Transfection d’un clone moléculaire de l’ADNr de Naegleria gruberi en trophozoïtes de N. gruberi

Résumé

Ce protocole décrit une méthodologie pour transfecter les trophozoïtes de Naegleria gruberi avec une construction qui est maintenue tout au long du passage des trophozoïtes in vitro, ainsi que par l’enkystement et l’exkystement.

Résumé

Tous les gènes ribosomiques de Naegleria trophozoites sont maintenus dans un élément contenant de l’ADN ribosomique extrachromosomique (ADNr) (CERE) circulaire et fermé. Bien que l’on sache peu de choses sur le CERE, une analyse complète de la séquence génomique de trois espèces de Naegleria démontre clairement qu’il n’y a pas de cistrons d’ADNr dans le génome nucléaire. De plus, une seule origine de réplication de l’ADN a été cartographiée chez N. gruberi CERE, soutenant l’hypothèse selon laquelle CERE se réplique indépendamment du génome nucléaire. Cette caractéristique de l’EREC suggère qu’il pourrait être possible d’utiliser l’ERE modifié pour introduire des protéines étrangères dans Naegleria trophozoites. Comme première étape dans l’exploration de l’utilisation d’un CERE comme vecteur chez Naegleria, nous avons développé un protocole pour transfecter N. gruberi avec un clone moléculaire du CERE de N. gruberi cloné en pGEM7zf+ (pGRUB). Après la transfection, pGRUB a été facilement détecté dans les trophozoïtes de N. gruberi pendant au moins sept passages, ainsi que par enkystement et exkystique. Comme contrôle, les trophozoïtes ont été transfectés avec le vecteur squelette, pGEM7zf+, sans les séquences de N. gruberi (pGEM). Le pGEM n’a pas été détecté après le premier passage suivant la transfection dans N. gruberi, ce qui indique son incapacité à se répliquer dans un organisme eucaryote. Ces études décrivent un protocole de transfection pour les trophozoïtes de Naegleria et démontrent que la séquence plasmidique bactérienne dans pGRUB n’inhibe pas la transfection et la réplication réussies du clone CERE transfecté. De plus, ce protocole de transfection sera essentiel pour comprendre la séquence minimale du CERE qui pilote sa réplication dans les trophozoïtes, ainsi que pour identifier les régions régulatrices dans la séquence non ribosomique (NRS).

Introduction

Le genre Naegleria contient plus de 45 espèces, bien qu’il soit peu probable que tous les membres de l’espèce aient été identifiés¹. Naegleria peut exister sous différentes formes : sous forme de trophozoïtes (amibes), de flagellés ou, lorsque les ressources sont sévèrement limitées, sous forme de kystes 1,2,3,4. Le genre Naegleria est reconnu pour sa seule espèce particulièrement dangereuse, Naegleria fowleri, connue sous le nom d'«amibe mangeuse de cerveau » (examinée dans ^1,....

Protocole

Les détails des espèces, des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont répertoriés dans la table des matériaux. La séquence de la construction pGRUB de 17 004 paires de bases est fournie dans le fichier supplémentaire 1.

1. Cultiver des trophozoïtes

1. Décongeler les trophozoïtes de N. gruberi congelés à 37 °C pendant 3 min.
2. Inoculer des trophozoïtes dans des flacons T25 dans de la peptone/extrait de levure/acide nucléique/acide folique/hémine modifiés avec 10 % de sérum de veau fœtal (PYNFH) et un tampon à 2 % (phosphate disodique, dihydrogénophos....

Discussion

Le protocole décrit ici est très simple, bien que chaque construction nécessitera probablement un certain degré d’optimisation, en particulier du rapport ADN-réactif de transfection, en fonction de la nature de la construction et de l’espèce de Naegleria utilisée. Nous n’avons testé qu’un seul réactif de transfection disponible dans le commerce en utilisant ce protocole, mais il est probable que plusieurs autres puissent être efficaces. Étant donné qu’un clone complet de la CERE est utilis?.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bio Rad	161-3102
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	A-7330
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75	Thermo Scientific	130190
Culture Plate, 6-well	Corning	3506
DNAse	Sigma Aldrich	D-4527
EDTA, 0.5 M	Affymetrix	15694
Electropheresis Gel Apparatus	Amersham Biosciences	80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Ethanol, 100%	Decon Laboratories	2716
Ethidium Bromide	Sigma Aldrich	E-8751
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140
Folic Acid	Sigma Aldrich	F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder	Thermo Scientific	SM1331
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Heating Block	Thermo Scientific	88871001
Hemacytometer	Hausser Scientific	1483
Hemin	Sigma Aldrich	51280
Iron Chloride	Sigma Aldrich	372870-256
Ligase	NEB	M2200S
Magneisum Chloride	Fisher Scientific	M33-500
Microfuge	Thermo Scientific	MySpin 12
Microscope	Nikon	TMS
N. gruberi	ATCC	30224
Nucleic Acid	Chem Impex Int’l	#01625
Peptone	Gibco	211677
pGEM	Promega	P2251
Potassium Phosphate	Sigma Aldrich	P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit	Bio Rad	1645052
Sodium Chloride	MCB Reagents	SX0420
Sodium Phosphate, dibasic	Sigma Aldrich	S2554
Tabletop Centrifuge	eppendorf	5415R
Tris, base	Sigma Aldrich	T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%	Gibco	15250-061
ViaFect Reagent	Promega	E4981
Weigh Scale	Denver Instruments	APX-60
Yeast Extract	Gibco	212750