM che alla sequenza CERE, garantendo così che la PCR non rilevi il CERE nativo. La PCR dopo la trasfezione di pGEM in trofozoiti ha indicato che pGEM era negativo (Figura 4), indicando che il plasmide vuoto ...

Discussione

Il protocollo qui delineato è molto semplice, anche se ogni costrutto richiederà probabilmente un certo grado di ottimizzazione, in particolare del rapporto reagente DNA-trasfezione, a seconda della natura del costrutto e della specie di Naegleria utilizzata. Abbiamo testato solo un reagente di trasfezione disponibile in commercio utilizzando questo protocollo, ma è probabile che molti altri possano essere efficaci. Dato che viene utilizzato un clone a lunghezza intera del CERE, contenente un'origine funziona...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bio Rad	161-3102
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	A-7330
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75	Thermo Scientific	130190
Culture Plate, 6-well	Corning	3506
DNAse	Sigma Aldrich	D-4527
EDTA, 0.5 M	Affymetrix	15694
Electropheresis Gel Apparatus	Amersham Biosciences	80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Ethanol, 100%	Decon Laboratories	2716
Ethidium Bromide	Sigma Aldrich	E-8751
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140
Folic Acid	Sigma Aldrich	F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder	Thermo Scientific	SM1331
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Heating Block	Thermo Scientific	88871001
Hemacytometer	Hausser Scientific	1483
Hemin	Sigma Aldrich	51280
Iron Chloride	Sigma Aldrich	372870-256
Ligase	NEB	M2200S
Magneisum Chloride	Fisher Scientific	M33-500
Microfuge	Thermo Scientific	MySpin 12
Microscope	Nikon	TMS
N. gruberi	ATCC	30224
Nucleic Acid	Chem Impex Int’l	#01625
Peptone	Gibco	211677
pGEM	Promega	P2251
Potassium Phosphate	Sigma Aldrich	P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit	Bio Rad	1645052
Sodium Chloride	MCB Reagents	SX0420
Sodium Phosphate, dibasic	Sigma Aldrich	S2554
Tabletop Centrifuge	eppendorf	5415R
Tris, base	Sigma Aldrich	T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%	Gibco	15250-061
ViaFect Reagent	Promega	E4981
Weigh Scale	Denver Instruments	APX-60
Yeast Extract	Gibco	212750