A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول بسيط وسريع وموثوق لقياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات وبروتوكول بمساعدة الورم على رقاقة لمراقبة وتوصيف الخطوات التي تشكل دورة مناعة السرطان. في الواقع ، يوفر الفهم الشامل للتفاعلات بين السرطان والخلايا المناعية رؤى مهمة للتغلب على الأورام وتوجيه الرعاية السريرية.
تعتمد أبحاث السرطان الأساسية وتطوير علاجات فعالة للهجوم المضاد على الدراسات التجريبية التي توضح بالتفصيل التفاعلات بين السرطان والخلايا المناعية ، ما يسمى بدورة مناعة السرطان. تتيح أنظمة الاستزراع المشترك في المختبر جنبا إلى جنب مع قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات (mFC) وأجهزة الموائع الدقيقة للورم على الرقاقة (ToCs) مراقبة وتوصيف بسيط وسريع وموثوق لكل خطوة من خطوات دورة المناعة السرطانية وتؤدي إلى تحديد الآليات المسؤولة عن قلب التوازن بين المراقبة المناعية للسرطان والتهرب المناعي. يوفر الفهم الشامل للتفاعلات الديناميكية بين السرطان والخلايا المناعية رؤى مهمة للتغلب على الأورام وسيسرع وتيرة التخصيص العلاجي والتحسين لدى المرضى. على وجه التحديد ، نقوم هنا بتفصيل بروتوكول مباشر بمساعدة mFC و ToC لكشف التعقيدات الديناميكية لكل خطوة من خطوات دورة المناعة السرطانية في خطوط خلايا سرطان الفئران والخلايا المناعية المشتقة من الفئران والتركيز على المراقبة المناعية. بالنظر إلى الميزات المتعلقة بالوقت والتكلفة لهذا البروتوكول ، فمن المؤكد أنه ممكن على نطاق واسع. علاوة على ذلك ، مع اختلافات طفيفة ، يمكن تكييف هذا البروتوكول مع خطوط الخلايا السرطانية البشرية والخلايا المناعية المشتقة من الدم المحيطي البشري ودمجها مع التثبيط الجيني و / أو الدوائي لمسارات محددة من أجل تحديد المؤشرات الحيوية للاستجابة المناعية.
على مدى العقود القليلة الماضية ، كان العلاج المناعي في طليعة الخيارات المتطورة لعلاج السرطان. لقد وفر تسخير الجهاز المناعي لأغراض مضادة للأورام دليلا قويا على المفهوم لصالح المريض عبر الأورام الخبيثة الدموية والصلبة المتنوعة مع تكهنات سيئة تاريخيا. نظرا لأن العلاج المناعي يوفر فرصة للسرطانات التي يصعب علاجها ، فإنه يشهد وتيرة تقدم سريعة بشكل مذهل. يمكن أن يعزى هذا التقدم ، جزئيا على الأقل ، إلى الفهم الدقيق للتفاعل بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية. يشبه هذا التفاعل "محرك" التغذية الأمامية الذي يشعله الجهاز المناعي لتدمير الخلايا السرطانية ، ما يسمى بدورة المناعة السرطانية. تتقدم هذه الاستجابة المناعية المضادة للسرطان عبر ثلاثة مستويات رئيسية: التعرف والمعالجة و....
تتوافق جميع خطوات البروتوكول التي تتطلب استخدام مع توجيه الاتحاد الأوروبي 63/2010 ويتم تضمينها في بروتوكول تجريبي معتمد من قبل لجنة التجارب المؤسسية على ووزارة الصحة الإيطالية (رقم الموافقة 858/2015 / PR).
1. تحضير الخلايا السرطانية
تم تقييم قدرة CD11c + DCs ، وهي مجموعة فرعية من البلعمة المعروفة على نطاق واسع والمتخصصة في العرض المتقاطع21,22 والبوابات كما هو موضح في الشكل 2A ، على ابتلاع الأجسام المبرمج من الخلايا السرطانية MCA205 المشععة بالأشعة فوق البنفسجية والتي تم تصن.......
تعد مراقبة الاستجابة المناعية المضادة للسرطان ذات أهمية قصوى لتوضيح وفهم التفاعلات الجزيئية والخلوية المعقدة التي تعمل في TME ودعم معركة مستمرة من أجل التفوق23. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول بسيط بمساعدة mFC و ToC لمراقبة وتوصيف الخطوات التي تشكل دورة المناعة السرطانية. مع اختلافات .......
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
يتم دعم A.S. من قبل AIRC (IG # 28807) و PRIN (#P2022YE2MX). M.M. مدعوم من زمالة AIRC-FIRC (# 25558). يتم دعم ADN من قبل النظام البيئي للابتكار Rome Technopole ECS00000024 بتمويل من الاتحاد الأوروبي - الجيل القادم من الاتحاد الأوروبي ، PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microtubes | Eppendorf | 30120086 | |
100 kV e-beam litography | Vistec | ||
100 mm Petri dishes | Greiner Bio One | 664160 | |
12-well plates | Euroclone | ET3012 | |
15 and 50 mL tubes | Corning | 352096; 352070 | |
40 μm cell strainer | Corning | CLS431750 | |
5 mL polystyrene tubes | Greiner Bio-One | 120180 | |
70 μm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
75 cm2 cell culture treated flask | Euroclone | ET7076 | |
Adsorbent wipes | |||
Allumin foil | |||
anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-319 | |
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-118-678 | |
anti-mouse CD3 (17A2) Antibody | BioLegend | 100206 | |
Aptes | Sigma Aldrich | 440140 | |
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | |
Bovine serum albumin (BSA) | US Biological, Salem | A1312 | |
CD11c Monoclonal Antibody (N418) | eBioscience | 12-0114-81 | |
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5) | eBioscience | 17-1371-82 | |
CD3 Monoclonal Antibody (17A2) | eBioscience | 25-0032-82 | |
CD44 Monoclonal Antibody (IM7) | eBioscience | 11-0441-82 | |
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | MCD4528 | |
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3) | eBioscience | 48-0691-82 | |
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 11-0081-82 | |
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 17-0081-82 | |
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7) | eBioscience | 53-0951-82 | |
Cell counting slides | Kova International | 87144E | |
Chromium quartz masks | MB W&A, Germany | ||
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10635 | |
CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | EuroClone | ECB4053L | |
EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
Fetal bovine serum (FBS) | EuroClone | ECS0180L | |
Flowjo v10.0.7 | Flowjo, LLC | ||
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB) | eBioscience | 12-8898-82 | |
H2O2 | Sigma Aldrich | ||
H2SO4 | Sigma Aldrich | ||
hotplate | |||
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2) | Thermo Scientific | ||
Ice machine | Brema Ice Makers | ||
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2) | eBioscience | 11-7311-82 | |
Illustrator CC 2015 | Adobe Systems Inc. | ||
ImageJ | National Institute of Health | ||
Incucyte 2022A Software | Sartorius | ||
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells | Sartorius | 4632 | |
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System | Sartorius | ||
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope | Bulldog Bio | ||
Laboratory bench | |||
Laboratory refrigerator (4°C) | |||
Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Angelantoni | ||
L-glutamine 200 mM | EuroClone | ECB3004D | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34957 | |
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L10119 | |
MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201; 130-042-401 | |
MACS separators | Miltenyi Biotec | 130-042-10; 130-042-302 | |
MCA205 mouse fibrosarcoma cell line | Sigma-Aldrich | SCC173 | |
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine | |||
MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002552 | |
Microsoft Excel | Microsoft, Redmond | ||
Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-096-543 | |
Nikon ECLIPSE Ts2 | Nikon Instruments Inc. | ||
NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT | Nikon Instruments Inc. | ||
Optical litography | EVG | ||
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate | EuroClone | ECB3001D/1 | |
Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | |
Pipettes | Eppendorf | ||
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | PKH67GL-1KT | fluorescent cell linker kit |
plastic coverslip | IBIDI | 10812 | |
Propidium Iodide | Thermo Scientific | P1304MP | |
Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab | ||
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | EuroClone | ECB9006L | |
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489 | |
SL 16 Centrifuge Series | Thermo Scientific | 75004031 | |
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers | |||
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | |
SU-8 3000 series | MicroChem corp, Newton, (MA) | ||
Suite of dermal biopsy punches | Kai Medical, Tedpella | ||
Sylgard 184 | Dowsil, Dow Corning | 101697 | |
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597) | eBioscience | 12-5961-82 | |
Thermostatic bath | |||
Timer | |||
TMCS | Sigma Aldrich | 92360 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Scientific | 15250061 | |
Trypsin-EDTA w/ Phenol Red | EuroClone | ECM0920 | |
Vacuum dessicator |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved