Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول بسيط وسريع وموثوق لقياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات وبروتوكول بمساعدة الورم على رقاقة لمراقبة وتوصيف الخطوات التي تشكل دورة مناعة السرطان. في الواقع ، يوفر الفهم الشامل للتفاعلات بين السرطان والخلايا المناعية رؤى مهمة للتغلب على الأورام وتوجيه الرعاية السريرية.

Abstract

تعتمد أبحاث السرطان الأساسية وتطوير علاجات فعالة للهجوم المضاد على الدراسات التجريبية التي توضح بالتفصيل التفاعلات بين السرطان والخلايا المناعية ، ما يسمى بدورة مناعة السرطان. تتيح أنظمة الاستزراع المشترك في المختبر جنبا إلى جنب مع قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات (mFC) وأجهزة الموائع الدقيقة للورم على الرقاقة (ToCs) مراقبة وتوصيف بسيط وسريع وموثوق لكل خطوة من خطوات دورة المناعة السرطانية وتؤدي إلى تحديد الآليات المسؤولة عن قلب التوازن بين المراقبة المناعية للسرطان والتهرب المناعي. يوفر الفهم الشامل للتفاعلات الديناميكية بين السرطان والخلايا المناعية رؤى مهمة للتغلب على الأورام وسيسرع وتيرة التخصيص العلاجي والتحسين لدى المرضى. على وجه التحديد ، نقوم هنا بتفصيل بروتوكول مباشر بمساعدة mFC و ToC لكشف التعقيدات الديناميكية لكل خطوة من خطوات دورة المناعة السرطانية في خطوط خلايا سرطان الفئران والخلايا المناعية المشتقة من الفئران والتركيز على المراقبة المناعية. بالنظر إلى الميزات المتعلقة بالوقت والتكلفة لهذا البروتوكول ، فمن المؤكد أنه ممكن على نطاق واسع. علاوة على ذلك ، مع اختلافات طفيفة ، يمكن تكييف هذا البروتوكول مع خطوط الخلايا السرطانية البشرية والخلايا المناعية المشتقة من الدم المحيطي البشري ودمجها مع التثبيط الجيني و / أو الدوائي لمسارات محددة من أجل تحديد المؤشرات الحيوية للاستجابة المناعية.

Introduction

على مدى العقود القليلة الماضية ، كان العلاج المناعي في طليعة الخيارات المتطورة لعلاج السرطان. لقد وفر تسخير الجهاز المناعي لأغراض مضادة للأورام دليلا قويا على المفهوم لصالح المريض عبر الأورام الخبيثة الدموية والصلبة المتنوعة مع تكهنات سيئة تاريخيا. نظرا لأن العلاج المناعي يوفر فرصة للسرطانات التي يصعب علاجها ، فإنه يشهد وتيرة تقدم سريعة بشكل مذهل. يمكن أن يعزى هذا التقدم ، جزئيا على الأقل ، إلى الفهم الدقيق للتفاعل بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية. يشبه هذا التفاعل "محرك" التغذية الأمامية الذي يشعله الجهاز المناعي لتدمير الخلايا السرطانية ، ما يسمى بدورة المناعة السرطانية. تتقدم هذه الاستجابة المناعية المضادة للسرطان عبر ثلاثة مستويات رئيسية: التعرف والمعالجة والتفاعل. أولا ، في مرحلة التعرف ، يتم إطلاق مستضدات الورم (Ags) الناتجة أثناء تكوين الورم عن طريق الخلايا السرطانية المحتضرة في البيئة المكروية للورم (TME ، الخطوة 1) وتغمرها الخلايا المتغصنة المتسللة إلى الورم (DCs ، الخطوة 2). بعد ذلك ، في مرحلة المعالجة ، تقدم DCs حوامل Ags للورم الذي تم التقاطه من خلال جزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) ، وتعبر على سطحها عن مستويات أعلى من الجزيئات المكلفة (الخطوة 3) ، وتنتقل إلى الغدد الليمفاوية التي تستنزف الورم (dLNs) لتقديم حمولتها إلى خلايا CD8 T الساذجة (CD8N ، الخطوة 4). تتلاقى كل هذه الخطوات في العملية النهائية للتفاعل التي يتم خلالها تنشيط خلايا CD8 T المتصالبة الخاصة بالورم (CD8C-P) ، وتنضج إلى خلايا CD8 T (CD8E) المستجيبة ، وتخضع للتوسع النسيلي (الخطوة 5). ثم تغادر خلايا CD8E dLNs والمنزل عبر الدم إلى TME (الخطوة 6) حيث تتعرف على الخلايا السرطانية وترتبط بها على وجه التحديد من خلال التفاعل بين مستقبلات الخلايا التائية (TCR) والورم المشابه لها Ags ، وتطلق جزيئات سامة للخلايا [أي الإنترفيرون (IFN) -γ والبيرفورين والجرانزيمات (Grzs)] وتقتل الخلايا السرطانية (الخطوة 7) 1 ، 2. يؤدي قتل الخلايا السرطانية إلى إطلاق المزيد من Ags للورم لتغذية دورة المناعة السرطانية. في الواقع ، من خلال كل هذه الخطوات ، يدمر الجهاز المناعي ويرفض الخلايا السرطانية في كثير من الأحيان أكثر مما يفترض. ومع ذلك ، في مرضى السرطان ، لا تعمل واحدة على الأقل من هذه الخطوات بشكل صحيح. لقد أظهرنا نحن وآخرون أن الخلايا السرطانية تسعى إلى إيقاف الاستجابة المناعية إما عن طريق التطور إلى متغيرات أكثر عدوانية وامتيازا مناعية3،4،5 أو إعاقة فعالية الخلايا التائية6،7.

تعتمد أبحاث السرطان وتطوير أدوية السرطان على نماذج تجريبية تسمح بدراسة العلاقة بين السرطان والخلايا المناعية ، ما يسمى بعلم المناعة السرطاني. فيما يلي وصف سريع وموثوق وقابل للتكرار ومنخفض التكلفة في النماذج المختبرية التي تعيد إنتاج كل خطوة من خطوات دورة علم المناعة السرطاني بشكل شامل وتقدم رؤية سريعة وواضحة لمجموعات الميزات المظهرية والوظيفية للمراقبة المناعية وفي النهاية التحرير المناعي.

