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要約

このプロトコルは、 Naegleria gruberi trophozoitesをトランスフェクションする方法を、 in vitroで、またエンシストおよびエクスチストメントを通じて、トランスフェクションするコンストラクトを説明しています。

要約

Naegleria trophozoitesのすべてのリボソーム遺伝子は、閉じた環状染色体外リボソームDNA(rDNA)を含む要素(CERE)に維持されています。CEREについてはほとんど知られていませんが、Naegleriaの3種の完全なゲノム配列解析により、核ゲノムにはrDNAシストロンが存在しないことが明確に示されています。さらに、N. gruberi CEREでは、単一のDNA複製起点がマッピングされており、CEREが核ゲノムとは無関係に複製するという仮説を支持しています。このCEREの特性は、遺伝子操作されたCEREを使用してNaegleria trophozoitesに外来タンパク質を導入することが可能であることを示唆しています。NaegleriaにおけるCEREのベクターとしての利用を検討する最初のステップとして、我々は、N. gruberiの分子クローンをpGEM7zf+(pGRUB)にクローニングしたN. gruberiの分子クローンと共にN. gruberiにトランスフェクションするプロトコルを開発しました。トランスフェクション後、pGRUBはN. gruberi trophozoitesにおいて、少なくとも7回の継代、ならびに包嚢および排泄を通じて容易に検出されました。対照として、栄養型株にバックボーンベクターpGEM7zf+をトランスフェクションし、N. gruberi配列(pGEM)を使わずにトランスフェクトしました。pGEMは、N. gruberiへのトランスフェクション後の最初の通過後には検出されず、真核生物では複製できないことを示しています。これらの研究では、Naegleria trophozoitesのトランスフェクションプロトコルについて説明し、pGRUBの細菌プラスミド配列がトランスフェクションされたCEREクローンのトランスフェクションと複製の成功を阻害しないことを示しています。さらに、このトランスフェクションプロトコルは、栄養型でのCEREの複製を促進する最小配列を理解するだけでなく、非リボソーム配列(NRS)の調節領域を同定する上でも重要です。

概要

Naegleria属には45種以上が含まれていますが、種のすべてのメンバーが特定されている可能性は低いです1。ネグレリアは、栄養型(アメーバ)、鞭毛虫、または資源が厳しく制限されている場合は嚢胞1,2,3,4として、さまざまな形で存在することができます。Naegleria属は、その特に危険な種であるNaegleria fowleri(脳を食べるアメーバ)(1,2,3,4,5,6,7でレビュー)として知られることで認識されており、これはほぼ普遍的に致命的な原発性アメーバ性髄膜脳炎の原因です。

Naegleriaは、核小体にあるCERE上にrDNAをコードします。Naegleriaの3種のゲノムの完全なシーケンシングにより、核ゲノム8,9,10,11にrDNAが存在しないことが確認された。限られた完全長のCERE配列に基づくと、CEREの長さは約10 kbpから18 kbpの範囲です。Naegleriaの各種のCEREは、細胞12,13,14あたり約4,000のCEREのそれぞれに単一のrDNAシストロン(5.8、18、および28SリボソームDNAを含む)を持っています。rDNA以外に、各CEREは大きな非rDNA配列(NRS)を持っています。CEREのサイズは種によって異なります。この違いは主にNRSの長さが異なることによるもので、rDNA配列は1,15,16,17,18,19,20属にわたって高度に保存されています。N. gruberi CERE NRS21内のDNA複製の単一起源のマッピングは、Naegleria CEREが核ゲノムとは無関係に複製するという仮説を強力に支持する。

N. gruberiは、Naegleriaの生物学の研究によく使用される非病原性アメーバです。私たちは、Naegleria amoebaeが栄養型内でCEREを許容し、独立して複製するという仮説を検証するために、N. gruberiの栄養型を同種のCEREクローンで形質転換する方法論を開発しました。これは、N. gruberi CEREの完全長クローンを持つN. gruberiを栄養型に形質転換し、ドナーCEREクローンの運命をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって追跡することによって達成されました。このプロトコルの一般的な概要を図 1 に示します。本明細書に提示されたデータは、ドナークローンが組織培養中の少なくとも7つの継代を通じて検出され得ること、ならびに包嚢および排泄を通じて維持され得ることを実証している。これらの研究は、CEREがどのように複製するかを解剖する手段の基礎を形成するとともに、Naegleriaをトランスフェクトするためのベクターとしての使用を探求します。

プロトコル

この研究で使用された種、試薬、および機器の詳細は、 材料表に記載されています。17,004塩基対のpGRUBコンストラクトの配列は、 補足ファイル1に記載されています。

