Transfección de un clon molecular de ADNr de Naegleria gruberi en trofozoítos de N. gruberi

Resumen

Este protocolo describe una metodología para transfectar trofozoítos de Naegleria gruberi con un constructo que se mantiene a lo largo del paso de trofozoítos in vitro, así como a través del enquistamiento y la excystación.

Resumen

Todos los genes ribosómicos de los trofozoítos de Naegleria se mantienen en un elemento que contiene ADN ribosómico (ADNr) circular cerrado (ADNr) (CERE). Si bien se sabe poco sobre el CERE, un análisis completo de la secuencia del genoma de tres especies de Naegleria demuestra claramente que no hay cistrones de ADNr en el genoma nuclear. Además, se ha mapeado un único origen de replicación del ADN en el CERE de N. gruberi , lo que apoya la hipótesis de que el CERE se replica independientemente del genoma nuclear. Esta característica de CERE sugiere que puede ser posible utilizar CERE modificado para introducir proteínas extrañas en los trofozoítos de Naegleria . Como primer paso para explorar el uso de un CERE como vector en Naegleria, desarrollamos un protocolo para transfectar N. gruberi con un clon molecular del CERE de N. gruberi clonado en pGEM7zf+ (pGRUB). Después de la transfección, se detectó fácilmente pGRUB en trofozoítos de N. gruberi en al menos siete pasajes, así como a través de enquistamiento y excitación. Como control, los trofozoítos se transfectaron con el vector troncal, pGEM7zf+, sin las secuencias de N. gruberi (pGEM). La pGEM no se detectó después del primer paso después de la transfección en N. gruberi, lo que indica su incapacidad para replicarse en un organismo eucariota. Estos estudios describen un protocolo de transfección para los trofozoítos de Naegleria y demuestran que la secuencia de plásmidos bacterianos en pGRUB no inhibe la transfección y replicación exitosas del clon CERE transfectado. Además, este protocolo de transfección será fundamental para comprender la secuencia mínima del CERE que impulsa su replicación en trofozoítos, así como para identificar regiones reguladoras en la secuencia no ribosómica (NRS).

Introducción

El género Naegleria contiene más de 45 especies, aunque es poco probable que todos los miembros de la especie hayan sido identificados¹. Naegleria puede existir en diferentes formas: como trofozoítos (amebas), como flagelados o, cuando los recursos son muy limitados, como quistes 1,2,3,4. El género Naegleria es reconocido por su especie particularmente peligrosa, Naegleria fowleri, conocida como "la ameba comecerebros" (revisado en ^{1,2,3,4,5,6,7}), que es la causa de la meningoencefalitis amebiana primaria casi universalmente fatal.

Naegleria codifica su ADNr en el CERE ubicado en el nucléolo. La secuenciación completa de los genomas de tres especies de Naegleria confirma la ausencia de ADNr en el genoma nuclear 8,9,10,11. Sobre la base de las secuencias limitadas de CERE de longitud completa, el CERE oscila entre aproximadamente 10 kbp y 18 kbp de longitud. Los CERE de cada especie de Naegleria llevan un solo cistrón de ADNr (que contiene el ADN ribosómico 5.8, 18 y 28S) en cada uno de aproximadamente 4,000 CERE por célula 12,13,14. Aparte del ADNr, cada CERE tiene una gran secuencia no ADNr (NRS). Los tamaños de los CERE varían de una especie a otra; las diferencias se deben principalmente a la variación de la longitud del NRS, ya que las secuencias de ADNr están muy conservadas en el género 1,15,16,17,18,19,20. El mapeo de un único origen de replicación del ADN dentro de N. gruberi CERE NRS²¹ proporciona un fuerte apoyo a la hipótesis de que Naegleria CERE se replica independientemente del genoma nuclear.

N. gruberi es una ameba no patógena que se utiliza a menudo para estudiar la biología de Naegleria . Desarrollamos una metodología para transformar trofozoítos de N. gruberi con un clon de CERE de la misma especie para probar la hipótesis de que las amebas de Naegleria toleran y replican de forma independiente CERE dentro de los trofozoítos. Esto se logró transformando N. gruberi con un clon completo de N. gruberi CERE en trofozoítos y siguiendo el destino del clon CERE donante mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la Figura 1 se describe una descripción general del protocolo. Los datos presentados en este documento demuestran que el clon del donante puede detectarse a través de al menos siete pasajes en cultivo de tejidos, así como mantenerse mediante enquistamiento y excystment. Estos estudios forman la base de un medio para diseccionar cómo se replica CERE, así como explorar su uso como vector para transfectar Naegleria.

Protocolo

Los detalles de las especies, reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales. La secuencia de la construcción pGRUB de 17.004 pares de bases se proporciona en el Archivo Suplementario 1.

1. Cultivo de trofozoítos

1. Descongele los trofozoítos congelados de N. gruberi a 37 °C durante 3 min.
2. Inocular trofozoítos en matraces T25 en peptona/extracto de levadura/ácido nucleico/ácido fólico/hemina modificados con un 10% de medios de suero fetal de ternero (PYNFH) más un 2% de tampón (fosfato disódico, fosfato de dihidrógeno potásico).
3. Cultivar los trofozoítos a 25 °C hasta ~80% confluentes, donde exhiben una morfología ameboide (Figura 2A).
   NOTA: Cuando se revive inicialmente un cultivo de trofozoítos de su estado congelado, un T25 puede tardar hasta 5-7 días en confluente. Decantar los medios cada 3-4 días y reemplazarlos con medios nuevos.
4. Coloque los matraces confluentes en hielo durante 5-10 minutos para liberar los trofozoítos adheridos del plástico. Agite suavemente el matraz para desalojar las células adherentes restantes. Los trofozoítos ahora tienen una morfología "redondeada" (Figura 2B).
5. Divida los cultivos 1:2 a 1:4 en nuevos matraces de cultivo de tejidos.
6. Retire el PYNFH y reemplácelo con medios de enquistamiento estériles (cloruro de sodio 120 mM, cloruro de magnesio 0,03 mM, fosfato disódico 1 mM, fosfato dihidrógeno de potasio 1 mM, cloruro de calcio 0,03 mM, cloruro de hierro 0,02 m, pH 6,8)²² para enquistar el N. gruberi.
   NOTA: La mayoría de los trofozoítos se enquistan a las 72 h (Figura 2C). La extracción debe completarse dentro de las 72 h.
7. Extraer los quistes de los matraces, centrifugar a 600 x g durante 10 min a 20 °C y resuspender los quistes en medios PYNFH con un 10% de suero fetal de ternero para excyster las células. Incubar a 25 °C durante 24 h hasta que comiencen a emerger los trofozoítos.

2. Transfección de trofozoítos

1. Colocar los trofozoítos en una placa de cultivo de tejidos de fondo plano de 6 pocillos (1 mL de 1 x 10⁶ trofozoítos/mL) y cultivar a 25 °C.
2. Transfecte las células cuando alcancen el 70%-80% de confluentes (~10,4 x 10⁴ células/^cm2 en grupos de 6 pocillos). Caliente el reactivo de transfección a temperatura ambiente antes de usarlo.
3. Prepare la mezcla de reactivo de transfección y plásmido de la siguiente manera: 75 ng de ADN plasmídico y 0,225 μL del reactivo de transfección en 200 μL de medio PYNFH sin FBS. Prepare suficiente mezcla de reactivo de transfección de plásmidos para realizar la transfección por duplicado.
   NOTA: En este estudio se utilizó un plásmido bacteriano que contiene un clon completo de N. gruberi CERE (pGRUB). Se utilizó plásmido vacío (pGEM) como control negativo (Figura 3).
4. Incubar la mezcla de reactivo de transfección de plásmidos a temperatura ambiente durante 10 min.
5. Retire ~ 800 μL de medio de las monocapas de trofozoíto justo antes de la transfección.
6. Coloque la mezcla de reactivo de transfección de plásmidos sobre los trofozoítos.
7. Gire suavemente la placa cada 15 minutos para evitar que los medios se agreguen en los bordes de la placa.
8. Lavar las monocapas una vez con 2 mL de medio de crecimiento después de 1 h de incubación a 25 ^°C.
9. Trate las monocapas con 10 U de DNasa en 1 mL de tampón de DNasa 10x durante 15 min a 37 °C para eliminar el ADN plasmídico residual, lave una vez con medio de crecimiento, agregue 2 mL de medio fresco y colóquelo a 25 °C. Incubar la placa durante 24-36 h.
10. Coloque el plato sobre hielo durante 10 minutos para liberar las células.
11. Divida un pozo (1:2) en dos pozos nuevos.
12. Recoja trofozoítos de los pozos restantes con fines experimentales.
    NOTA: Todos los cultivos se realizan por duplicado. Para cada condición, se usa 1 pozo para el paso y 1 para el aislamiento CERE.

3. Aislar a CERE de Naegleria

1. Calcular el número de trofozoítos en cada pocillo utilizados para el aislamiento de CERE mediante tinción de exclusión con azul de tripano y un hemocitómetro²³.
2. Coloque los trofozoítos en un tubo de 2.0 mL.
3. Lavar los trofozoítos una vez en 100 mM de cloruro de sodio (pH 7,5) mediante centrifugación (600 x g, 10 min, 4 °C).
   NOTA: El cloruro de sodio evita que los trofozoítos se adhieran a los lados del tubo.
4. Retirar el sobrenadante y resuspender los gránulos celulares en 100 μL de 100 mM de EDTA (pH 7,5).
5. Coloque el tubo en un bloque de calor durante 15 minutos a 98 °C para lisar las células e inactivar las enzimas de los trofozoítos.
   NOTA: Este paso inactiva las DNasas, que son abundantes en los trofozoítos de Naegleria . Las DNasas pueden interferir con la capacidad de detectar CERE nativo y el clon molecular en el paso 4. El rendimiento de ADN disminuye cuando se utilizan más de ~ 3 x 10⁶ células en el paso 3.4.
6. Centrifugar los tubos a máxima velocidad (16.000 x g) a 4 °C durante 10 min para pellet los residuos.
7. Transfiera los sobrenadantes a un tubo nuevo.
8. El etanol precipita los sobrenadantes con 0,5 volúmenes de acetato de amonio 7,5 M (pH 7,5), 3 volúmenes de etanol absoluto y 1 μL de 10 mg/mL de glucógeno como portador.
9. Invierta el tubo varias veces y colóquelo a -80 °C durante al menos 1 h o toda la noche.
10. Caliente las muestras a temperatura ambiente.
11. Centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 10 min a 16.000 x g.
12. Retirar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol al 70% por centrifugación durante 5 min a 16.000 x g (a temperatura ambiente).
13. Retire el etanol y seque al aire el pellet durante 5 min.
14. Vuelva a suspender el pellet seco en agua desionizada estéril (DI). Normalizar el volumen a 10.000 trofozoítos por μL.
15. Almacenar a -80 °C hasta su uso en PCR.

