将 Naegleria gruberi rDNA 的分子克隆转染到 N. gruberi 滋养体中

摘要

该方案描述了一种转染 Naegleria gruberi 滋养体的方法，该方法的构建体在 体外传代滋养体中以及通过包埋和脱囊保持。

摘要

Naegleria trophozoites 的所有核糖体基因都维持在封闭的环状染色体外核糖体 DNA （rDNA） 含元件 （CERE） 中。虽然对 CERE 知之甚少，但对三种 Naegleria 物种的完整基因组序列分析清楚地表明，核基因组中没有 rDNA cistrons。此外，在 N. gruberi CERE 中已绘制出单一的 DNA 复制起点，支持 CERE 独立于核基因组进行复制的假设。CERE 的这一特性表明，有可能使用工程化的 CERE 将外源蛋白质引入 Naegleria 滋养体。作为探索在 Naegleria 中使用 CERE 作为载体的第一步，我们开发了一种方案，用克隆到 pGEM7zf + （pGRUB） 中的格鲁伯猪笼草 CERE 的分子克隆转染格鲁伯猪笼草。转染后，pGRUB 在 N. gruberi 滋养体中很容易检测到至少 7 次传代，以及通过包封和脱囊。作为对照，用骨架载体 pGEM7zf + 转染滋养体，而不转染 N. gruberi 序列 （pGEM）。转染到 N. gruberi 后第一次传代后未检测到 pGEM，表明其无法在真核生物体中复制。这些研究描述了 Naegleria 滋养体的转染方案，并证明 pGRUB 中的细菌质粒序列不会抑制转染的 CERE 克隆的成功转染和复制。此外，该转染方案对于理解驱动其在滋养体中复制的 CERE 的最小序列以及识别非核糖体序列 （NRS） 中的调节区域至关重要。

引言

Naegleria 属包含超过 45 个物种，尽管不太可能确定该物种的所有成员¹。Naegleria 可以以不同的形式存在:作为滋养体（变形虫），作为鞭毛，或者，当资源严重受限时，作为包囊 1,2,3,4。Naegleria 属因其一种特别危险的物种 Naegleria fowleri 而得到认可，被称为"食脑变形虫"（1,2,3,4,5,6,7），这是导致几乎普遍致命的原发性阿米巴脑膜脑炎的原因。

Naegleria 在位于核仁中的 CERE 上编码它们的 rDNA。对三种 Naegleria 物种基因组进行完整测序证实了核基因组中不存在 rDNA 8,9,10,11。基于有限的全长 CERE 序列，CERE 的长度范围约为 10 kbp 至 18 kbp。每种 Naegleria 的 CERE 在每个细胞中大约 4,000 个 CERE 上都携带一个 rDNA 顺子（包含 5.8、18 和 28S 核糖体 DNA）12,13,14。除了 rDNA，每个 CERE 都有一个大的非 rDNA 序列 （NRS）。CERE 的大小因物种而异;差异主要是由于 NRS 的长度不同，因为 rDNA 序列在 1,15,16,17,18,19,20 属中高度保守。在 N. gruberi CERE NRS²¹ 中定位 DNA 复制的单一起点为 Naegleria CERE 独立于核基因组复制的假设提供了有力支持。

N. gruberi 是一种非致病性变形虫，通常用于研究 Naegleria 生物学。我们开发了一种用来自同一物种的 CERE 克隆转化 N. gruberi 滋养体的方法，以检验 Naegleria 变形虫耐受并在滋养体内独立复制 CERE 的假设。这是通过将带有 N. gruberi CERE 全长克隆的 N. gruberi 转化为滋养体并通过聚合酶链反应 （PCR） 遵循供体 CERE 克隆的命运来实现的。图 1 概述了该协议的一般概述。本文提供的数据表明，供体克隆可以通过组织培养中的至少 7 次传代检测到，并且可以通过包埋和脱囊来维持。这些研究为剖析 CERE 如何复制以及探索其作为转染 Naegleria 载体的用途奠定了基础。

研究方案

本研究中使用的物种、试剂和设备的详细信息列在 材料表中。 补充文件 1 中提供了 17,004 个碱基对 pGRUB 构建体的序列。

1. 滋养体的培养

1. 将冷冻的 N. gruberi 滋养体在 37 °C 下解冻 3 分钟。
2. 将滋养体接种到修饰蛋白胨/酵母提取物/核酸/叶酸/血红素中的 T25 培养瓶中，其中含有 10% 胎牛血清 （PYNFH） 培养基和 2% 缓冲液（磷酸二钠、磷酸二氢钾）。
3. 在 25 °C 下培养滋养体直至 ~80% 汇合，在那里它们表现出变形虫形态（图 2A）。
   注:最初从冻结状态恢复滋养体培养物时，T25 可能需要长达 5-7 天的时间才能汇合。每 3-4 天倒出一次培养基，并更换为新鲜培养基。
4. 将汇合瓶放在冰上 5-10 分钟，以从塑料中释放粘附的滋养体。轻轻旋转培养瓶以去除任何剩余的贴壁细胞。滋养体现在具有"四舍五入"的形态（图 2B）。
5. 将培养物以 1:2 至 1:4 的比例分液到新的组织培养瓶中。
6. 去除 PYNFH 并用无菌包埋培养基（120 mM 氯化钠、0.03 mM 氯化镁、1 mM 磷酸二钠、1 mM 磷酸二氢钾、0.03 mM 氯化钙、0.02 mM 氯化铁，pH 6.8）²² 替换它，以形成 N. gruberi 的包囊。
   注意:大多数滋养体在 72 小时时变得包囊（图 2C）。脱囊应在 72 小时内完成。
7. 从培养瓶中取出囊肿，在 20 °C 下以 600 x g 离心 10 分钟，然后将囊肿重悬于含有 10% 胎牛血清的 PYNFH 培养基中以使细胞脱囊。在 25 °C 下孵育 24 小时，直到滋养体开始出现。

2. 转染滋养体

1. 将滋养体接种到 6 孔平底组织培养板（1 mL 1 x 10⁶ 个滋养体/mL）中，并在 25 °C 下培养。
2. 当细胞达到 70%-80% 汇合时（6 孔簇中为 ~10.4 x 10⁴ 个细胞/cm² ），转染细胞。使用前将转染试剂加热至室温。
3. 按如下方式制备质粒转染试剂混合物:在 200 μL 不含 FBS 的 PYNFH 培养基中加入 75 ng 质粒 DNA 和 0.225 μL 转染试剂。准备足够的质粒-转染试剂混合物，以一式两份进行转染。
   注:本研究中使用了含有 N. gruberi CERE （pGRUB） 全长克隆的细菌质粒。空质粒 （pGEM） 用作阴性对照（图 3）。
4. 在室温下孵育质粒-转染试剂混合物 10 分钟。
5. 转染前，从滋养体单层中去除 ~800 μL 培养基。
6. 将质粒转染试剂混合物放在滋养体上。
7. 每 15 分钟轻轻旋转一次板，以防止培养基在板的边缘聚集。
8. 在 25 ^°C 下孵育 1 小时后，用 2 mL 生长培养基洗涤单层一次。
9. 在 37 °C 下用 10 U DNase 在 1 mL 10x DNase 缓冲液中处理单层 15 分钟以去除残留的质粒 DNA，用生长培养基洗涤一次，加入 2 mL 新鲜培养基，并置于 25°C 下。 将板孵育 24-36 小时。
10. 将板放在冰上 10 分钟以释放细胞。
11. 将一个孔 （1:2） 分成两个新孔。
12. 从剩余的孔中收集滋养体用于实验目的。
    注意:所有培养物均一式两份进行。对于每种条件，1 个孔用于传代，1 个孔用于 CERE 分离。

3. 从 Naegleria 中分离 CERE

1. 通过台盼蓝排阻染色和血细胞计数器²³ 计算用于 CERE 分离的每个孔中的滋养体数量。
2. 将滋养体放入 2.0 mL 试管中。
3. 通过离心（600 x g ，10 分钟，4 °C）在 100 mM 氯化钠 （pH 7.5） 中洗涤滋养体一次。
   注意:氯化钠可防止滋养体粘附在管的侧面。
4. 去除上清液，将细胞沉淀重悬于 100 μL 100 mM EDTA （pH 7.5） 中。
5. 将试管置于 98 °C 的加热块中 15 分钟，以裂解细胞并灭活滋养体中的酶。
   注:此步骤灭活 DNase，DNase 在 Naegleria 滋养体中含量丰富。DNase 可能会干扰步骤 4 中检测天然 CERE 和分子克隆的能力。在步骤 3.4 中使用超过 ~3 x 10⁶ 个细胞时，DNA 产量会降低。
6. 将试管在 4 °C 下以最高速度 （16,000 x g） 离心 10 分钟以沉淀碎片。
7. 将上清液转移到新管中。
8. 乙醇以 0.5 体积的 7.5 M 乙酸铵 （pH 7.5）、3 体积的无水乙醇和 1 μL 10 mg/mL 糖原为载体沉淀上清液。
9. 将试管倒置数次，并将试管在 -80 °C 下放置至少 1 小时或过夜。
10. 将样品加热至室温。
11. 在室温下以 16,000 x g 离心管 10 分钟。
12. 去除上清液，用 70% 乙醇以 16,000 x g （室温）离心 5 分钟洗涤沉淀。
13. 去除乙醇并将沉淀风干 5 分钟。
14. 将干燥的沉淀物重悬于无菌去离子 （DI） 水中。将体积标准化为每 μL 10,000 个滋养体。
15. 储存在 -80 °C 直至用于 PCR。

4. 转化滋养体的 PCR 检测

1. 使用 20,000 个细胞当量的 DNA、600 nM 引物（表 1）和 Taq 聚合酶，进行 PCR²⁴。
   注: 表 1 列出了区分天然 CERE 和克隆 CERE 的引物，PCR 条件也是如此。 图 3 显示了引物在构建体上的位置。PCR 需要优化，具体取决于所使用的引物以及所使用的特定 PCR 混合物。
2. 将 0.8% 琼脂糖溶于 1x Tris 碱、乙酸和 EDTA （TAE） 缓冲液中微波，直至琼脂糖溶解。
3. 在室温下将琼脂糖冷却至 ~50 °C。
4. 将溶液倒入装有梳子的凝胶灌注托盘中以形成孔。
5. 让凝胶在室温下静置直至凝固。
6. 将凝胶放入电泳仪中。
7. 将 1x TAE 倒入电泳室中，直到凝胶被覆盖。
8. 取下梳子。
9. 向样品中加入 6x 上样染料（0.25% 溴酚蓝、0.25% 二甲苯蓝、30% 甘油）并上样凝胶。使用 DNA 分子量标准确定 PCR 产物的大小。
10. 连接电极，打开电源，并在 80 V 下运行凝胶 ~1.5-2 小时。
11. 关闭电源并取出凝胶。
12. 用 DNA 染料（例如，10 μL 10 mg/mL 溴化乙锭）在 100 mL 去离子水中对凝胶染色 10 分钟。
13. 将凝胶在 DI 水中脱色 20 分钟。
14. 在紫外线 （UV） 系统上观察凝胶并记录结果。

结果

用 pGRUB 转染的滋养体的 PCR 表明，通过滋养体的至少 7 次传代以及包埋和脱囊检测到转染的 CERE（图 4）。PCR 中使用的引物与 pGEM 载体和 CERE 序列退火，从而确保 PCR 不检测天然 CERE。将 pGEM 转染到滋养体中的 PCR 表明 pGEM 为阴性（图 4），表明空质粒未被变形虫保留。 图 4 表明 pGEM 在第一次传代时丢失 - 随后的传代、包囊和脱囊?...

讨论

此处概述的方案非常简单，尽管每种构建体都可能需要一定程度的优化，特别是 DNA 转染试剂比例，具体取决于构建体的性质和所使用的 Naegleria 物种。我们只测试了一种使用此方案的市售转染试剂，但其他几种可能有效。鉴于使用了 CERE 的全长克隆，包含复制的功能起点，因此可以自主复制，因此该构建体具有所有必要的真核复制机制。如果要将部分克隆插入 pGEM 载体中，如果转染克隆不...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bio Rad	161-3102
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	A-7330
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75	Thermo Scientific	130190
Culture Plate, 6-well	Corning	3506
DNAse	Sigma Aldrich	D-4527
EDTA, 0.5 M	Affymetrix	15694
Electropheresis Gel Apparatus	Amersham Biosciences	80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Ethanol, 100%	Decon Laboratories	2716
Ethidium Bromide	Sigma Aldrich	E-8751
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140
Folic Acid	Sigma Aldrich	F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder	Thermo Scientific	SM1331
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Heating Block	Thermo Scientific	88871001
Hemacytometer	Hausser Scientific	1483
Hemin	Sigma Aldrich	51280
Iron Chloride	Sigma Aldrich	372870-256
Ligase	NEB	M2200S
Magneisum Chloride	Fisher Scientific	M33-500
Microfuge	Thermo Scientific	MySpin 12
Microscope	Nikon	TMS
N. gruberi	ATCC	30224
Nucleic Acid	Chem Impex Int’l	#01625
Peptone	Gibco	211677
pGEM	Promega	P2251
Potassium Phosphate	Sigma Aldrich	P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit	Bio Rad	1645052
Sodium Chloride	MCB Reagents	SX0420
Sodium Phosphate, dibasic	Sigma Aldrich	S2554
Tabletop Centrifuge	eppendorf	5415R
Tris, base	Sigma Aldrich	T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%	Gibco	15250-061
ViaFect Reagent	Promega	E4981
Weigh Scale	Denver Instruments	APX-60
Yeast Extract	Gibco	212750