يعد قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات (mFC) أحد أنجح الأدوات التحليلية أحادية الخلية في أبحاث السرطان الأساسية والتشخيص والبحوث الانتقالية في التجارب السريرية للسرطان. نظرا لأنه يسمح بالتقاط المزيد من الميزات في كل خلية في وقت واحد ، فقد اكتسب mFC مكانته كمنصة تحليل قياسية ذهبية في علم المناعة السرطاني. إنه يجمع بين الحساسية العالية والنوعية مع إمكانية قياس أنماط تعبير البروتين المتعددة والخصائص الوظيفية بسرعة وبشكل متكرر على مستوى خلية واحدة من معلقات الخلايا غير المتجانسة وحتى غير المتجانسة ، مثل تلك الموجودة في TME8،9،10. نظرا لأن أنماط التعبير المظهري والوظيفي حساسة للوقت ، فإن الاهتمام الدقيق بتصميم التجربة ، واختيار اللوحات المناسبة ، والضوابط ، والأجسام المضادة المعايرة ، ومعالجة العينات المناسبة واستخدام الأجهزة أمر بالغ الأهمية لموثوقية النتائج وقابليتها للمقارنة وقابلية استنساخ النتائج وتفسير نتائج التجربة11 بثقة.

تقوم أجهزة الموائع الدقيقة للورم على الرقاقة (ToCs) بنمذجة TME من خلال السماح بالمحاكاة الحيوية المجهرية للسرطان وديناميكيات الخلايا المناعية والتفاعلات12،13،14،15. على وجه التحديد ، ToCs هي أجهزة زراعة خلايا الموائع الدقيقة متعددة القنوات قادرة على استضافة أنواع متنوعة من الخلايا منظمة إما في إعدادات ثقافة ثنائية الأبعاد (2D) أو ثلاثية الأبعاد (3D) وقادرة على النمذجة بدقة عالية والتحكم بدقة عالية ، والوحدات الهيكلية والوظيفية الرئيسية مثل التفاعلات الخلوية غير المتجانسة وتدفقات التدرجات الكيميائية التي تحدث من الناحية الفسيولوجية في TME12 ، 13,14,15. على وجه الخصوص ، يمكن مراقبة الجذب الكيميائي المناعي والمسارات وكذلك تفاعل الخلايا المناعية مع الخلايا السرطانية في الوقت الفعلي وقياسها كميا بواسطة الفحص المجهري بفاصل زمني وتحليل التتبع الآلي5،12،13،14،15،16. علاوة على ذلك ، توفر ToCs إمكانية تحليل ومعالجة العمليات الحاسمة التي تنظم ظهور السرطان وتقدمه والاستجابة للعلاج17.

في هذه المقالة ، يتم الجمع بين mFC مع ToCs لدراسة جميع مستويات الاستجابة المناعية المضادة للسرطان التي تمر عبر البلعمة بوساطة DC للسرطان Ags (الخطوات 1-3) ، والتحضير المتقاطع للخلايا التائية (الخطوة 4) ، والتنشيط والتوسع النسيلي (الأخير عن طريق تقنية 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) و Cu (I) المحفزة بالإضافة الحلقية [انقر] ، وهي منهجية حساسة ودقيقة للغاية ، الخطوة 5) ، توجيه الخلاياCD8 E إلى TME (الخطوة 6) ، وأخيرا قتل الخلايا السرطانية بوساطة الخلاياE CD8 (الخطوة 7 ، الشكل 1).

يساهم هذا العمل في الجهود المبذولة لإنشاء بروتوكولات قياسية بسيطة وسريعة وموثوقة لدراسة دورة مناعة السرطان. إن تحسين ودمج نماذج mFC و ToC في أبحاث السرطان ، وديناميكيات TME ، والاستجابة للعلاج تحمل إمكانات كبيرة لأن هذه النماذج توفر الدقة البيولوجية جنبا إلى جنب مع التحكم التجريبي. ومن ثم ، يساعد هذا البروتوكول على إعادة إنشاء دورة المناعة السرطانية بطريقة تدريجية من خلال إتاحة توصيف ومراقبة ومناورة أدوار لاعبي الخلايا الفردية وتفاعلاتهم المتبادلة على المراقبة المناعية الطبيعية والمكتسبة. سيساعد هذا في النهاية على تحسين الدراسات على وتقليلها واستبدالها مع توفير رؤى مهمة للتغلب على الأورام وتوجيه الرعاية السريرية. أخيرا ، تتم مناقشة مزايا وقيود mFC و ToC بشكل نقدي ومقارنتها بأحدث التقنيات (على سبيل المثال ، التحليلات المكانية عالية الدقة في خلية واحدة وحتى الدقة دون الخلوية) لدفع أبحاث وعلاج الأورام المناعية إلى الأمام.

Protocol

تتوافق جميع خطوات البروتوكول التي تتطلب استخدام مع توجيه الاتحاد الأوروبي 63/2010 ويتم تضمينها في بروتوكول تجريبي معتمد من قبل لجنة التجارب المؤسسية على ووزارة الصحة الإيطالية (رقم الموافقة 858/2015 / PR).