4. Detección por PCR de trofozoítos transformados

1. Utilice 20.000 equivalentes celulares de ADN, cebadores de 600 nM (Tabla 1) y polimerasa Taq y realice la PCR²⁴.
   NOTA: En la Tabla 1 se enumeran los cebadores que distinguen entre el CERE nativo y el CERE clonado, al igual que las condiciones de PCR. La Figura 3 muestra la ubicación de los cebadores en los constructos. La PCR requerirá optimización en función de los cebadores utilizados, así como de la mezcla específica de PCR utilizada.
2. Cocine en el microondas agarosa al 0,8% en 1x base Tris, ácido acético y tampón EDTA (TAE) hasta que la agarosa se disuelva.
3. Enfriar la agarosa a ~50 °C a temperatura ambiente.
4. Vierta la solución en una bandeja de fundición de gel que contenga un peine para formar pocillos.
5. Deje reposar el gel a temperatura ambiente hasta que se solidifique.
6. Coloque el gel en el aparato de electroforesis.
7. Decantar 1x TAE en la cámara de electroforesis hasta que el gel esté cubierto.
8. Retira el peine.
9. Añada 6 colorantes de carga (0,25 % azul de bromfenol, 0,25 % xileno cianol, 30 % glicerol) a las muestras y cargue el gel. Utilice una escalera de ADN para determinar el tamaño del producto de PCR.
10. Conecte el electrodo, encienda la fuente de alimentación y haga funcionar el gel a 80 V durante ~ 1,5-2 h.
11. Apague la alimentación y retire el gel.
12. Tiñir el gel con colorante de ADN (por ejemplo, 10 μL de 10 mg/mL de bromuro de etidio) en 100 mL de agua desionizada durante 10 min.
13. Quita el gel durante 20 minutos en agua desionizada.
14. Visualice el gel en un sistema de luz ultravioleta (UV) y documente los resultados.

Resultados

La PCR de los trofozoítos que han sido transfectados con pGRUB demuestra que el CERE transfectado se detecta a través de al menos siete pasajes de los trofozoítos, así como el enquistamiento y la excitación (Figura 4). Los cebadores utilizados en la PCR recocen tanto al vector pGEM como a la secuencia CERE, lo que garantiza que la PCR no detecte CERE nativo. La PCR tras la transfección de pGEM en trofozoítos indicó que el pGEM fue negativo (Figura 4), lo...

Discusión

El protocolo descrito en este documento es muy sencillo, aunque es probable que cada constructo requiera algún grado de optimización, en particular de la proporción de reactivos de transfección y ADN, dependiendo de la naturaleza del constructo y de la especie de Naegleria utilizada. Solo hemos probado un reactivo de transfección disponible comercialmente utilizando este protocolo, pero es probable que varios otros puedan ser efectivos. Dado que se utiliza un clon de longitud completa del CERE, que contiene...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bio Rad	161-3102
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	A-7330
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75	Thermo Scientific	130190
Culture Plate, 6-well	Corning	3506
DNAse	Sigma Aldrich	D-4527
EDTA, 0.5 M	Affymetrix	15694
Electropheresis Gel Apparatus	Amersham Biosciences	80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Ethanol, 100%	Decon Laboratories	2716
Ethidium Bromide	Sigma Aldrich	E-8751
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140
Folic Acid	Sigma Aldrich	F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder	Thermo Scientific	SM1331
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Heating Block	Thermo Scientific	88871001
Hemacytometer	Hausser Scientific	1483
Hemin	Sigma Aldrich	51280
Iron Chloride	Sigma Aldrich	372870-256
Ligase	NEB	M2200S
Magneisum Chloride	Fisher Scientific	M33-500
Microfuge	Thermo Scientific	MySpin 12
Microscope	Nikon	TMS
N. gruberi	ATCC	30224
Nucleic Acid	Chem Impex Int’l	#01625
Peptone	Gibco	211677
pGEM	Promega	P2251
Potassium Phosphate	Sigma Aldrich	P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit	Bio Rad	1645052
Sodium Chloride	MCB Reagents	SX0420
Sodium Phosphate, dibasic	Sigma Aldrich	S2554
Tabletop Centrifuge	eppendorf	5415R
Tris, base	Sigma Aldrich	T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%	Gibco	15250-061
ViaFect Reagent	Promega	E4981
Weigh Scale	Denver Instruments	APX-60
Yeast Extract	Gibco	212750