Transfección de un clon molecular de ADNr de Naegleria gruberi en trofozoítos de N. gruberi

Resumen

Este protocolo describe una metodología para transfectar trofozoítos de Naegleria gruberi con un constructo que se mantiene a lo largo del paso de trofozoítos in vitro, así como a través del enquistamiento y la excystación.

Resumen

Todos los genes ribosómicos de los trofozoítos de Naegleria se mantienen en un elemento que contiene ADN ribosómico (ADNr) circular cerrado (ADNr) (CERE). Si bien se sabe poco sobre el CERE, un análisis completo de la secuencia del genoma de tres especies de Naegleria demuestra claramente que no hay cistrones de ADNr en el genoma nuclear. Además, se ha mapeado un único origen de replicación del ADN en el CERE de N. gruberi , lo que apoya la hipótesis de que el CERE se replica independientemente del genoma nuclear. Esta característica de CERE sugiere que puede ser posible utilizar CERE modificado para introducir proteínas extrañas en los trofozoítos de Naegleria . Como primer paso para explorar el uso de un CERE como vector en Naegleria, desarrollamos un protocolo para transfectar N. gruberi con un clon molecular del CERE de N. gruberi clonado en pGEM7zf+ (pGRUB). Después de la transfección, se detectó fácilmente pGRUB en trofozoítos de N. gruberi en al menos siete pasajes, así como a través de enquistamiento y excitación. Como control, los trofozoítos se transfectaron con el vector troncal, pGEM7zf+, sin las secuencias de N. gruberi (pGEM). La pGEM no se detectó después del primer paso después de la transfección en N. gruberi, lo que indica su incapacidad para replicarse en un organismo eucariota. Estos estudios describen un protocolo de transfección para los trofozoítos de Naegleria y demuestran que la secuencia de plásmidos bacterianos en pGRUB no inhibe la transfección y replicación exitosas del clon CERE transfectado. Además, este protocolo de transfección será fundamental para comprender la secuencia mínima del CERE que impulsa su replicación en trofozoítos, así como para identificar regiones reguladoras en la secuencia no ribosómica (NRS).

Introducción

El género Naegleria contiene más de 45 especies, aunque es poco probable que todos los miembros de la especie hayan sido identificados¹. Naegleria puede existir en diferentes formas: como trofozoítos (amebas), como flagelados o, cuando los recursos son muy limitados, como quistes 1,2,3,4. El género Naegleria es reconocido por su especie particularmente peligrosa, Naegleria fowleri, conocida como "la ameba comecerebros" (revisado en ^{1,2,3,4,5,6,7}

Protocolo

Los detalles de las especies, reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales. La secuencia de la construcción pGRUB de 17.004 pares de bases se proporciona en el Archivo Suplementario 1.

1. Cultivo de trofozoítos

1. Descongele los trofozoítos congelados de N. gruberi a 37 °C durante 3 min.
2. Inocular trofozoítos en matraces T25 en peptona/extracto de levadura/ácido nucleico/ácido fólico/hemina modificados con un 10% de medios de suero fetal de ternero (PYNFH) más un 2% de tampón (fosfato disódico, fosfato de dihidrógeno potásico)....

Discusión

El protocolo descrito en este documento es muy sencillo, aunque es probable que cada constructo requiera algún grado de optimización, en particular de la proporción de reactivos de transfección y ADN, dependiendo de la naturaleza del constructo y de la especie de Naegleria utilizada. Solo hemos probado un reactivo de transfección disponible comercialmente utilizando este protocolo, pero es probable que varios otros puedan ser efectivos. Dado que se utiliza un clon de longitud completa del CERE, que contiene.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bio Rad	161-3102
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	A-7330
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75	Thermo Scientific	130190
Culture Plate, 6-well	Corning	3506
DNAse	Sigma Aldrich	D-4527
EDTA, 0.5 M	Affymetrix	15694
Electropheresis Gel Apparatus	Amersham Biosciences	80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Ethanol, 100%	Decon Laboratories	2716
Ethidium Bromide	Sigma Aldrich	E-8751
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140
Folic Acid	Sigma Aldrich	F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder	Thermo Scientific	SM1331
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Heating Block	Thermo Scientific	88871001
Hemacytometer	Hausser Scientific	1483
Hemin	Sigma Aldrich	51280
Iron Chloride	Sigma Aldrich	372870-256
Ligase	NEB	M2200S
Magneisum Chloride	Fisher Scientific	M33-500
Microfuge	Thermo Scientific	MySpin 12
Microscope	Nikon	TMS
N. gruberi	ATCC	30224
Nucleic Acid	Chem Impex Int’l	#01625
Peptone	Gibco	211677
pGEM	Promega	P2251
Potassium Phosphate	Sigma Aldrich	P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit	Bio Rad	1645052
Sodium Chloride	MCB Reagents	SX0420
Sodium Phosphate, dibasic	Sigma Aldrich	S2554
Tabletop Centrifuge	eppendorf	5415R
Tris, base	Sigma Aldrich	T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%	Gibco	15250-061
ViaFect Reagent	Promega	E4981
Weigh Scale	Denver Instruments	APX-60
Yeast Extract	Gibco	212750