1. تحضير الخلايا السرطانية

  1. روتين زراعة الخلايا السرطانية (اليوم -7 ؛ المدة: 2 ساعة)
    1. تنمو خلايا الساركوما الليفية MCA205 في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 وسط نمو مكمل ب 10٪ (v / v) مصل بقري جنيني (FBS) ، 2 mM L-glutamine ، 100 وحدة دولية / مل بنسلين G ملح الصوديوم ، 100 ميكروغرام / مل كبريتات الستربتومايسين ، و 50 ميكروغرام / مل hygromycin (وسط نمو كامل) ، في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة في ظل ظروف الاستزراع القياسية (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
      ملاحظة: تكييف ظروف الاستزراع وفقا لخط الخلية المختار. في حالة ذوبان الجليد ، تحتاج الخلايا ~ 1 أسبوع من وقت الشفاء للتكيف مع ظروف الثقافة المثلى وإعادة إنشاء دورات الخلية الطبيعية.
    2. لتحسين نمو زراعة الخلايا ، خلايا الصفيحة في 75 سم2 قارورة بكثافة 1 × 106 خلايا / مل في 12-15 مل من وسط النمو الكامل.
      ملاحظة: قد يختلف عدد الخلايا المصنفة عبر خطوط الخلايا المختلفة عادة اعتمادا على حجم الخلية المحدد ووقت المضاعفة. يؤثر التقاء الخلايا بشكل كبير على حالة الخلايا. إذا كانت الخلايا إما قليلة أو متقاربة جدا ، يمكن أن تحدث اضطرابات التمثيل الغذائي وتفضل الاعتقال التكاثري أو الانتقاء النسيلي أو إجهاد الخلايا. بالنسبة لخلايا MCA205 ، يجب إجراء التمرير مرتين في الأسبوع بنسبة تقسيم 1: 10-1: 20.
    3. عندما تصل مزارع الخلايا إلى التقاء أقصى 75٪ -80٪ ، تخلص من وسط النمو الكامل من الطبقة الأحادية للخلية ، واغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) تم تسخينه مسبقا لإزالة FBS ، ثم أضف 1.5 مل من حمض التربسين / الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) المسخن مسبقا لمدة 1-2 دقيقة عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا.
      ملاحظة: يحتوي FBS على مثبطات الأنزيم البروتيني التي قد تعطل النشاط الأنزيمي للتربسين ، وبالتالي فإن إزالته الكاملة هي خطوة حاسمة. يختلف وقت حضانة التربسين حسب نوع الخلية. كمبدأ توجيهي عام ، تجنب الحضانة طويلة الأمد للخلايا ذات التركيز العالي من التربسين لأنها قد ترسم بروتينات سطح الخلية وتؤدي إلى موت الخلايا. في هذه الخطوة ، تحقق من حالة انفصال الخلية باستخدام مجهر ضوئي.
    4. اجمع الخلايا المنفصلة في 10 مل من وسط النمو الكامل الذي تم تسخينه مسبقا لتعطيل النشاط الأنزيمي للتربسين وطردها لمدة 5 دقائق عند 1100 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT). عد الخلايا في شريحة عد الخلايا باستخدام اختبار استبعاد صبغة Trypan Blue ثم أعد زرعها عند التخفيف إلى دعامات مناسبة لثقافة الصيانة (لا تزيد عن 8 مقاطع من الذوبان) أو للإجراءات التجريبية النهائية ، كما هو مفصل أدناه.
  2. موت الخلايا السرطانية - إطلاق الخلايا السرطانية Ags (اليوم 0 ؛ المدة: 30 دقيقة)
    1. بالنسبة للتجارب الوظيفية النهائية ، × اللوحة 310 6 خلايا MCA205 في طبق بتري معالج بزراعة الأنسجة 100 مم في 10 مل من وسط النمو الكامل.
      ملاحظة: بالنسبة للتطبيقات التجريبية المحددة (على سبيل المثال ، تحليل امتصاص Ag للورم بوساطة DC) ، قبل إحداث موت الخلايا ، تم تصنيف الخلايا السرطانية باستخدام رابط الخلايا الفلورية (جدول المواد) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. قم بتشعيع الخلايا بالأشعة فوق البنفسجية (UV)18 (ƛ = 254 نانومتر) على مسافة 9 سم لمدة 3 دقائق ثم احتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 6 ساعات على الأقل للسماح لها بالموت.
      ملاحظة: يمكن أيضا إحداث موت الخلايا السرطانية عن طريق العلاج الكيميائي (على سبيل المثال ، الأدوية المناعية أو غير المناعية5).

2. الثقافة المشتركة للسرطان والخلايا المناعية

  1. امتصاص Ag للسرطان بوساطة DC وعرضه (اليوم 0; التوقيت: 1 ساعة وقت مقاعد البدلاء ، 24 ساعة وقت الحضانة)
    1. بعد 4-6 ساعات ، اجمع DCs ، في المختبر متباينة عن خلايا نخاع العظم (BM) للفئران ذات الكفاءة المناعية كما هو موضح سابقا8 ، واغسلها مرتين لمدة 5 دقائق عند 1100 × جم في RT في وسط نمو كامل.
      ملاحظة: يمكن بدلا من ذلك عزل DCs من الخلايا الطحالية للفأر عن طريق الطرد المركزي على التدرج القائم على Histodenz كما ورد سابقا19. كممارسة جيدة ، إذا تم استخدام DCs المحفوظة بالتبريد ، فتأكد من التسخين المسبق لوسط النمو الكامل واستكماله ب 1: 1000 benzonase لمنع تكتل الخلايا وبالتالي ضمان انتعاش جيد عند الذوبان.
    2. اجمع الخلايا السرطانية المشععة بالأشعة فوق البنفسجية من الخطوة 1.2.2 وطردها مركزيا لمدة 5 دقائق عند 1100 × جم في RT. عد DCs "الفارغة" المشتقة من BM (DCN) على النحو الوارد أعلاه (انظر الخطوة 1.1.4) ثم قم بتعيين الثقافة المشتركة مع خلايا موت الخلايا المبرمج المشععة بالأشعة فوق البنفسجية بنسبة 2: 1 (5 × 105 خلايا MCA205 موت الخلايا المبرمج لمدة 2.5 × 105 DCs ، كما تم تحسينها سابقا8) في 12 لوحة بئر في 1 مل من وسط النمو الكامل الطازج لمدة 24 ساعة عند 37 درجةج ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. كضوابط تجريبية ، احتضان الخلايا عند 4 درجات مئوية ، وهي حالة يتم فيها إعاقة البلعمة.
      ملاحظة: لا تقم بزيادة سطح وحجم الثقافة المشتركة لأن ذلك قد يعيق تفاعلات الخلايا السرطانية المبرمج - DC وبالتالي يعيق البلعمة الأمثل والفعال. علاوة على ذلك ، يجب إجراء دراسات لتحسين نسبة الخلايا السرطانية: DC إذا تم استخدام نماذج أخرى من الخلايا السرطانية.
  2. تقييم امتصاص Ag للسرطان بواسطة mFC (اليوم 1 ؛ المدة: 2 ساعة)
    1. بعد 24 ساعة من الحضانة ، اجمع الخلايا في أنابيب سعة 15 مل واغسلها مرتين لمدة 5 دقائق عند 1100 × جم في RT في 10 مل من وسط النمو الكامل.
      ملاحظة: لتقليل ضوضاء الخلفية للخلايا المبرمج العالقة بغشاء التيار المستمر والتي لم تبتلعها بالكامل بعد ، يتم تحضين كريات الخلايا لمدة 5 دقائق في RT مع 0.1 M EDTA. ثم يتم طرد معلقات الخلايا (التي تحتوي على حوالي 2 × 106 خلايا) مرتين مع 10 مل من وسط النمو كما في الخطوة 2.2.1.
    2. لتلطيخ سطح الخلية ، أعد تعليق DCs المشتقة من BM في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة الباردة (FACS) (1٪ FBS ، 0.1 M EDTA في PBS) التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام من التحكم في النمط المتماثل IgG أو CD11c المترافق المضاد للفأر (PE) في صفيحة دقيقة معالجة بزراعة الأنسجة السفلية على شكل حرف U ذات 96 بئرا واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام للحفاظ على إشارة الفلوروكروم وتجنب التبييض الضوئي.
      ملاحظة: بمجرد حدوث امتصاص مستضد السرطان ، يمكن أيضا التحقق من تنشيط DC (DC PHAGO) "الكامل" عن طريق التحقق من مستويات التعبير عن الجزيئات المكلفة (أي إما CD80 أو CD86 و MHC-II ومستضد نقطة التفتيش المناعي CD274 [المعروف باسم PDL1]). كقاعدة عامة ، للحصول على أداء مقياس التدفق الخلوي الأمثل ، يجب معايرة تركيز الأجسام المضادة بعناية ويجب أن يتراوح عدد الخلايا من 1 × 105 إلى 1 × 108 خلايا / اختبار.
    3. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين في مخزن FACS المؤقت وأضف 100 ميكرولتر من محلول PBS يحتوي على صبغة حمراء قريبة من الأشعة تحت الحمراء (IR) قابلة للتثبيت بتركيز نهائي يبلغ 1 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة في RT.
      ملاحظة: كبديل ، يمكن استخدام أصباغ حيوية أخرى قابلة للتثبيت (مثل البنفسجي والأزرق والبرتقالي والجير والماء) التي لا تتداخل مع انبعاثات التألق المستخدمة.
    4. غسل الخلايا مرة واحدة في PBS وإعادة تعليقها في المخزن المؤقت FACS قبل تحليل التدفق الخلوي لمستويات CD11c و PKH67 عن طريق mFC. أثناء الاستحواذ على mFC ، ثم في تحليل البيانات ، تابع استراتيجية البوابة التالية:
      1. حدد الخلايا ذات الأهمية بناء على خصائص منطقة التشتت الأمامية (FSC-A ، المحور x) ومنطقة التشتت الجانبي (SSC-A ، المحور y) (البوابة 1). استبعد مضاعفة الخلايا وتكتلاتها من التحليل عن طريق رسم FSC-A (المحور السيني) وارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H ، المحور y ، البوابة 2).
      2. قم بإزالة الخلايا الميتة عن طريق رسم منطقة مرشح ممر نطاق الانبعاث 780/60 نانومتر (bp) (المحور x) و SSC-A (المحور ص ، البوابة 3). أخيرا ، استنادا إلى البوابة 3 ، اكتشف إيجابية الخلية لعلامة CD11c ورابط الخلية الفلورية PKH67 في مخططات الكثافة ثنائية المعلمات باستخدام مرشحات انبعاث 575/26 نانومتر و 530/30 نانومتر ، على التوالي.
    5. إجراء تحليل البيانات.
      ملاحظة: تأكد من الجمع بين الأجسام المضادة لضمان وضع العلامات بسهولة وكفاءة مع أطوال موجية انبعاث مفصولة جيدا. هذا يبسط إعداد التعويض للفلوروفورات المستخدمة ويسمح بتقدير كمي سهل وسريع وموثوق لمعلمات الاهتمام.
