Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, Naegleria gruberi trofozoitlerini, trofozoitlerin in vitro olarak geçirilmesi boyunca ve ayrıca kistleme ve kistleme yoluyla sürdürülen bir yapı ile transfekte etmek için bir metodolojiyi tanımlar.

Özet

Naegleria trophozoitlerin tüm ribozomal genleri, element (CERE) içeren kapalı dairesel bir kromozomal ekstrakromozomal DNA'da (rDNA) tutulur. CERE hakkında çok az şey bilinmesine rağmen, üç Naegleria türünün tam bir genom dizisi analizi, nükleer genomda rDNA sistronları olmadığını açıkça göstermektedir. Ayrıca, N. gruberi CERE'de replikasyonun tek bir DNA kökeni haritalanmıştır ve bu da CERE'nin nükleer genomdan bağımsız olarak replikasyon yaptığı hipotezini desteklemektedir. Bu CERE özelliği, Naegleria trofozoitlerine yabancı proteinler eklemek için tasarlanmış CERE'nin kullanılmasının mümkün olabileceğini düşündürmektedir. Naegleria'da bir CERE'nin bir vektör olarak kullanımını keşfetmenin ilk adımı olarak, N. gruberi'yi pGEM7zf+'ya (pGRUB) klonlanmış N. gruberi CERE'nin moleküler bir klonu ile transfekte etmek için bir protokol geliştirdik. Transfeksiyonu takiben, pGRUB, N. gruberi trofozoitlerinde en az yedi pasajın yanı sıra kistment ve eksistleme yoluyla kolayca tespit edildi. Bir kontrol olarak, trofozoitler, N. gruberi dizileri (pGEM) olmadan omurga vektörü pGEM7zf+ ile transfekte edildi. pGEM, N. gruberi'ye transfeksiyonu takip eden ilk geçişten sonra tespit edilmedi, bu da ökaryotik bir organizmada çoğalamadığını gösteriyor. Bu çalışmalar, Naegleria trofozoitleri için bir transfeksiyon protokolünü tanımlar ve pGRUB'daki bakteriyel plazmit dizisinin, transfekte edilmiş CERE klonunun başarılı transfeksiyonunu ve replikasyonunu inhibe etmediğini gösterir. Ayrıca, bu transfeksiyon protokolü, trofozoitlerde replikasyonunu yönlendiren CERE'nin minimal dizisini anlamanın yanı sıra ribozomal olmayan dizideki (NRS) düzenleyici bölgeleri tanımlamada kritik öneme sahip olacaktır.

Giriş

Naegleria cinsi 45'ten fazla tür içerir, ancak türün tüm üyelerinin tanımlanmış olması olası değildir1. Naegleria farklı şekillerde bulunabilir: trofozoitler (amipler), kamçılılar olarak veya kaynaklar ciddi şekilde sınırlı olduğunda, kistler 1,2,3,4 olarak. Naegleria cinsi, neredeyse evrensel olarak ölümcül primer amipli meningoensefalitin nedeni olan 'beyin yiyen amip' (1,2,3,4,5,6,7'de gözden geçirilmiştir) olarak bilinen, özellikle tehlikeli bir türü olan Naegleria fowleri ile tanınır.

Naegleria, rDNA'larını nükleolde bulunan CERE üzerinde kodlar. Üç Naegleria türünün genomunun tam dizilimi, nükleer genomda rDNA'nın olmadığını doğrular 8,9,10,11. Sınırlı tam uzunluktaki CERE dizilerine bağlı olarak, CERE'nin uzunluğu yaklaşık 10 kbp ile 18 kbp arasında değişir. Naegleria'nın her türünün CERE'si, hücre başına yaklaşık 4.000 CERE'nin her birinde tek bir rDNA sistronu (5.8, 18 ve 28S ribozomal DNA içeren) taşır 12,13,14. rDNA dışında, her CERE'nin büyük bir rDNA olmayan dizisi (NRS) vardır. CERE büyüklükleri türler arasında farklılık gösterir; rDNA dizileri 1,15,16,17,18,19,20 cinsi boyunca yüksek oranda korunduğundan, farklılıklar esas olarak NRS'nin değişen uzunluğundan kaynaklanmaktadır. N. gruberi CERE NRS21 içindeki tek bir DNA replikasyon orijininin haritalanması, Naegleria CERE'nin nükleer genomdan bağımsız olarak çoğaldığı hipotezi için güçlü bir destek sağlar.

N. grubir, genellikle Naegleria biyolojisini incelemek için kullanılan patojenik olmayan bir amiptir. Naegleria amoebae'nin trofozoitler içinde CERE'yi tolere ettiği ve bağımsız olarak kopyaladığı hipotezini test etmek için N. gruberi trofozoitlerini aynı türden bir CERE klonu ile dönüştürmek için bir metodoloji geliştirdik. Bu, N. gruberi'nin tam uzunlukta bir klonu olan N. gruberi CERE'nin trofozoitlere dönüştürülmesi ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile donör CERE klonunun kaderinin takip edilmesiyle gerçekleştirildi. Protokole genel bir bakış Şekil 1'de özetlenmiştir. Burada sunulan veriler, donör klonunun doku kültüründe en az yedi pasaj yoluyla tespit edilebileceğini ve ayrıca kistleme ve eksistleme yoluyla korunabileceğini göstermektedir. Bu çalışmalar, CERE'nin nasıl çoğaldığını incelemek ve Naegleria'yı transfekte etmek için bir vektör olarak kullanımını araştırmak için bir araç için temel oluşturur.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan türlerin, reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. 17.004 baz çifti pGRUB yapısının dizisi Ek Dosya 1'de verilmiştir.

1. Trofozoitlerin kültürlenmesi

  1. Dondurulmuş N. gruberi trofozoitlerini 37 ° C'de 3 dakika boyunca çözdürün.
  2. %10 fetal buzağı serumu (PYNFH) ortamı artı %2 tampon (disodyum fosfat, potasyum dihidrojen fosfat) ile modifiye pepton / maya özütü / nükleik asit / folik asit / hemin içinde T25 şişelerine trofozoitleri aşılayın.
  3. Trofozoitleri 25 ° C'de, amip morfolojisi sergiledikleri ~% 80 birleşene kadar kültürleyin (Şekil 2A).
    NOT: Başlangıçta bir trofozoit kültürünü donmuş hallerinden canlandırırken, bir T25'in birleşmesi 5-7 gün kadar sürebilir. Ortamı her 3-4 günde bir boşaltın ve yeni ortamla değiştirin.
  4. Yapışan trofozoitleri plastikten çıkarmak için birleşik şişeleri 5-10 dakika buz üzerine yerleştirin. Kalan yapışkan hücreleri çıkarmak için şişeyi hafifçe döndürün. Trofozoitler artık 'yuvarlatılmış' bir morfolojiye sahiptir (Şekil 2B).
  5. Kültürleri 1:2 ila 1:4 oranında yeni doku kültürü şişelerine bölün.
  6. PYNFH'yi çıkarın ve steril kistment ortamı (120 mM sodyum klorür, 0.03 mM magnezyum klorür, 1 mM disodyum fosfat, 1 mM potasyum dihidrojen fosfat, 0.03 mM kalsiyum klorür, 0.02 mM demir klorür, pH 6.8)22 ile değiştirin.
    NOT: Trofozoitlerin çoğu 72 saat içinde kistlenir (Şekil 2C). Eksistleme 72 saat içinde tamamlanmalıdır.
  7. Kistleri şişelerden çıkarın, 20 ° C'de 10 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin ve hücreleri çıkarmak için% 10 fetal baldır serumu ile PYNFH ortamındaki kistleri yeniden askıya alın. Trofozoitler çıkmaya başlayana kadar 25 ° C'de 24 saat inkübe edin.

2. Trofozoitlerin transfekte edilmesi

  1. Trofozoitleri 6 oyuklu düz tabanlı bir doku kültürü plakasına (1 mL 1 x 106 trofozoit / mL) yerleştirin ve 25 ° C'de kültürleyin.
  2. Hücreleri% 70 -% 80 birleşime ulaştıklarında (~ 10.4 x 104 hücre / cm2 6 oyuklu kümelerde) transfekte edin. Kullanmadan önce transfeksiyon reaktifini oda sıcaklığına ısıtın.
  3. Plazmid-transfeksiyon reaktif karışımını aşağıdaki gibi hazırlayın: FBS'siz 200 μL PYNFH ortamında 75 ng plazmit DNA ve 0.225 μL transfeksiyon reaktifi. Transfeksiyonu çift olarak gerçekleştirmek için yeterli plazmid-transfeksiyon reaktif karışımı hazırlayın.
    NOT: Bu çalışmada N. gruberi CERE'nin (pGRUB) tam uzunlukta bir klonunu içeren bir bakteri plazmidi kullanılmıştır. Negatif kontrol olarak boş plazmit (pGEM) kullanıldı (Şekil 3).
  4. Plazmid-transfeksiyon reaktif karışımını oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  5. Transfeksiyondan hemen önce trofozoit tek tabakalarından ~ 800 μL ortamı çıkarın.
  6. Plazmid-transfeksiyon reaktif karışımını trofozoitlerin üzerine koyun.
  7. Ortamın plakanın kenarlarında birikmesini önlemek için plakayı her 15 dakikada bir hafifçe döndürün.
  8. Tek katmanları 25 ° C'de 1 saat inkübe ettikten sonra 2 mL büyüme ortamı ile bir kez yıkayın.
  9. Kalıntı plazmit DNA'yı çıkarmak için tek katmanları 1 mL 10x DNaz tamponunda 10 U DNaz ile 37 ° C'de 15 dakika muamele edin, bir kez büyüme ortamı ile yıkayın, 2 mL taze ortam ekleyin ve 25 ° C'ye yerleştirin. Plakayı 24-36 saat inkübe edin.
  10. Hücreleri serbest bırakmak için plakayı 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
  11. Bir kuyuyu (1:2) iki yeni kuyuya bölün.
  12. Deneysel amaçlar için kalan kuyulardan trofozoitleri toplayın.
    NOT: Tüm kültürler çift olarak gerçekleştirilir. Her koşul için 1 kuyu geçiş, 1 kuyu ise CERE izolasyonu için kullanılır.

3. CERE'yi Naegleria'dan izole etmek

  1. Tripan mavisi dışlama boyaması ve bir hemositometre23 ile CERE izolasyonu için kullanılan her kuyucuktaki trofozoit sayısını hesaplayın.
  2. Trofozoitleri 2.0 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
  3. Trofozoitleri santrifüjleme (600 x g, 10 dakika, 4 °C) ile 100 mM sodyum klorürde (pH 7.5) bir kez yıkayın.
    NOT: Sodyum klorür, trofozoitlerin tüpün kenarlarına yapışmasını önler.
  4. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletlerini 100 μL 100 mM EDTA'da (pH 7.5) yeniden süspanse edin.
  5. Hücreleri parçalamak ve trofozoitlerdeki enzimleri etkisiz hale getirmek için tüpü 98 ° C'de 15 dakika boyunca bir ısı bloğuna yerleştirin.
    NOT: Bu adım, Naegleria trofozoitlerinde bol miktarda bulunan DNazları inaktive eder. DNazlar, 4. adımda doğal CERE'yi ve moleküler klonu tespit etme yeteneğini etkileyebilir. Adım 3.4'te ~ 3 x 106'dan fazla hücre kullanıldığında DNA verimi azalır.
  6. Kalıntıları peletlemek için tüpleri 4 °C'de en yüksek hızda (16.000 x g) 10 dakika santrifüjleyin.
  7. Süpernatanları yeni bir tüpe aktarın.
  8. Etanol, süpernatanları taşıyıcı olarak 0.5 hacim 7.5 M amonyum asetat (pH 7.5), 3 hacim mutlak etanol ve 1 μL 10 mg/mL glikojen ile çökeltir.
  9. Tüpü birkaç kez ters çevirin ve tüpü en az 1 saat veya gece boyunca -80 °C'ye yerleştirin.
  10. Numuneleri oda sıcaklığına ısıtın.
  11. Tüpleri oda sıcaklığında 16.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
  12. Süpernatanı çıkarın ve peleti 16.000 x g'da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleme ile %70 etanol ile yıkayın.
  13. Etanolü çıkarın ve peleti 5 dakika havayla kurutun.
  14. Kurutulmuş peleti steril deiyonize (DI) suda tekrar süspanse edin. Hacmi μL başına 10.000 trofozoite normalleştirin.
  15. PCR'de kullanılana kadar -80 °C'de saklayın.

4. Transforme trofozoitlerin PCR tespiti

  1. 20.000 hücre eşdeğeri DNA, 600 nM primer (Tablo 1) ve Taq polimeraz kullanın ve PCR24'ü gerçekleştirin.
    NOT: Yerel CERE ile klonlanmış CERE arasında ayrım yapan primerler, PCR koşulları gibi Tablo 1'de listelenmiştir. Şekil 3 , astarların yapılar üzerindeki konumunu göstermektedir. PCR, kullanılan primerlere ve kullanılan spesifik PCR karışımına bağlı olarak optimizasyon gerektirecektir.
  2. agaroz çözülene kadar 1x Tris bazı, asetik asit ve EDTA (TAE) tamponunda mikrodalga% 0.8 agaroz.
  3. Agarozu oda sıcaklığında ~50 °C'ye soğutun.
  4. Çözeltiyi, kuyular oluşturmak için bir tarak içeren bir jel döküm tepsisine dökün.
  5. Jeli katılaşana kadar oda sıcaklığında bekletin.
  6. Jeli elektroforez aparatına yerleştirin.
  7. Jel kaplanana kadar 1x TAE'yi elektroforez odasına boşaltın.
  8. Tarağı çıkarın.
  9. Numunelere 6x yükleme boyası (%0.25 bromphenol mavisi, %0.25 ksilen siyanol, %30 gliserol) ekleyin ve jeli yükleyin. PCR ürününün boyutunu belirlemek için bir DNA merdiveni kullanın.
  10. Elektrodu takın, güç kaynağını açın ve jeli ~ 1.5-2 saat boyunca 80 V'ta çalıştırın.
  11. Gücü kapatın ve jeli çıkarın.
  12. Jeli DNA boyası ile boyayın (ör., 10 μL 10 mg / mL etidyum bromür) 100 mL DI suda 10 dakika.
  13. Jeli DI suda 20 dakika boyunca lekesiz hale getirin.
  14. Jeli ultraviyole (UV) ışık sisteminde görselleştirin ve sonuçları belgeleyin.

Sonuçlar

pGRUB ile transfekte edilen trofozoitlerin PCR'si, transfekte edilen CERE'nin trofozoitlerin en az yedi pasajının yanı sıra kistment ve eksistment yoluyla tespit edildiğini göstermektedir (Şekil 4). PCR'de kullanılan primerler hem pGEM vektörüne hem de CERE dizisine tavlanır, böylece PCR'nin doğal CERE'yi tespit etmemesini sağlar. pGEM'in trofozoitlere transfeksiyonunu takiben PCR, pGEM'in negatif olduğunu gösterdi (Şekil 4), bu da boş plazmiti...

Tartışmalar

Burada özetlenen protokol çok basittir, ancak her yapı, yapının doğasına ve kullanılan Naegleria türüne bağlı olarak, özellikle DNA-transfeksiyon reaktif oranının bir dereceye kadar optimizasyonu gerektirecektir. Bu protokolü kullanarak ticari olarak temin edilebilen yalnızca bir transfeksiyon reaktifini test ettik, ancak diğer birkaçının da etkili olması muhtemeldir. CERE'nin tam uzunlukta bir klonunun kullanıldığı, işlevsel bir replikasyon kaynağı içerdiği ve böylece otonom olar...

Açıklamalar

Herhangi bir finansal çıkar çatışması ilan edilmedi.

Teşekkürler

Bu çalışmalar kısmen Creighton Üniversitesi (KMD) George F. Haddix Fonu'ndan alınan bir hibe ile finanse edildi. Şekil 1 biorender.com'da oluşturulur ve Şekil 3 benchling.com'da oluşturulur.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseBio Rad161-3102
Ammonium AcetateSigma AldrichA-7330
Calcium ChlorideSigma AldrichC-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75Thermo Scientific130190
Culture Plate, 6-wellCorning3506
DNAseSigma AldrichD-4527
EDTA, 0.5 MAffymetrix15694
Electropheresis Gel ApparatusAmersham Biosciences80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mLFisher Scientific05-408-138
Ethanol, 100%Decon Laboratories2716
Ethidium BromideSigma AldrichE-8751
Fetal Bovine SerumGibco26140
Folic AcidSigma AldrichF7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus LadderThermo ScientificSM1331
Glacial Acetic AcidFisher ScientificUN2789
GoTaq Green PCR Master MixPromegaM7122
Heating BlockThermo Scientific88871001
HemacytometerHausser Scientific1483
HeminSigma Aldrich51280
Iron ChlorideSigma Aldrich372870-256
LigaseNEBM2200S
Magneisum ChlorideFisher ScientificM33-500
MicrofugeThermo ScientificMySpin 12
MicroscopeNikonTMS
N. gruberiATCC30224
Nucleic AcidChem Impex Int’l#01625
PeptoneGibco211677
pGEMPromegaP2251
Potassium PhosphateSigma AldrichP0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply UnitBio Rad1645052
Sodium ChlorideMCB ReagentsSX0420
Sodium Phosphate, dibasicSigma AldrichS2554
Tabletop Centrifugeeppendorf5415R
Tris, baseSigma AldrichT1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%Gibco15250-061
ViaFect ReagentPromegaE4981
Weigh ScaleDenver InstrumentsAPX-60
Yeast ExtractGibco212750

Referanslar

  1. De Jonckheere, J. F. What do we know by now about the genus Naegleria. Exp Parasitol. 145, S2-S9 (2014).
  2. De Jonckheere, J. F. A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria. Acta Protozool. 41, 309-342 (2002).
  3. Fulton, C. Cell differentiation in Naegleria gruberi. Annu Rev Microbiol. 31, 597-629 (1977).
  4. Grace, E., Asbill, S., Virga, K. Naegleria fowleri: Pathogenesis, diagnosis, and treatment options. AAC. 59 (11), 6677-6681 (2015).
  5. Moseman, E. A. Battling brain-eating amoeba: enigmas surrounding immunity to Naegleria fowleri. PLOS Pathog. 16 (4), e1008406 (2020).
  6. Marciano-Cabral, F. Biology of Naegleria spp. Microbiol Rev. 52 (1), 114-133 (1988).
  7. Piñero, J. E., Omaña-Molina, M., Chávez-Munguía, B., Lorenzo-Morales, J. Naegleria fowleri. Trends Parasitol. 35 (10), 848-849 (2019).
  8. Zysset-Burri, D. C., et al. Genome-wide identification of pathogenicity factors of the free-living amoeba Naegleria fowleri. BMC Genomics. 15, 496-510 (2014).
  9. Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. The genome of Naegleria lovaniensis, the basis for a comparative approach to unravel pathogenicity factors of the human pathogenic amoeba N. fowleri. BMC Genom. 19, 654-665 (2018).
  10. Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. Nanopore sequencing improves the draft genome of the human pathogenic amoeba Naegleria fowleri. Sci Reports. 9, 16040-16049 (2019).
  11. Fritz-Laylin, L. K., Ginger, M. L., Walsh, C., Dawson, S. C., Fulton, C. The Naegleria genome: A free-living microbial eukaryote lends unique insights into core eukaryotic cell biology. Res Microbiol. 162, 607-618 (2011).
  12. Clark, C. G., Cross, G. A. M. rRNA genes of Naegleria gruberi are carried exclusively on a 14-kilobase-pair plasmid. Mol Cell Biol. 7 (9), 3027-3031 (1987).
  13. Clark, C. G., Cross, G. A. M. Circular ribosomal RNA genes are a general feature of schizopyrenid amoebae. J Protozool. 35 (2), 326-329 (1988).
  14. Dao, F. Y., et al. Identify origin of replication in Saccharomyces cerevisiae using two-step feature selection technique. Bioinformatics. 35 (12), 2075-2083 (2019).
  15. Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. Complete genome sequence of the circular extrachromosomal element of Naegleria gruberi strain EGB ribosomal DNA. Genome Announc. 6 (6), e00020-e00021 (2018).
  16. Mullican, J. C., Drescher, K. M., Chapman, N. M., Tracy, S. Complete genome sequence of the Naegleria fowleri (strain LEE) closed circular extrachromosomal ribosomal DNA element. Microbiol Resource Announce. 9 (49), e01055 (2020).
  17. Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Tracy, S., Drescher, K. M. The extrachromosomal elements of the Naegleria amoebae: How little we know. Plasmid. 115, 102567 (2021).
  18. Nguyen, B. T., et al. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria australiensis De Jonckheere (strain PP 397). Microbiol Resource Announce. 12, e0032123 (2023).
  19. Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Stessman, H. A. F., Tracy, S., Drescher, K. M. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element of Naegleria jadini Willaert and Ray (Strain ITMAP400). Microbiol Resource Announce. 12 (4), 0006123 (2023).
  20. Nguyen, B. T., et al. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria pringsheimi De Jonckheere (strain Singh). Microbiol Resource Announce. 13 (4), (2024).
  21. Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. Mapping the single origin of replication in the Naegleria gruberi extrachromosomal DNA element. Protist. 170, 141-152 (2019).
  22. Sohn, H. J., et al. Efficient liquid media for encystation of pathogenic free-living amoebae. Korean J Parasitol. 55 (3), 233-238 (2017).
  23. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2001).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  25. Jeong, S. R., et al. Expression of the nfa1 gene cloned from pathogenic Naegleria fowleri in non-pathogenic N. gruberi enhances cytotoxicity against CHO target cells in vitro. Infect Immun. 73 (7), 4098-4105 (2005).
  26. Clark, C. G., Cross, G. A. M., De Jonckheere, J. F. Evaluation of evolutionary divergence in the genus Naegleria by analysis of ribosomal DNA plasmid restriction patterns. Mol Biochem Parasitol. 34 (3), 281-296 (1989).
  27. De Jonckheere, J. F. Sequence variation in the ribosomal internal transcribed spacers, including the 5.8S rDNA, of Naegleria spp. Protist. 149 (3), 221-228 (1998).
  28. Rawal, P., et al. Genome-wide prediction of G4 DNA as regulatory motifs: Role in Escherichia coli global regulation. Genome Res. 16 (5), 644-655 (2006).
  29. Yadav, V. K., Abraham, J. K., Mani, P., Kulshrestha, R., Chowdhury, S. QuadBase: Genome-wide database of G4 DNA - occurrence and conservation in human, chimpanzee, mouse and rat promoters and 146 microbes. Nucleic Acids Res. 36, D381-D385 (2007).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Naegleria gruberiRDNAekstrakromozomal ribozomal DNACEREtransfeksiyonPGRUBPGEM7zftrofozoitlerkistmenteksistreplikasyonNRS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır