الثقافة المشتركة في الأنظمة المختبرية لإعادة إنتاج دورة المناعة السرطانية

Summary

هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول بسيط وسريع وموثوق لقياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات وبروتوكول بمساعدة الورم على رقاقة لمراقبة وتوصيف الخطوات التي تشكل دورة مناعة السرطان. في الواقع ، يوفر الفهم الشامل للتفاعلات بين السرطان والخلايا المناعية رؤى مهمة للتغلب على الأورام وتوجيه الرعاية السريرية.

Abstract

تعتمد أبحاث السرطان الأساسية وتطوير علاجات فعالة للهجوم المضاد على الدراسات التجريبية التي توضح بالتفصيل التفاعلات بين السرطان والخلايا المناعية ، ما يسمى بدورة مناعة السرطان. تتيح أنظمة الاستزراع المشترك في المختبر جنبا إلى جنب مع قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات (mFC) وأجهزة الموائع الدقيقة للورم على الرقاقة (ToCs) مراقبة وتوصيف بسيط وسريع وموثوق لكل خطوة من خطوات دورة المناعة السرطانية وتؤدي إلى تحديد الآليات المسؤولة عن قلب التوازن بين المراقبة المناعية للسرطان والتهرب المناعي. يوفر الفهم الشامل للتفاعلات الديناميكية بين السرطان والخلايا المناعية رؤى مهمة للتغلب على الأورام وسيسرع وتيرة التخصيص العلاجي والتحسين لدى المرضى. على وجه التحديد ، نقوم هنا بتفصيل بروتوكول مباشر بمساعدة mFC و ToC لكشف التعقيدات الديناميكية لكل خطوة من خطوات دورة المناعة السرطانية في خطوط خلايا سرطان الفئران والخلايا المناعية المشتقة من الفئران والتركيز على المراقبة المناعية. بالنظر إلى الميزات المتعلقة بالوقت والتكلفة لهذا البروتوكول ، فمن المؤكد أنه ممكن على نطاق واسع. علاوة على ذلك ، مع اختلافات طفيفة ، يمكن تكييف هذا البروتوكول مع خطوط الخلايا السرطانية البشرية والخلايا المناعية المشتقة من الدم المحيطي البشري ودمجها مع التثبيط الجيني و / أو الدوائي لمسارات محددة من أجل تحديد المؤشرات الحيوية للاستجابة المناعية.

Introduction

على مدى العقود القليلة الماضية ، كان العلاج المناعي في طليعة الخيارات المتطورة لعلاج السرطان. لقد وفر تسخير الجهاز المناعي لأغراض مضادة للأورام دليلا قويا على المفهوم لصالح المريض عبر الأورام الخبيثة الدموية والصلبة المتنوعة مع تكهنات سيئة تاريخيا. نظرا لأن العلاج المناعي يوفر فرصة للسرطانات التي يصعب علاجها ، فإنه يشهد وتيرة تقدم سريعة بشكل مذهل. يمكن أن يعزى هذا التقدم ، جزئيا على الأقل ، إلى الفهم الدقيق للتفاعل بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية. يشبه هذا التفاعل "محرك" التغذية الأمامية الذي يشعله الجهاز المناعي لتدمير الخلايا السرطانية ، ما يسمى بدورة المناعة السرطانية. تتقدم هذه الاستجابة المناعية المضادة للسرطان عبر ثلاثة مستويات رئيسية: التعرف والمعالجة و....

Protocol

تتوافق جميع خطوات البروتوكول التي تتطلب استخدام مع توجيه الاتحاد الأوروبي 63/2010 ويتم تضمينها في بروتوكول تجريبي معتمد من قبل لجنة التجارب المؤسسية على ووزارة الصحة الإيطالية (رقم الموافقة 858/2015 / PR).

1. تحضير الخلايا السرطانية

1. روتين زراعة الخلايا السرطانية (اليوم -7 ؛ المدة: 2 ساعة)
   1. تنمو خلايا الساركوما الليفية MCA205 في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 وسط نمو مكمل ب 10٪ (v / v) مصل بقري جنيني (FBS) ، 2 mM L-glutamine ، 100 وحدة دولية / مل بنسلين G ملح الصوديوم ، 100 ميكروغرام / مل كبريتات الستربتومايسين ، و 50 ميكروغرام / مل hygromycin (وسط نمو كامل) ، في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة في ظل ظروف ا....

النتائج

تم تقييم قدرة CD11c ⁺ DCs ، وهي مجموعة فرعية من البلعمة المعروفة على نطاق واسع والمتخصصة في العرض المتقاطع^21,22 والبوابات كما هو موضح في الشكل 2A ، على ابتلاع الأجسام المبرمج من الخلايا السرطانية MCA205 المشععة بالأشعة فوق البنفسجية والتي تم تصن.......

Discussion

تعد مراقبة الاستجابة المناعية المضادة للسرطان ذات أهمية قصوى لتوضيح وفهم التفاعلات الجزيئية والخلوية المعقدة التي تعمل في TME ودعم معركة مستمرة من أجل التفوق²³. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول بسيط بمساعدة mFC و ToC لمراقبة وتوصيف الخطوات التي تشكل دورة المناعة السرطانية. مع اختلافات .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtubes	Eppendorf	30120086
100 kV e-beam litography	Vistec
100 mm Petri dishes	Greiner Bio One	664160
12-well plates	Euroclone	ET3012
15 and 50 mL tubes	Corning	352096; 352070
40 μm cell strainer	Corning	CLS431750
5 mL polystyrene tubes	Greiner Bio-One	120180
70 μm cell strainer	Corning	CLS431751
75 cm2 cell culture treated flask	Euroclone	ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody	Miltenyi Biotec	130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) Antibody	BioLegend	100206
Aptes	Sigma Aldrich	440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug	BD Biosciences	555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)	BD Biosciences	555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD Biosciences	554724
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological, Salem	A1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)	eBioscience	12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)	eBioscience	17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)	eBioscience	25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)	eBioscience	11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	MCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)	eBioscience	48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)	eBioscience	11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)	eBioscience	17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)	eBioscience	53-0951-82
Cell counting slides	Kova International	87144E
Chromium quartz masks	MB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10635
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman Coulter
Dead Cell Removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)	EuroClone	ECB4053L
EDTA	Invitrogen	AM9260G
Fetal bovine serum (FBS)	EuroClone	ECS0180L
Flowjo v10.0.7	Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)	eBioscience	12-8898-82
H2O2	Sigma Aldrich
H2SO4	Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)	Thermo Scientific
Ice machine	Brema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)	eBioscience	11-7311-82
Illustrator CC 2015	Adobe Systems Inc.
ImageJ	National Institute of Health
Incucyte 2022A Software	Sartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells	Sartorius	4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System	Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope	Bulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Angelantoni
L-glutamine 200 mM	EuroClone	ECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L10119
MACS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201; 130-042-401
MACS separators	Miltenyi Biotec	130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell line	Sigma-Aldrich	SCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002552
Microsoft Excel	Microsoft, Redmond
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2	Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT	Nikon Instruments Inc.
Optical litography	EVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate	EuroClone	ECB3001D/1
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201
Pipettes	Eppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits	Sigma-Aldrich	PKH67GL-1KT	fluorescent cell linker  kit
plastic coverslip	IBIDI	10812
Propidium Iodide	Thermo Scientific	P1304MP
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	EuroClone	ECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge Series	Thermo Scientific	75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 series	MicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punches	Kai Medical, Tedpella
Sylgard 184	Dowsil, Dow Corning	101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)	eBioscience	12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS	Sigma Aldrich	92360
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Scientific	15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol Red	EuroClone	ECM0920
Vacuum dessicator