טרנספקציה של שיבוט מולקולרי של Naegleria gruberi rDNA לתוך N. gruberi Trophozoites

Summary

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להעברת טרופוזואיטים Naegleria gruberi עם מבנה הנשמר לאורך טרופוזואיטים חולפים במבחנה, כמו גם באמצעות אנציסטמנט והתרגשות.

Abstract

כל הגנים הריבוזומליים של Naegleria trophozoites נשמרים ב-DNA ריבוזומלי חוץ-כרומוזומלי סגור (rDNA) המכיל יסוד (CERE). בעוד שמעט ידוע על CERE, ניתוח רצף גנום מלא של שלושה מיני Naegleria מראה בבירור כי אין rDNA cistrons בגנום הגרעיני. יתר על כן, מקור DNA יחיד של שכפול מופה ב- N. gruberi CERE, מה שתומך בהשערה כי CERE משתכפל ללא תלות בגנום הגרעיני. מאפיין CERE זה מצביע על כך שייתכן שניתן יהיה להשתמש ב- CERE מהונדס כדי להחדיר חלבונים זרים לטרופוזואיטים Naegleria . כצעד הראשון בחקר השימוש ב-CERE כווקטור בנגלריה, פיתחנו פרוטוקול להעתקת N. gruberi עם שיבוט מולקולרי של N. gruberi CERE המשובט לתוך pGEM7zf+ (pGRUB). לאחר הטרנספקציה, pGRUB זוהה בקלות ב- N. gruberi trophozoites במשך שבעה קטעים לפחות, כמו גם באמצעות אנציסטמנט והתרגשות. כביקורת, טרופוזואיטים הודבקו בווקטור עמוד השדרה, pGEM7zf+, ללא רצפי N. gruberi (pGEM). pGEM לא זוהה לאחר המעבר הראשון לאחר טרנספקציה לתוך N. gruberi, מה שמצביע על חוסר יכולתו להשתכפל באורגניזם אאוקריוטי. מחקרים אלה מתארים פרוטוקול טרנספקציה עבור Naegleria trophozoites ומראים כי רצף פלסמיד חיידקי ב- pGRUB אינו מעכב העברה ושכפול מוצלחים של שיבוט CERE הנגוע. יתר על כן, פרוטוקול טרנספקציה זה יהיה קריטי להבנת הרצף המינימלי של CERE המניע את השכפול שלו בטרופוזואיטים, כמו גם בזיהוי אזורים רגולטוריים ברצף הלא ריבוזומלי (NRS).

Introduction

הסוג Naegleria מכיל מעל 45 מינים, אם כי לא סביר שכל בני המין זוהו¹. Naegleria יכול להתקיים בצורות שונות: כמו trophozoites (אמבות), כמו flagellates, או, כאשר המשאבים מוגבלים מאוד, כמו ציסטות 1,2,3,4. הסוג Naegleria מוכר בזכות מין אחד מסוכן במיוחד, Naegleria fowleri, המכונה "אמבה אוכלת מוח" (נסקר ב-1,2,3,4,5,6,7), שהיא הגורם לדלקת קרום המוח האמבית הראשונית הקטלנית כמעט באופן אוניברסלי.

Naegleria מקודדים את rDNA שלהם על CERE הממוקם בגרעין. ריצוף מלא של הגנום של שלושה מיני Naegleria מאשר את היעדר rDNA בגנום הגרעיני 8,9,10,11. בהתבסס על רצפי CERE מוגבלים באורך מלא, אורך CERE נע בין 10 kbp ל- 18 kbp בקירוב. CERE מכל מין של Naegleria נושא rDNA cistron יחיד (המכיל את ה- DNA הריבוזומלי 5.8, 18 ו- 28S) על כל אחד מכ- 4,000 CERE לכל תא 12,13,14. מלבד rDNA, לכל CERE יש רצף גדול שאינו rDNA (NRS). גדלי CERE משתנים בין מינים; ההבדלים נובעים בעיקר מהאורך המשתנה של ה-NRS, שכן רצפי ה-rDNA שמורים מאוד בסוג 1,15,16,17,18,19,20. המיפוי של מקור יחיד של שכפול DNA בתוך N. gruberi CERE NRS²¹ מספק תמיכה חזקה להשערה כי Naegleria CERE משכפל ללא תלות בגנום הגרעיני.

N. gruberi היא אמבה לא פתוגנית המשמשת לעתים קרובות לחקר ביולוגיה Naegleria . פיתחנו מתודולוגיה לשינוי N . gruberi trophozoites עם שיבוט CERE מאותו מין כדי לבחון את ההשערה כי Naegleria amoebae לסבול ולשכפל באופן עצמאי CERE בתוך trophozoites. זה הושג על ידי הפיכת N. gruberi עם שיבוט באורך מלא של N. gruberi CERE לטרופוזואיטים ובעקבות גורלו של שיבוט CERE התורם על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR). סקירה כללית של הפרוטוקול מתוארת באיור 1. הנתונים המוצגים כאן מראים כי ניתן לאתר את השיבוט התורם באמצעות לפחות שבעה מעברים בתרבית רקמה, כמו גם להישמר באמצעות אנציסטמנט וריגוש. מחקרים אלה מהווים את הבסיס לאמצעי לנתח כיצד CERE משתכפל, כמו גם לחקור את השימוש בו כווקטור כדי להדביק Naegleria.

Protocol

פרטי המינים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים. הרצף של מבנה pGRUB של 17,004 זוגות בסיסים מסופק בקובץ משלים 1.

1. טיפוח trophozoites

1. הפשירו טרופוזואיטים קפואים של N. gruberi בטמפרטורה של 37°C למשך 3 דקות.
2. יש לחסן את הטרופוזואיטים בצלוחיות T25 בתמצית פפטון/שמרים מעובדת/חומצת גרעין/חומצה פולית/האמין עם מדיה של 10% סרום עגל עוברי (PYNFH) בתוספת חיץ של 2% (דיסודיום פוספט, אשלגן דימימן פוספט).
3. תרבית את הטרופוזואיטים בטמפרטורה של 25°C עד ~80% במפגש, שם הם מציגים מורפולוגיה של אמבואידים (איור 2A).
   הערה: כאשר מחיים בתחילה תרבות של trophozoites ממצבם הקפוא, זה יכול לקחת עד 5-7 ימים עבור T25 להיות confluent. דקנט מדיה כל 3-4 ימים ולהחליף במדיה טרייה.
4. הניחו את הצלוחיות על קרח למשך 5-10 דקות כדי לשחרר את הטרופוזואיטים המודבקים מהפלסטיק. סובבו בעדינות את הבקבוק כדי לעקור את התאים הדבקים שנותרו. לטרופוזואיטים יש כעת מורפולוגיה "מעוגלת" (איור 2B).
5. חלקו את התרביות 1:2 עד 1:4 לצלוחיות תרבית רקמה חדשות.
6. הסר את PYNFH והחלף אותו במדיה אנציסטמנטית סטרילית (120 mM נתרן כלורי, 0.03 mM מגנזיום כלורי, 1 mM דיסודיום פוספט, 1 mM אשלגן דימימן פוספט, 0.03 mM סידן כלורי, 0.02 mM ברזל כלורי, pH 6.8)²² כדי encyst N . gruberi.
   הערה: רוב הטרופוזואיטים מתכווצים עד 72 שעות (איור 2C). יש להשלים את ההתרגשות תוך 72 שעות.
7. הסר ציסטות מצלוחיות, צנטריפוגה ב 600 x גרם למשך 10 דקות ב 20 ° C, והשהה מחדש ציסטות במדיה PYNFH עם 10% סרום עגל עובר כדי להוציא את התאים. לדגור ב 25 ° C במשך 24 שעות עד trophozoites מתחילים להופיע.

2. הדבקת trophozoites

1. צלחת trophozoites לתוך צלחת 6 היטב תחתית שטוחה רקמה צלחת (1 מ"ל של 1 x 10⁶ trophozoites / מ"ל) ותרבית ב 25 ° C.
2. להדביק את התאים כאשר הם מגיעים 70%-80% confluent (~ 10.4 x 10⁴ תאים / ס"מ² באשכולות 6 בארות). חממו את מגיב הטרנספקציה לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
3. הכן את תערובת מגיב פלסמיד transfection כדלקמן: 75 ng של DNA פלסמיד ו 0.225 μL של מגיב transfection ב 200 μL של מדיה PYNFH ללא FBS. הכינו תערובת מגיב פלסמיד מספקת לביצוע טרנספקציה כפולה.
   הערה: במחקר זה נעשה שימוש בפלסמיד חיידקי המכיל שיבוט באורך מלא של N. gruberi CERE (pGRUB). פלסמיד ריק (pGEM) שימש כבקרה שלילית (איור 3).
4. לדגור על תערובת מגיב פלסמיד transfection בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
5. הסר ~ 800 μL של מדיום מן monolayers trophozoite ממש לפני transfection.
6. שים את תערובת מגיב transfection פלסמיד על trophozoites.
7. מערבלים בעדינות את הצלחת כל 15 דקות כדי למנוע הצטברות המדיה בשולי הצלחת.
8. לשטוף את monolayers פעם אחת עם 2 מ"ל של מדיום הצמיחה לאחר 1 שעה דגירה ב 25 ^{°C (75 °}F).
9. יש לטפל בחד-שכבות עם 10 U DNase ב-1 מ"ל של חיץ DNase 10x למשך 15 דקות ב-37°C כדי להסיר שאריות DNA פלסמיד, לשטוף פעם אחת עם מצע צמיחה, להוסיף 2 מ"ל של מדיה טרייה ולהניח בטמפרטורה של 25°C. דוגרים על הצלחת במשך 24-36 שעות.
10. מניחים את הצלחת על קרח למשך 10 דקות כדי לשחרר תאים.
11. פיצול באר אחת (1:2) לשתי בארות חדשות.
12. לאסוף trophozoites מן הבארות הנותרות למטרות ניסיוניות.
    הערה: כל התרבויות מבוצעות בכפילות. עבור כל מצב, באר אחת משמשת למעבר, ו -1 משמשת לבידוד CERE.

3. בידוד CERE מ Naegleria

1. חשב את מספר trophozoites בכל באר המשמש לבידוד CERE על ידי טריפאן כחול הרחקה צביעה hemocytometer²³.
2. מניחים את trophozoites בצינור 2.0 מ"ל.
3. לשטוף trophozoites פעם ב 100 mM נתרן כלורי (pH 7.5) באמצעות צנטריפוגה (600 x גרם, 10 דקות, 4 ° C).
   הערה: נתרן כלורי מונע מהטרופוזואיטים להיצמד לדפנות הצינור.
4. הסר את supernatant ו resuspend cell pellets ב 100 μL של 100 mM EDTA (pH 7.5).
5. הניחו את הצינור בבלוק חום למשך 15 דקות בטמפרטורה של 98°C כדי לשקוע בתאים ולהשבית את האנזימים בטרופוזואיטים.
   הערה: שלב זה משבית DNases, אשר נמצאים בשפע ב Naegleria trophozoites. DNases עלול להפריע ליכולת לזהות CERE מקורי ואת השיבוט המולקולרי בשלב 4. תפוקת הדנ"א יורדת כאשר בשלב 3.4 משתמשים ביותר מ~3 x 10^{6 תאים} .
6. צנטריפוגה את הצינורות במהירות הגבוהה ביותר (16,000 x גרם) ב 4 ° C במשך 10 דקות כדי להשליך את הפסולת.
7. מעבירים את הסופרנאטנטים לצינור חדש.
8. אתנול מזרז את supernatants עם 0.5 נפחים של 7.5 M אמוניום אצטט (pH 7.5), 3 נפחים של אתנול מוחלט, ו 1 μL של 10 מ"ג / מ"ל גליקוגן כנשא.
9. הפוך את הצינור מספר פעמים ומקם את הצינור ב -80 ° C לפחות 1 שעה או לילה.
10. מחממים את הדגימות לטמפרטורת החדר.
11. צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 16,000 x גרם.
12. מוציאים את הסופרנאטנט ושוטפים את הגלולה עם 70% אתנול בצנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות של 16,000 x גרם (בטמפרטורת החדר).
13. מוציאים אתנול ומייבשים את הגלולה באוויר למשך 5 דקות.
14. יש להשהות מחדש את הגלולה המיובשת במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה (DI). נרמול נפח ל 10,000 trophozoites לכל μL.
15. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש ב-PCR.

4. זיהוי PCR של trophozoites שעבר טרנספורמציה

1. השתמש ב-20,000 תאים מקבילים לדנ"א, פריימרים של 600 ננומטר (טבלה 1) ו-Taq פולימראז ובצע את ה-PCR²⁴.
   הערה: פריימרים המבחינים בין CERE מקורי לבין CERE משוכפל מפורטים בטבלה 1, וכך גם תנאי ה-PCR. איור 3 מראה את מיקום הפריימרים על המבנים. PCR ידרוש אופטימיזציה בהתאם לפריימרים המשמשים, כמו גם לתמהיל ה- PCR הספציפי בו נעשה שימוש.
2. יש לחמם במיקרוגל 0.8% אגרוז בבסיס טריס אחד, חומצה אצטית וחיץ EDTA (TAE) עד להמסת האגרוז.
3. מצננים את האגרוז ל~50 מעלות צלזיוס בטמפרטורת החדר.
4. יוצקים את התמיסה לתוך מגש יציקת ג'ל המכיל מסרק כדי ליצור בארות.
5. הניחו לג'ל לשבת בטמפרטורת החדר עד להתייצבות.
6. מניחים את הג'ל במנגנון האלקטרופורזה.
7. יש להכניס 1x TAE לתא האלקטרופורזה עד לכיסוי הג'ל.
8. הסירו את המסרק.
9. הוסיפו 6x צבע (0.25% ברומפנול כחול, 0.25% קסילן ציאנול, 30% גליצרול) לדגימות והעמיסו את הג'ל. השתמש בסולם DNA כדי לקבוע את גודל מוצר ה- PCR.
10. חבר את האלקטרודה, הפעל את ספק הכוח והפעל את הג'ל ב 80 V למשך ~ 1.5-2 שעות.
11. כבה את החשמל והסר את הג'ל.
12. הכתימו את הג'ל בצבע DNA (למשל, 10 μL של 10 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד) ב-100 מ"ל של מי DI למשך 10 דקות.
13. יש להכתים את הג'ל למשך 20 דקות במי DI.
14. דמיינו ג'ל על מערכת אור אולטרה סגול (UV) ותיעדו את התוצאות.

תוצאות

PCR של טרופוזואיטים שעברו טרנספורמציה עם pGRUB מדגים שה-CERE הנגוע מזוהה דרך לפחות שבעה מעברים של הטרופוזואיטים, כמו גם אנציסטמנט והתרגשות (איור 4). הפריימרים המשמשים ב-PCR מתאימים הן לווקטור pGEM והן לרצף CERE, ובכך מבטיחים שה-PCR לא יזהה CERE מקורי. PCR בעקבות טרנספקציה של pGEM לטרופוזואיטים...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט מאוד, אם כי סביר להניח שכל מבנה ידרוש מידה מסוימת של אופטימיזציה, במיוחד של יחס מגיב DNA-transfection, בהתאם לאופי המבנה והמין של Naegleria בשימוש. בדקנו רק מגיב טרנספקציה אחד זמין מסחרית באמצעות פרוטוקול זה, אך סביר להניח שכמה אחרים עשויים להיות יעילים. בהתחשב בכך שי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bio Rad	161-3102
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	A-7330
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75	Thermo Scientific	130190
Culture Plate, 6-well	Corning	3506
DNAse	Sigma Aldrich	D-4527
EDTA, 0.5 M	Affymetrix	15694
Electropheresis Gel Apparatus	Amersham Biosciences	80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Ethanol, 100%	Decon Laboratories	2716
Ethidium Bromide	Sigma Aldrich	E-8751
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140
Folic Acid	Sigma Aldrich	F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder	Thermo Scientific	SM1331
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Heating Block	Thermo Scientific	88871001
Hemacytometer	Hausser Scientific	1483
Hemin	Sigma Aldrich	51280
Iron Chloride	Sigma Aldrich	372870-256
Ligase	NEB	M2200S
Magneisum Chloride	Fisher Scientific	M33-500
Microfuge	Thermo Scientific	MySpin 12
Microscope	Nikon	TMS
N. gruberi	ATCC	30224
Nucleic Acid	Chem Impex Int’l	#01625
Peptone	Gibco	211677
pGEM	Promega	P2251
Potassium Phosphate	Sigma Aldrich	P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit	Bio Rad	1645052
Sodium Chloride	MCB Reagents	SX0420
Sodium Phosphate, dibasic	Sigma Aldrich	S2554
Tabletop Centrifuge	eppendorf	5415R
Tris, base	Sigma Aldrich	T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%	Gibco	15250-061
ViaFect Reagent	Promega	E4981
Weigh Scale	Denver Instruments	APX-60
Yeast Extract	Gibco	212750