  3. تحضير الخلايا التائية CD8 وتنشيطها (اليوم 1; المدة: 1 ساعة وقت مقاعد البدلاء ، 72-96 ساعة وقت الحضانة)
    1. تنقية الخلايا التائية CD8 الطحال الفئران (CD8N) كما هو موضح سابقا8.
    2. عد وإعادة تعليق الخلايا التائية CD8 المعزولة في 500 ميكرولتر من وسط النمو الكامل الجديد واستزراعها باستخدام DCs المشتقة من BM والتي سبق أن تناولت خلايا MCA205 المبرمج بنسبة 2.5: 1 (2.5 × 105 DCs لخلايا 1 × 105 T ، كما تم تحسينها سابقا8) لمدة 72 ساعة في 12 لوحة بئر في حجم نهائي قدره 1.5 مل عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
      ملاحظة: للتأكيد على النتائج التجريبية ، تم اختبار نسب زراعة الخلايا المختلفة وتم اختيار أفضلها.
  4. تحليل انتشار الخلايا التائية CD8 بواسطة مقايسة EdU mFC (اليوم 4; المدة: 15 دقيقة من وقت مقاعد البدلاء ، 16-20 ساعة من الحضانة)
    1. أضف نظير النوكليوزيد إلى ثيميدين إدو إلى وسط الاستزراع المشترك بتركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر واخلطه جيدا.
      ملاحظة: نظرا لأن ظروف المزرعة وتغيرات نوع الخلية وكثافة الخلايا قد تؤثر على دمج EdU في الحمض النووي ، اختبر مجموعة من تركيزات EdU وأوقات الحضانة في التجارب التجريبية. قد تتطلب الحضانة الأطول أو الأقصر تركيزات أقل أو أعلى ، على التوالي. قم بتضمين الخلايا من نفس السكان التي لم يتم علاجها باستخدام EdU كعنصر تحكم سلبي في التلطيخ.
    2. بعد 16-20 ساعة ، قم بالاسترداد والطرد المركزي CD8C-P مرتين لمدة 5 دقائق عند 1100 × g في RT.
    3. قم بتلطيخ الخلايا بحثا عن علامات السطح في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد FACS المكمل ب 0.5 ميكروغرام من CD8a المترافق بالفلوريسئين المضاد للفأر (FITC) و 0.25 ميكروغرام من CD3 المترافق PE المضاد للفأر أو مع عناصر التحكم في النمط المتماثل IgG في صفيحة دقيقة معالجة ب TC على شكل حرف U ذات 96 بئرا واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
      ملاحظة: لتجنب أي تداخل ، يوصى بعدم استخدام اتحادات الأجسام المضادة Qdot قبل إجراء تفاعل النقر.
    4. اغسل الخلايا مرتين في مخزن FACS المؤقت (كما في الخطوة 2.2.3) وأعد تعليق كريات الخلية في 100 ميكرولتر من محلول PBS يحتوي على صبغة أكوا القابلة للتثبيت الحيوية بتركيز نهائي يبلغ 1 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة في RT.
      1. انقل معلقات الخلايا إلى أنابيب التدفق ، واغسلها مرة واحدة ب 3 مل من 1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في PBS ، واستمر في تثبيت الخلية في 100 ميكرولتر من مثبت (أي 4٪ بارافورمالدهيد في PBS) لمدة 15 دقيقة في RT ، محمي من الضوء.
      2. بعد ذلك مباشرة ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 3 مل من 1٪ BSA في PBS ، واحتضانها في 100 ميكرولتر من محلول يحتوي على نفاذية 1x المستندة إلى الصابونين وكاشف الغسيل لمدة 15 دقيقة في RT ، ثم انتقل مباشرة إلى تفاعل وضع العلامات.
        ملاحظة: يتم تحضير 1x من كاشف النفاذية والغسيل القائم على الصابونين عن طريق تخفيف حجم محلول 10x 1:10 مع 1٪ BSA في PBS. يمكن أيضا استخدام هذا الكاشف مع معلقات الخلايا التي تحتوي على الدم الكامل أو خلايا الدم الحمراء ، لأنه يحافظ على خصائص تشتت الضوء المورفولوجية للكريات البيض أثناء تحليل خلايا الدم الحمراء.
      3. وفقا لعدد العينات المراد تحليلها ، قم بإعداد كوكتيل التفاعل عن طريق خلط الأحجام المشار إليها من PBS بلطف وتسلسل ، ومحفز واقي النحاس ، و Alexa Fluor (AF) 647 - picolyl azide المترافق ، و 1x EdU المضاف العازلة.
        1. استخدم كوكتيل التفاعل في غضون 15 دقيقة من التحضير. أضف 500 ميكرولتر من خليط التفاعل إلى كل أنبوب ، واخلطه جيدا ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
      4. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 3 مل من 1x نفاذية قائمة على الصابونين وكاشف الغسيل ، وأعد تعليقها في 100 ميكرولتر من نفس المحلول قبل الشروع في طرق mFC القياسية لتحديد النسبة المئوية لتكاثر الطور S CD8C-P في مجموعة الخلايا عن طريق mFC. أثناء الحصول على mFC ثم في تحليل البيانات ، تابع استراتيجية البوابة التالية:
        1. حدد الخلايا ذات الأهمية بناء على خصائص FSC-A (المحور x) و SSC-A (المحور y) (البوابة 1). استبعد ثنائيات وتكتلات الخلايا من التحليل عن طريق رسم FSC-A (المحور السيني) و FSC-H (المحور الصادي ، البوابة 2). قم بإزالة الخلايا الميتة عن طريق رسم منطقة مرشح bp للانبعاث 525/50 نانومتر (المحور السيني) و SSC-A (المحور ص ، البوابة 3).
        2. كشف إيجابية الخلية ل CD8a و CD3 في مخططات الكثافة ثنائية المعلمات باستخدام مرشحات انبعاث 530/30 نانومتر و 575/26 نانومتر BP ، على التوالي (البوابة 4). أخيرا استنادا إلى البوابة 4 ، قم بتحليل الخلايا بشكل أكبر لدمج AF647-EdU كمتوسط شدة الفلورسنت في مدرج تكراري لمعلمة واحدة باستخدام مرشح انبعاث 660/620 نانومتر bp.
          ملاحظة: من الأفضل اكتشاف إشارة الفلورسنت الناتجة عن وضع العلامات على EdU باستخدام معدل تدفق منخفض أثناء الاستحواذ.
      5. إجراء تحليل البيانات.

3. إعادة تحفيز CD8C-P مع الخلايا السرطانية

  1. يتعرف CD8C-P على الخلايا السرطانية الحية (اليوم 4; المدة: 1 ساعة وقت مقاعد البدلاء ، 48-72 ساعة من الحضانة)
    1. استعادة CD8C-P من الثقافة المشتركة (راجع الخطوة 2.3.2) وطردها لمدة 10 دقائق عند 1100 × جم عند RT في 10 مل من وسط النمو الكامل.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، تحقق من تمايز الخلايا التائية CD8 عن طريق التحقق من مستويات التعبير الخاصة بعلامة التنشيط CD95.
    2. إعادة تعليق الكريات الخلوية, تحتوي على ما يقرب من 2.5 × 106 خلايا, في 100 ميكروبيدات إزالة الخلايا الميتة لكل 1 × 107 خلايا إجمالية.
      ملاحظة: بالنسبة لأعداد الخلايا الأعلى، قم بزيادة حجم الكاشف والأحجام الإجمالية وفقا لذلك.
    3. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 15 دقيقة في RT.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يتم ضبط حجم العينة عن طريق إضافة 1x عازلة ملزمة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، لتحقيق ما لا يقل عن 500 ميكرولتر المطلوبة للفصل المغناطيسي.
    4. بعد ذلك مباشرة ، تابع فصل الخلايا المغناطيسية اللاحقة. ضع أعمدة الفصل في المجال المغناطيسي للفاصل المناسب واشطفها بالكمية المناسبة من المخزن المؤقت للربط 1x. انقل معلقات الخلايا إلى أعمدة الفصل واجمع التدفق الذي يحتوي على جزء الخلية الحية غير المصنف.
    5. اغسل الأعمدة مرة أخرى بالكمية المناسبة من المخزن المؤقت للربط 1x. اجمع الخلايا غير المصنفة التي تمر عبرها وادمجها مع النفايات السائلة من الخطوة 3.1.4.
      ملاحظة: لزيادة كفاءة الإزالة المغناطيسية للخلايا الميتة ، يمكن إثراء جزء الخلية الحية خلال إجراء فصل ثان كما هو موضح في الخطوات 3.1.1-3.1.5 باستخدام عمود جديد.
    6. أجهزة الطرد المركزي الحية المخصب CD8C-P لمدة 5 دقائق عند 1100 × g في RT في وسط نمو كامل قبل عدد الخلايا ثم زرعها بخلايا MCA205 جديدة بنسبة 2: 1 (1 × 105 خلايا CD8 T لخلايا 5 × 104 MCA205 ، كما تم تحسينها سابقا8) في 12 لوحة بئر بحجم نهائي 1 مل. بعد بذر الخلايا ، ضع ألواح الاستزراع المشترك إما في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة أو نظام تحليل الخلايا الحية لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، قبل الشروع في المقايسات النهائية.
  2. تهريب الخلايا التائية CD8 نحو الخلايا السرطانية في نماذج الموائع الدقيقة ToC (اليوم 5; المدة: 2 ساعة وقت مقاعد البدلاء ، 72 ساعة من الحضانة)
    1. تعقيم أجهزة الموائع الدقيقة ToC المصنعةالمخصصة 13،20 تحت خزانة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة ، وغسلها مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، ثم احتضانها بوسط نمو كامل لمدة 1 ساعة على الأقل.
      ملاحظة: خلايا MCA205 و CD8C-P ليست ملطخة في هذا البروتوكول ؛ ومع ذلك ، يمكن تسمية كلاهما بأجهزة تتبع الخلايا المتوافقة مع الفلورسنت المباشر.
    2. أعد تعليق 1 × 105 خلايا MCA205 برفق في 15 ميكرولتر من وسط النمو الكامل ، مع الحرص على الحصول على توزيع متجانس للخلايا ، وحقنها ببطء في غرف الرقاقة اليسرى (غرفة الورم) كما هو موضح سابقا. انتظر لمدة 5-10 دقائق للسماح للخلايا السرطانية بالالتصاق بالطابق السفلي للرقاقة.
      1. تحقق من التوزيع الصحيح والمتجانس للخلايا السرطانية في رقاقة الموائع الدقيقة تحت المجهر. يمكن أن تتأثر النتائج التجريبية بوجود فقاعات.
    3. أعد تعليق 1 × 106 CD8C-P في 50 ميكرولتر من وسط النمو الكامل. قم بسحب تعليق الخلايا المناعية برفق في غرف الرقاقة اليمنى (الغرفة المناعية).
      ملاحظة: في هذه الخطوة ، استخدم المجهر للتأكد من أن الخلايا المناعية موزعة في الغرفة الوسيطة ، مما يخلق "جبهة" تمثل نقطة البداية للتجربة.
    4. لتجنب الضغط وتقلبات الموائع الدقيقة ، املأ بعناية جميع خزانات الرقائق كما هو موضح سابقا13 بما يصل إلى 150 ميكرولتر من وسط النمو الكامل وضع الرقائق المجمعة على سطح مستو في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة على الأقل لتحقيق الاستقرار في النظام قبل تسجيلات الفاصل الزمني.
      ملاحظة: تحقق بعناية من الخسائر التبخرية المحتملة للأحجام في خزانين لكل غرفة رقاقة وتعويضها عن طريق إضافة وسط جديد كل 2 إلى 3 أيام. إذا لزم الأمر ، يمكن استنشاق ما يصل إلى 100 ميكرولتر من المواد الطافية من كل حجرة خلية لأداء تنميط السيتوكين.
    5. استخدم مجهر الفيديو المجهز بنظام حضانة لتسجيل سلسلة صور المجال الساطع لمصفوفة القنوات الدقيقة بين مناطق الجهاز اليمنى واليسرى التي تحتوي على MCA205 والخلايا المناعية ، على التوالي ، ولتصور ديناميكيات تسلل الخلايا المناعية وتفاعل الخلايا المناعية السرطانية.
      ملاحظة: في الإعداد التجريبي المستخدم هنا ، تم جمع تسجيلات الفاصل الزمني للخلايا في الحاضنة لمدة 72 ساعة باستخدام مجهر حصل على صورة مجهرية واحدة كل دقيقتين. قم بتحسين ظروف التصوير لتجنب التعرض المفرط للصور والحصول على معدل إطارات اكتساب مرتفع من أجل إجراء تحليلات تتبع الخلايا المناعية النهائية بسهولة. في نهاية الفاصل الزمني ، قم بإجراء تحليل تتبع شبه تلقائي13,20.
  3. تنشيط CD8E وتقييم القياس الخلوي لتدفق تفاعل الورم (اليوم 7 و 8 ؛ المدة: 2 ساعة)
    1. بعد 48 و 72 ساعة من الحضانة (انظر الخطوة 3.1.6) ، استرجع CD8E وأجهزة الطرد المركزي مرتين لمدة 5 دقائق عند 1100 × g في RT.
      ملاحظة: لتقييم المستويات داخل الخلايا للجزيئات السامة للخلايا التي تنتجها CD8E (أي IFN-γ و Grz-B) ، تم تحضين الثقافات المشتركة للخلايا المناعية السرطانية سابقا لمدة 6 ساعات على الأقل مع 1: 1000 brefeldin A و 1: 1500 monensin.