1.栄養型生物の培養

  1. 冷凍 したN. gruberi 栄養型菌を37°Cで3分間解凍します。
  2. 10%ウシ胎児血清(PYNFH)培地と2%緩衝液(リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウム)を添加した修飾ペプトン/酵母抽出物/核酸/葉酸/ヘミン中のT25フラスコに栄養型を接種します。
  3. 栄養型を25°Cで~80%がコンフルエントになるまで培養し、そこでアメーバ状の形態を示します(図2A)。
    注:栄養型の培養物を凍結状態から最初に復活させるとき、T25がコンフルエントになるまでに最大5〜7日かかる場合があります。メディアを3〜4日ごとにデカントし、新しいメディアと交換します。
  4. コンフルエントフラスコを氷の上に5〜10分間置き、付着した栄養型をプラスチックから放出します。フラスコを静かに回転させて、残っている付着細胞を取り除きます。現在、栄養型は「切り上げられた」形態をしています(図2B)。
  5. 培養物を1:2から1:4に分割して、新しい組織培養フラスコにします。
  6. PYNFHを取り外し、滅菌被覆培地(120 mM塩化ナトリウム、0.03 mM塩化マグネシウム、1 mMリン酸二ナトリウム、1 mMリン酸二水素カリウム、0.03 mM塩化カルシウム、0.02 mM塩化鉄、pH 6.8)22 と交換して、 N. gruberiを被覆します。
    注:栄養型の大部分は72時間で包囲されます(図2C)。排泄は72時間以内に完了する必要があります。.
  7. フラスコから嚢胞を取り出し、600 x g で20°Cで10分間遠心分離し、10%ウシ胎児血清を含むPYNFH培地で嚢胞を再懸濁して細胞を脱嚢胞します。栄養型が出現し始めるまで、25°Cで24時間インキュベートします。

2. 栄養型トランスフェクション

  1. 栄養型を6ウェル平底組織培養プレート(1 x 106 栄養型/mL 1 mL 1 mL)にプレートし、25°Cで培養します。
  2. 細胞が70%〜80%のコンフルエント(6ウェルクラスターで~10.4 x 104 細胞/cm2 )に達したときにトランスフェクションします。トランスフェクション試薬を室温まで温めてからご使用ください。
  3. プラスミド-トランスフェクション試薬混合物を次のように調製します:75 ngのプラスミドDNAと0.225 μLのトランスフェクション試薬を、FBSを含まない200 μLのPYNFH培地に含みます。トランスフェクションを二重に行うのに十分なプラスミド-トランスフェクション試薬混合物を準備します。
    注:この研究では、 N. gruberi CERE(pGRUB)の完全長クローンを含む細菌プラスミドを使用しました。ネガティブコントロールとしてエンプティプラスミド(pGEM)を使用しました(図3)。
  4. プラスミドトランスフェクション試薬混合物を室温で10分間インキュベートします。
  5. トランスフェクションの直前に、栄養型単層から~800 μLの培地を取り除きます。
  6. プラスミド-トランスフェクション試薬混合物を栄養型薬の上に置きます。
  7. 15分ごとにプレートを静かに渦巻かせ、メディアがプレートの端に凝集しないようにします。
  8. 単層を25°Cで1時間インキュベートした後、2 mLの増殖培地で1回洗浄します。
  9. 単分子膜を10 mLの10x DNaseバッファーに10 U DNaseで15分間、37°Cで処理して残留プラスミドDNAを除去し、増殖培地で1回洗浄し、2 mLの新鮮な培地を加えて25°Cに置きます。 プレートを24〜36時間インキュベートします。
  10. プレートを氷上に10分間置き、細胞を放出します。
  11. 1つの井戸(1:2)を2つの新しい井戸に分割します。
  12. 実験目的で残りの井戸から栄養型を収集します。
    注: すべてのカルチャは重複して実行されます。各条件について、1ウェルが通過に使用され、1ウェルがCERE分離に使用されます。

3. NaegleriaからのCEREの分離

  1. CERE単離に使用した各ウェル中の栄養型石の数を、トリパンブルー排除染色および血球計算盤23により計算する。
  2. 栄養型を2.0mLのチューブに入れます。
  3. 栄養型を100 mM塩化ナトリウム(pH 7.5)で1回、遠心分離(600 x g、10分、4°C)で洗浄します。
    注:塩化ナトリウムは、栄養型がチューブの側面に付着するのを防ぎます。
  4. 上清を取り除き、細胞ペレットを100 μLの100 mM EDTA(pH 7.5)に再懸濁します。
  5. チューブをヒートブロックに98°Cで15分間入れて、細胞を溶解し、栄養型生物の酵素を不活性化します。
    注:この手順により、 Naegleria trophozoitesに豊富に存在するDNaseが不活性化されます。DNaseは、ステップ4でネイティブCEREと分子クローンを検出する能力を妨げる可能性があります。ステップ3.4で~3 x 106 細胞を超える細胞を使用すると、DNA収量は減少します。
  6. チューブを最高速度(16,000 x g)で4°Cで10分間遠心分離し、破片をペレット化します。
  7. 上清を新しいチューブに移します。
  8. エタノールは、0.5容量の7.5 M酢酸アンモニウム(pH 7.5)、3容量の無水エタノール、および1 μLの10 mg/mLグリコーゲンを担体として上清を沈殿させます。
  9. チューブを数回反転させ、チューブを-80°Cに少なくとも1時間または一晩置きます。
  10. サンプルを室温まで温めます。
  11. チューブを室温で10分間、16,000 x gで遠心分離します。
  12. 上清を取り除き、ペレットを70%エタノールで16,000 x g (室温)で5分間遠心分離して洗浄します。
  13. エタノールを取り除き、ペレットを5分間風乾します。
  14. 乾燥させたペレットを滅菌脱イオン(DI)水に再懸濁します。容量を10,000 trophozoites/μLに正規化します。
  15. PCRで使用するまで-80°Cで保存してください。

4. 形質転換栄養型のPCR検出

  1. 20,000細胞相当のDNA、600 nMプライマー(表1)、およびTaqポリメラーゼを使用し、PCR24を実行します。
    注:ネイティブCEREとクローニングCEREを区別するプライマーを、PCR条件と同様に 表1に示します。 図3 は、コンストラクト上のプライマーの位置を示しています。PCRは、使用するプライマーと使用する特定のPCRミックスに応じて最適化する必要があります。
  2. 1x Tris塩基、酢酸、およびEDTA(TAE)バッファー中の0.8%アガロースを、アガロースが溶解するまでマイクロ波で加熱します。
  3. アガロースを室温で~50°Cに冷却します。
  4. 溶液をコームが入ったゲルキャスティングトレイに注ぎ、ウェルを形成します。
  5. ゲルが固まるまで室温で放置します。
  6. ゲルを電気泳動装置に入れます。
  7. ゲルが覆われるまで、1x TAEを電気泳動チャンバーにデカントします。
  8. コームを取り外します。
  9. 6倍ローディング色素(0.25%ブロムフェノールブルー、0.25%キシレンシアノール、30%グリセロール)をサンプルに加え、ゲルをロードします。DNAラダーを使用して、PCR産物のサイズを決定します。
  10. 電極を取り付け、電源を入れ、ゲルを80Vで~1.5〜2時間泳動させます。
  11. 電源を切り、ジェルを取り外してください。
  12. DNA色素(例:10 mg/mL エチジウムブロマイド10 μL)でゲルを100 mLの脱イオン水に10分間染色します。
  13. ゲルを脱イオン水で20分間染色します。
  14. 紫外線(UV)光システム上でゲルを可視化し、結果を文書化します。

結果

pGRUBでトランスフェクションされた栄養型魚のPCRは、トランスフェクションされたCEREが栄養型の少なくとも7つの通過、および包嚢および排泄を通じて検出されることを示しています(図4)。PCRアニーリングで使用されるプライマーは、pGEMベクターとCERE配列の両方に対して使用され、PCRがネイティブCEREを検出しないようにします。pGEMを栄養型にトランスフェクションし?...

ディスカッション

ここで概説するプロトコルは非常に単純ですが、すべてのコンストラクトは、コンストラクトの性質および使用される Naegleria の種に応じて、特にDNAトランスフェクション試薬比について、ある程度の最適化を必要とする可能性があります。このプロトコルを使用して試験した市販のトランスフェクション試薬は1つだけですが、他のいくつかの試薬が効果的である可能性があります。C...

開示事項

金銭的な利益相反は宣言されていません。

謝辞

これらの研究は、クレイトン大学(KMD)のGeorge F. Haddix Fundからの助成金によって部分的に資金提供されました。 図 1 は biorender.com で生成され、 図 3 は benchling.com で生成されます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseBio Rad161-3102
Ammonium AcetateSigma AldrichA-7330
Calcium ChlorideSigma AldrichC-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75Thermo Scientific130190
Culture Plate, 6-wellCorning3506
DNAseSigma AldrichD-4527
EDTA, 0.5 MAffymetrix15694
Electropheresis Gel ApparatusAmersham Biosciences80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mLFisher Scientific05-408-138
Ethanol, 100%Decon Laboratories2716
Ethidium BromideSigma AldrichE-8751
Fetal Bovine SerumGibco26140
Folic AcidSigma AldrichF7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus LadderThermo ScientificSM1331
Glacial Acetic AcidFisher ScientificUN2789
GoTaq Green PCR Master MixPromegaM7122
Heating BlockThermo Scientific88871001
HemacytometerHausser Scientific1483
HeminSigma Aldrich51280
Iron ChlorideSigma Aldrich372870-256
LigaseNEBM2200S
Magneisum ChlorideFisher ScientificM33-500
MicrofugeThermo ScientificMySpin 12
MicroscopeNikonTMS
N. gruberiATCC30224
Nucleic AcidChem Impex Int’l#01625
PeptoneGibco211677
pGEMPromegaP2251
Potassium PhosphateSigma AldrichP0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply UnitBio Rad1645052
Sodium ChlorideMCB ReagentsSX0420
Sodium Phosphate, dibasicSigma AldrichS2554
Tabletop Centrifugeeppendorf5415R
Tris, baseSigma AldrichT1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%Gibco15250-061
ViaFect ReagentPromegaE4981
Weigh ScaleDenver InstrumentsAPX-60
Yeast ExtractGibco212750

参考文献

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