Transfecção de um clone molecular de rDNA de Naegleria gruberi em trofozoítos de N. gruberi

Resumo

Este protocolo descreve uma metodologia para transfectar trofozoítos de Naegleria gruberi com uma construção que é mantida durante a passagem de trofozoítos in vitro, bem como por meio de encistamento e excistamento.

Resumo

Todos os genes ribossômicos dos trofozoítos de Naegleria são mantidos em um elemento circular fechado contendo DNA ribossômico extracromossômico (rDNA) (CERE). Embora pouco se saiba sobre o CERE, uma análise completa da sequência do genoma de três espécies de Naegleria demonstra claramente que não há cistrons de rDNA no genoma nuclear. Além disso, uma única origem de replicação do DNA foi mapeada no N. gruberi CERE, apoiando a hipótese de que o CERE se replica independentemente do genoma nuclear. Esta característica do CERE sugere que pode ser possível usar o CERE projetado para introduzir proteínas estranhas em trofozoítos de Naegleria . Como primeiro passo para explorar o uso de um CERE como vetor em Naegleria, desenvolvemos um protocolo para transfectar N. gruberi com um clone molecular do CERE de N. gruberi clonado em pGEM7zf+ (pGRUB). Após a transfecção, o pGRUB foi prontamente detectado em trofozoítos de N. gruberi por pelo menos sete passagens, bem como por encistamento e excistamento. Como controle, os trofozoítos foram transfectados com o vetor backbone, pGEM7zf+, sem as sequências de N. gruberi (pGEM). O pGEM não foi detectado após a primeira passagem após a transfecção em N. gruberi, indicando sua incapacidade de se replicar em um organismo eucariótico. Esses estudos descrevem um protocolo de transfecção para trofozoítos de Naegleria e demonstram que a sequência de plasmídeo bacteriano em pGRUB não inibe a transfecção e replicação bem-sucedidas do clone CERE transfectado. Além disso, este protocolo de transfecção será fundamental para entender a sequência mínima do CERE que impulsiona sua replicação em trofozoítos, bem como identificar regiões regulatórias na sequência não ribossômica (NRS).

Introdução

O gênero Naegleria contém mais de 45 espécies, embora seja improvável que todos os membros da espécie tenham sido identificados¹. A naegleria pode existir de diferentes formas: como trofozoítos (amebas), como flagelados ou, quando os recursos são severamente limitados, como cistos 1,2,3,4. O gênero Naegleria é reconhecido por sua única espécie particularmente perigosa, Naegleria fowleri, conhecida como 'a ameba comedora de cérebro' (revisada em 1,2,3,4,5,6,7), que é a causa da meningoencefalite amebiana primária quase universalmente fatal.

Naegleria codifica seu rDNA no CERE localizado no nucléolo. O sequenciamento completo dos genomas de três espécies de Naegleria confirma a ausência de rDNA no genoma nuclear 8,9,10,11. Com base nas sequências CERE de comprimento total limitadas, o CERE varia de aproximadamente 10 kbp a 18 kbp de comprimento. CERE de cada espécie de Naegleria carrega um único cistron de rDNA (contendo o DNA ribossômico 5.8, 18 e 28S) em cada um dos aproximadamente 4.000 CERE por célula 12,13,14. Além do rDNA, cada CERE tem uma grande sequência não-rDNA (NRS). Os tamanhos do CERE variam entre as espécies; as diferenças são principalmente devidas ao comprimento variável do NRS, já que as sequências de rDNA são altamente conservadas em todo o gênero 1,15,16,17,18,19,20. O mapeamento de uma única origem de replicação do DNA dentro do N. gruberi CERE NRS²¹ fornece forte suporte para a hipótese de que Naegleria CERE se replica independentemente do genoma nuclear.

N. gruberi é uma ameba não patogênica frequentemente usada para estudar a biologia de Naegleria . Desenvolvemos uma metodologia para transformar trofozoítos de N. gruberi com um clone de CERE da mesma espécie para testar a hipótese de que as amebas de Naegleria toleram e replicam independentemente o CERE dentro dos trofozoítos. Isso foi conseguido transformando N. gruberi com um clone completo de N. gruberi CERE em trofozoítos e seguindo os destinos do clone CERE do doador por reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma visão geral do protocolo é descrita na Figura 1. Os dados aqui apresentados demonstram que o clone do doador pode ser detectado por meio de pelo menos sete passagens em cultura de tecidos, bem como ser mantido por encistamento e excistamento. Esses estudos formam a base para um meio de dissecar como o CERE se replica, bem como explorar seu uso como vetor para transfectar Naegleria.

Protocolo

Os detalhes das espécies, reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais. A sequência da construção pGRUB de 17.004 pares de bases é fornecida no Arquivo Suplementar 1.

1. Cultura de trofozoítos

1. Descongele os trofozoítos de N. gruberi congelados a 37 °C durante 3 min.
2. Inocular trofozoítos em frascos T25 em peptona/extrato de levedura/ácido nucleico/ácido fólico/hemina modificados com 10% de meio de soro fetal de bezerro (PYNFH) mais tampão 2% (fosfato dissódico, di-hidrogenofosfato de potássio).
3. Cultive os trofozoítos a 25 ° C até ~ 80% confluentes, onde exibem uma morfologia amebóide (Figura 2A).
   NOTA: Ao reviver inicialmente uma cultura de trofozoítos de seu estado congelado, pode levar de 5 a 7 dias para que um T25 se torne confluente. Transvase a mídia a cada 3-4 dias e substitua por mídia nova.
4. Coloque os frascos confluentes no gelo por 5 a 10 minutos para liberar os trofozoítos aderidos do plástico. Gire suavemente o frasco para desalojar quaisquer células aderentes restantes. Os trofozoítos agora têm uma morfologia "arredondada" (Figura 2B).
5. Divida as culturas 1:2 a 1:4 em novos frascos de cultura de tecidos.
6. Remova o PYNFH e substitua-o por meio de encistamento estéril (cloreto de sódio 120 mM, cloreto de magnésio 0,03 mM, fosfato dissódico 1 mM, di-hidrogenofosfato de potássio 1 mM, cloreto de cálcio 0,03 mM, cloreto de ferro 0,02 mM, pH 6,8)²² para encistar o N. gruberi.
   NOTA: A maioria dos trofozoítos torna-se encistada por 72 h ( Figura 2C ). O excisto deve ser concluído em 72 h.
7. Remova os cistos dos frascos, centrifugue a 600 x g por 10 min a 20 ° C e ressuspenda os cistos em meio PYNFH com 10% de soro fetal de bezerro para excistar as células. Incubar a 25 °C durante 24 h até que os trofozoítos comecem a emergir.

2. Transfectar trofozoítos

1. Colocar os trofozoítos numa placa de cultura de tecidos de fundo plano de 6 poços (1 ml de 1 x 10⁶ trofozoítos/ml) e cultivar a 25 °C.
2. Transfectar as células quando atingirem 70%-80% confluentes (~10,4 x 10⁴ células/^cm2 em clusters de 6 poços). Aqueça o reagente de transfecção à temperatura ambiente antes de usar.
3. Prepare a mistura de reagente de plasmídeo-transfecção da seguinte forma: 75 ng de DNA de plasmídeo e 0,225 μL do reagente de transfecção em 200 μL de meio PYNFH sem FBS. Prepare uma mistura de reagentes de plasmídeo-transfecção suficiente para realizar a transfecção em duplicado.
   NOTA: Um plasmídeo bacteriano contendo um clone completo de N. gruberi CERE (pGRUB) foi usado neste estudo. O plasmídeo vazio (pGEM) foi usado como controle negativo (Figura 3).
4. Incubar a mistura de reagentes de plasmídeo-transfecção à temperatura ambiente durante 10 min.
5. Remova ~ 800 μL de meio das monocamadas de trofozoíto imediatamente antes da transfecção.
6. Coloque a mistura de reagente de plasmídeo-transfecção nos trofozoítos.
7. Gire suavemente a placa a cada 15 minutos para evitar que a mídia se agregue nas bordas da placa.
8. Lave as monocamadas uma vez com 2 ml de meio de crescimento após 1 h de incubação a 25 ^°C.
9. Trate as monocamadas com 10 U DNase em 1 mL de tampão 10x DNase por 15 min a 37 ° C para remover o DNA do plasmídeo residual, lave uma vez com meio de crescimento, adicione 2 mL de meio fresco e coloque a 25 ° C. Incube a placa por 24-36 h.
10. Coloque o prato no gelo por 10 min para liberar as células.
11. Divida um poço (1:2) em dois novos poços.
12. Colete trofozoítos dos poços restantes para fins experimentais.
    NOTA: Todas as culturas são realizadas em duplicata. Para cada condição, 1 poço é usado para passagem e 1 é usado para isolamento CERE.

3. Isolando CERE de Naegleria

1. Calcule o número de trofozoítos em cada poço usado para isolamento CERE por coloração de exclusão de azul de tripano e um hemocitômetro²³.
2. Colocar os trofozoítos num tubo de 2,0 ml.
3. Lave os trofozoítos uma vez em cloreto de sódio a 100 mM (pH 7,5) por centrifugação (600 x g, 10 min, 4 ° C).
   NOTA: O cloreto de sódio impede que os trofozoítos adiram às laterais do tubo.
4. Remova o sobrenadante e ressuspenda os grânulos celulares em 100 μL de EDTA 100 mM (pH 7,5).
5. Coloque o tubo em um bloco de calor por 15 min a 98 ° C para lisar as células e inativar as enzimas nos trofozoítos.
   NOTA: Esta etapa inativa DNases, que são abundantes em trofozoítos de Naegleria . As DNases podem interferir na capacidade de detectar CERE nativo e o clone molecular na etapa 4. O rendimento do DNA diminui quando mais de ~ 3 x 10⁶ células são usadas na etapa 3.4.
6. Centrifugue os tubos na velocidade máxima (16.000 x g) a 4 °C por 10 min para pellet os detritos.
7. Transferir os sobrenadantes para um novo tubo.
8. O etanol precipita os sobrenadantes com 0,5 volumes de acetato de amônio 7,5 M (pH 7,5), 3 volumes de etanol absoluto e 1 μL de glicogênio 10 mg / mL como transportador.
9. Inverter o tubo várias vezes e colocá-lo a -80 °C durante pelo menos 1 h ou durante a noite.
10. Aqueça as amostras à temperatura ambiente.
11. Centrifugue os tubos à temperatura ambiente por 10 min a 16.000 x g.
12. Remova o sobrenadante e lave o pellet com etanol a 70% por centrifugação por 5 min a 16.000 x g (à temperatura ambiente).
13. Remova o etanol e seque o pellet ao ar por 5 min.
14. Ressuspenda o pellet seco em água deionizada estéril (DI). Normalize o volume para 10.000 trofozoítos por μL.
15. Conservar a -80 °C até ser utilizado em PCR.

4. Detecção por PCR de trofozoítos transformados

1. Use 20.000 equivalentes celulares de DNA, primers de 600 nM (Tabela 1) e Taq polimerase e realize a PCR²⁴.
   NOTA: Os primers que distinguem entre o CERE nativo e o CERE clonado estão listados na Tabela 1, assim como as condições de PCR. A Figura 3 mostra a localização dos primers nos construtos. A PCR exigirá otimização dependendo dos primers usados, bem como da mistura específica de PCR utilizada.
2. Microondas 0,8% agarose em 1x base Tris, ácido acético e tampão EDTA (TAE) até que a agarose seja dissolvida.
3. Resfrie a agarose a ~ 50 ° C em temperatura ambiente.
4. Despeje a solução em uma bandeja de fundição de gel contendo um pente para formar poços.
5. Deixe o gel descansar em temperatura ambiente até solidificar.
6. Coloque o gel no aparelho de eletroforese.
7. Transvase 1x TAE na câmara de eletroforese até que o gel esteja coberto.
8. Retire o pente.
9. Adicione 6x corante de carga (0,25% azul de bromfenol, 0,25% xileno cianol, 30% glicerol) às amostras e carregue o gel. Use uma escada de DNA para determinar o tamanho do produto de PCR.
10. Conecte o eletrodo, ligue a fonte de alimentação e execute o gel a 80 V por ~ 1.5-2 h.
11. Desligue a energia e remova o gel.
12. Manchar o gel com corante de DNA (por exemplo, 10 μL de brometo de etídio 10 mg/mL) em 100 mL de água DI por 10 min.
13. Destain o gel por 20 min em água DI.
14. Visualize o gel em um sistema de luz ultravioleta (UV) e documente os resultados.

Resultados

A PCR de trofozoítos que foram transfectados com pGRUB demonstra que o CERE transfectado é detectado através de pelo menos sete passagens dos trofozoítos, bem como encistamento e excistamento (Figura 4). Os primers usados na PCR recoecem tanto para o vetor pGEM quanto para a sequência CERE, garantindo assim que a PCR não detecte CERE nativo. A PCR após a transfecção de pGEM em trofozoítos indicou que o pGEM foi negativo (Figura 4), indicando que o plas...

Discussão

O protocolo descrito aqui é muito simples, embora cada construção provavelmente exija algum grau de otimização, particularmente da proporção de reagentes de transfecção de DNA, dependendo da natureza da construção e da espécie de Naegleria usada. Testamos apenas um reagente de transfecção disponível comercialmente usando este protocolo, mas é provável que vários outros possam ser eficazes. Dado que um clone completo do CERE é usado, contendo uma origem funcional de replicação e, portanto, re...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bio Rad	161-3102
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	A-7330
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75	Thermo Scientific	130190
Culture Plate, 6-well	Corning	3506
DNAse	Sigma Aldrich	D-4527
EDTA, 0.5 M	Affymetrix	15694
Electropheresis Gel Apparatus	Amersham Biosciences	80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Ethanol, 100%	Decon Laboratories	2716
Ethidium Bromide	Sigma Aldrich	E-8751
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140
Folic Acid	Sigma Aldrich	F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder	Thermo Scientific	SM1331
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Heating Block	Thermo Scientific	88871001
Hemacytometer	Hausser Scientific	1483
Hemin	Sigma Aldrich	51280
Iron Chloride	Sigma Aldrich	372870-256
Ligase	NEB	M2200S
Magneisum Chloride	Fisher Scientific	M33-500
Microfuge	Thermo Scientific	MySpin 12
Microscope	Nikon	TMS
N. gruberi	ATCC	30224
Nucleic Acid	Chem Impex Int’l	#01625
Peptone	Gibco	211677
pGEM	Promega	P2251
Potassium Phosphate	Sigma Aldrich	P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit	Bio Rad	1645052
Sodium Chloride	MCB Reagents	SX0420
Sodium Phosphate, dibasic	Sigma Aldrich	S2554
Tabletop Centrifuge	eppendorf	5415R
Tris, base	Sigma Aldrich	T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%	Gibco	15250-061
ViaFect Reagent	Promega	E4981
Weigh Scale	Denver Instruments	APX-60
Yeast Extract	Gibco	212750