    2. بالنسبة لتلطيخ سطح الخلية، يعاد تعليق الخلايا في 20 ميكرولتر من ثلاثة خلطات مختلفة من الأجسام المضادة الأولية المحضرة في مخزن FACS البارد كما في الجدول التكميلي 1.
      ملاحظة: لضمان خصوصية ارتباط الأجسام المضادة ، قم بإجراء تجارب mFC في وجود ضوابط النمط المتماثل IgG المناسبة كما في الخطوة 2.2.2.
    3. احتضان الخلايا في صفيحة مجهرية على شكل حرف U مكونة من 96 بئرا ومعالجتها بزراعة الأنسجة لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء. بالنسبة لكريات الخلايا من الخلطتين A و B (الجدول التكميلي 1) ، انتقل مباشرة إلى الخطوة 3.3.5.
    4. بعد الغسيل السريع ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التثبيت / النفاذية إلى كريات الخلايا من المزيج C (الجدول التكميلي 1). عند الحضانة لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام ، اغسل الخلايا مرتين في 200 ميكرولتر من النفاذية الباردة / المخزن المؤقت للغسيل وأعد تعليقها في 20 ميكرولتر من النفاذية الباردة / المخزن المؤقت للغسيل الذي يحتوي على 0.25 ميكروغرام من IFN-γ المقترن ب FITC المضاد للفأر و 0.125 ميكروغرام من Grz-B المترافق PE المضاد للفأر أو مع الأنماط المتماثلة IgG المعنية. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء.
    5. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين في مخزن FACS المؤقت وأضف إلى كريات الخلايا 100 ميكرولتر من محلول PBS يحتوي على صبغة أكوا القابلة للتثبيت الحيوية بتركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة عند RT (كما في الخطوة 2.2.4).
    6. اغسل الخلايا مرة واحدة في PBS وأعد تعليقها في المخزن المؤقت FACS قبل تحليل التدفق الخلوي لتنشيط الخلايا التائية CD8 ضد الخلايا السرطانية عن طريق mFC. أثناء الحصول على mFC ثم في تحليل البيانات ، تابع استراتيجية البوابة التالية:
      1. حدد الخلايا ذات الأهمية بناء على خصائص FSC-A (المحور x) و SSC-A (المحور y) (البوابة 1). استبعد ثنائيات وتكتلات الخلايا من التحليل عن طريق رسم FSC-A (المحور السيني) و FSC-H (المحور الصادي ، البوابة 2). قم بإزالة الخلايا الميتة عن طريق رسم منطقة مرشح bp للانبعاث 525/50 نانومتر (المحور السيني) و SSC-A (المحور ص ، البوابة 3).
      2. كشف إيجابية الخلية ل CD8a و CD3 في مخططات الكثافة ثنائية المعلمات باستخدام مرشحات انبعاث 660/20 نانومتر و 780/60 نانومتر أو 530/30 نانومتر و 575/26 نانومتر (البوابة 4). أخيرا ، استنادا إلى البوابة 4 ، قم بتحليل الخلايا بشكل أكبر في مخططات الكثافة ثنائية المعلمات ل CD44 (مرشح bp للانبعاث 530/30 نانومتر) ، CD25 (مرشح bp للانبعاث 575/26 نانومتر) ، وعلامات CD69 (مرشح bp للانبعاثات 450/50 نانومتر) لعلامة CD137 (مرشح bp انبعاث 660/20 نانومتر) ، ول IFN-γ (مرشح bp انبعاث 530/30 نانومتر) و Grz-B (مرشح انبعاث 575/26 نانومتر bp) للمزيج A ، (ب) وجيم (الجدول التكميلي 1) على التوالي.
        ملاحظة: يمكن اختبار تفاعل ورم الخلايا CD8E بشكل أكبر من خلال تقييم التعبير السطحي للبروتين المرتبط بالليزوزوم CD107a من خلال مقايسة تحلل مخصصة .
    7. إجراء تحليل البيانات.
  4. التحقيق في قتل الورم بوساطة الخلايا CD8E بواسطة نظام تحليل الخلايا الحية و mFC (اليوم 8; المدة: 1 ساعة وقت مقاعد البدلاء ، 72 ساعة من الحضانة)
    1. بالنسبة لمقايسة قتل الورم عن طريق نظام تحليل الخلايا الحية ، استكمل وسط الاستزراع المشترك (انظر الخطوة 3.1.6) بصبغة تقدير كمية لموت الخلايا في الوقت الفعلي بتركيز نهائي يبلغ 250 نانومتر.
    2. بعد وضع لوحات الاستزراع المشترك في نظام تحليل الخلايا الحية ، اترك اللوحة تسخن إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل المسح. قم بإجراء مسح للبيانات كل 2 ساعة حتى 72 ساعة لجمع تسجيلات الفاصل الزمني ، والتي سيتم تحليلها بواسطة البرامج المناسبة.
    3. لمقايسة قتل الورم باستخدام mFC ، بعد 72 ساعة (انظر الخطوة 3.1.6) ، خلايا الحصاد والطرد المركزي مرتين لمدة 5 دقائق عند 1100 × جم في RT.
    4. خلايا البقع للعلامات السطحية في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS البارد الذي يحتوي على 0.125 ميكروغرام من التحكم في النمط المتماثل IgG أو CD45 الأزرق الهادئ المترافق المضاد للفأر (PB) في صفيحة دقيقة معالجة ب TC على شكل حرف U ذات 96 بئرا واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام. بعد ذلك مباشرة ، اغسل الخلايا مرتين في المخزن المؤقت FACS وأضف يوديد البروبيديوم الصبغة الحيوية (PI) بتركيز نهائي يبلغ 1 ميكرومتر قبل تحليل التدفق الخلوي. أثناء الحصول على mFC ثم في تحليل البيانات ، تابع استراتيجية البوابة التالية:
      1. حدد الخلايا ذات الأهمية بناء على خصائص FSC-A (المحور x) و SSC-A (المحور y) (البوابة 1). استبعد ثنائيات وتكتلات الخلايا من التحليل عن طريق رسم FSC-A (المحور السيني) و FSC-H (المحور الصادي ، البوابة 2).
      2. الكشف عن الخلايا السرطانية لسلبية CD45 باستخدام مرشح انبعاث 450/50 نانومتر BP (البوابة 3). أخيرا ، قم بتحليل الخلايا لدمج PI كمتوسط شدة الفلورسنت في مدرج تكراري لمعلمة واحدة باستخدام مرشح انبعاث 610/620 نانومتر bp.
        ملاحظة: يمكن أيضا تحليل موت الخلايا السرطانية عن طريق إجراء اختبار موت الخلايا المبرمج Annexin V-PI أو عن طريق تقييم مستويات التعبير عن Caspase-3 و -7 المشقوقة.
    5. إجراء تحليل البيانات.
      ملاحظة: تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج Prism GraphPad v.8.4.0.

النتائج

تم تقييم قدرة CD11c + DCs ، وهي مجموعة فرعية من البلعمة المعروفة على نطاق واسع والمتخصصة في العرض المتقاطع21,22 والبوابات كما هو موضح في الشكل 2A ، على ابتلاع الأجسام المبرمج من الخلايا السرطانية MCA205 المشععة بالأشعة فوق البنفسجية والتي تم تصن...

Discussion

تعد مراقبة الاستجابة المناعية المضادة للسرطان ذات أهمية قصوى لتوضيح وفهم التفاعلات الجزيئية والخلوية المعقدة التي تعمل في TME ودعم معركة مستمرة من أجل التفوق23. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول بسيط بمساعدة mFC و ToC لمراقبة وتوصيف الخطوات التي تشكل دورة المناعة السرطانية. مع اختلافات ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

يتم دعم A.S. من قبل AIRC (IG # 28807) و PRIN (#P2022YE2MX). M.M. مدعوم من زمالة AIRC-FIRC (# 25558). يتم دعم ADN من قبل النظام البيئي للابتكار Rome Technopole ECS00000024 بتمويل من الاتحاد الأوروبي - الجيل القادم من الاتحاد الأوروبي ، PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubes Eppendorf30120086
100 kV e-beam litographyVistec
100 mm Petri dishes Greiner Bio One664160
12-well platesEuroclone ET3012
15 and 50 mL tubesCorning 352096; 352070
40 μm cell strainer Corning CLS431750
5 mL polystyrene tubes Greiner Bio-One120180
70 μm cell strainer Corning CLS431751
75 cm2 cell culture treated flaskEuroclone ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) AntibodyMiltenyi Biotec130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody Miltenyi Biotec130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) AntibodyBioLegend100206
AptesSigma Aldrich440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlugBD Biosciences555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)BD Biosciences555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)BD Biosciences554724
Bovine serum albumin (BSA)US Biological, SalemA1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)eBioscience12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)eBioscience17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)eBioscience25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)eBioscience11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)InvitrogenMCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)eBioscience48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)eBioscience53-0951-82
Cell counting slidesKova International87144E
Chromium quartz masksMB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay KitInvitrogenC10635
CytoFLEX Flow CytometerBeckman Coulter
Dead Cell Removal KitMiltenyi Biotec130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)EuroCloneECB4053L
EDTAInvitrogenAM9260G
Fetal bovine serum (FBS)EuroCloneECS0180L
Flowjo v10.0.7Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)eBioscience12-8898-82
H2O2Sigma Aldrich
H2SO4Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)Thermo Scientific
Ice machineBrema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)eBioscience11-7311-82
Illustrator CC 2015Adobe Systems Inc.
ImageJNational Institute of Health
Incucyte 2022A SoftwareSartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead CellsSartorius4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging MicroscopeBulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)Angelantoni
L-glutamine 200 mMEuroCloneECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitInvitrogenL10119
MACS columnsMiltenyi Biotec130-042-201; 130-042-401 
MACS separatorsMiltenyi Biotec130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell lineSigma-AldrichSCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R MicrocentrifugeThermo Scientific75002552
Microsoft Excel Microsoft, Redmond 
Mouse: C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouseMiltenyi Biotec130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BITNikon Instruments Inc.
Optical litographyEVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfateEuroCloneECB3001D/1
Pipet aidDrummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201
PipettesEppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker KitsSigma-AldrichPKH67GL-1KTfluorescent cell linker  kit
plastic coverslipIBIDI10812
Propidium IodideThermo ScientificP1304MP
Reactive Ion Etching systemOxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)EuroCloneECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)Corning- Millipore-Sigma; St. Louis,
MO		CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge SeriesThermo Scientific75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)EuroClone Spa, Milan, ItalyECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 seriesMicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punchesKai Medical, Tedpella
Sylgard 184Dowsil, Dow Corning101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)eBioscience12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS Sigma Aldrich92360
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol RedEuroCloneECM0920
Vacuum dessicator

References

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype. Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).
  3. Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure. Cells. 10 (9), 2361 (2021).
  4. Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. The three Es of cancer immunoediting. Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).
  5. Musella, M., et al. Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B. Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).
  6. Anderson, K. G., et al. Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies. J Immunother Cancer. 11 (6), e006533 (2023).
  7. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  8. Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry. Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).
  9. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Front Mol Biosci. 7, 612801 (2020).
  10. Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy. Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).
  11. Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge. Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).
  12. Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. 3D cancer models: One step closer to in vitro human studies. Front Immunol. 14, 1175503 (2023).
  13. De Ninno, A., et al. Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments. JoVE. (170), e61895 (2021).
  14. Mattei, F., et al. Oncoimmunology meets organs-on-chip. Front Mol Biosci. 8, 627454 (2021).
  15. Businaro, L., et al. Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment. Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).
  16. Vacchelli, E., et al. Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1. Science. 350 (6263), 972-978 (2015).
  17. Maulana, T. I., et al. Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy. Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).
  18. Lorenzi, S., et al. Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming. J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).
  19. Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies. Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).
  20. Lucarini, V., et al. Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma. J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).
  21. Gutiérrez-Martínez, E., et al. Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets. Front Immunol. 6, 363 (2015).
  22. Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  23. Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition. Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).
  24. Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI. Front Oncol. 13, 1172314 (2023).
  25. Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
  26. Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research. Clin Transl Med. 12 (1), 696 (2022).
  27. Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics. Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).
  28. Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. Current trends in flow cytometry automated data analysis software. Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).
  29. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved