A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول بسيط وسريع وموثوق لقياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات وبروتوكول بمساعدة الورم على رقاقة لمراقبة وتوصيف الخطوات التي تشكل دورة مناعة السرطان. في الواقع ، يوفر الفهم الشامل للتفاعلات بين السرطان والخلايا المناعية رؤى مهمة للتغلب على الأورام وتوجيه الرعاية السريرية.

Abstract

تعتمد أبحاث السرطان الأساسية وتطوير علاجات فعالة للهجوم المضاد على الدراسات التجريبية التي توضح بالتفصيل التفاعلات بين السرطان والخلايا المناعية ، ما يسمى بدورة مناعة السرطان. تتيح أنظمة الاستزراع المشترك في المختبر جنبا إلى جنب مع قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات (mFC) وأجهزة الموائع الدقيقة للورم على الرقاقة (ToCs) مراقبة وتوصيف بسيط وسريع وموثوق لكل خطوة من خطوات دورة المناعة السرطانية وتؤدي إلى تحديد الآليات المسؤولة عن قلب التوازن بين المراقبة المناعية للسرطان والتهرب المناعي. يوفر الفهم الشامل للتفاعلات الديناميكية بين السرطان والخلايا المناعية رؤى مهمة للتغلب على الأورام وسيسرع وتيرة التخصيص العلاجي والتحسين لدى المرضى. على وجه التحديد ، نقوم هنا بتفصيل بروتوكول مباشر بمساعدة mFC و ToC لكشف التعقيدات الديناميكية لكل خطوة من خطوات دورة المناعة السرطانية في خطوط خلايا سرطان الفئران والخلايا المناعية المشتقة من الفئران والتركيز على المراقبة المناعية. بالنظر إلى الميزات المتعلقة بالوقت والتكلفة لهذا البروتوكول ، فمن المؤكد أنه ممكن على نطاق واسع. علاوة على ذلك ، مع اختلافات طفيفة ، يمكن تكييف هذا البروتوكول مع خطوط الخلايا السرطانية البشرية والخلايا المناعية المشتقة من الدم المحيطي البشري ودمجها مع التثبيط الجيني و / أو الدوائي لمسارات محددة من أجل تحديد المؤشرات الحيوية للاستجابة المناعية.

Introduction

على مدى العقود القليلة الماضية ، كان العلاج المناعي في طليعة الخيارات المتطورة لعلاج السرطان. لقد وفر تسخير الجهاز المناعي لأغراض مضادة للأورام دليلا قويا على المفهوم لصالح المريض عبر الأورام الخبيثة الدموية والصلبة المتنوعة مع تكهنات سيئة تاريخيا. نظرا لأن العلاج المناعي يوفر فرصة للسرطانات التي يصعب علاجها ، فإنه يشهد وتيرة تقدم سريعة بشكل مذهل. يمكن أن يعزى هذا التقدم ، جزئيا على الأقل ، إلى الفهم الدقيق للتفاعل بين الخلايا السرطانية والخلايا المناعية. يشبه هذا التفاعل "محرك" التغذية الأمامية الذي يشعله الجهاز المناعي لتدمير الخلايا السرطانية ، ما يسمى بدورة المناعة السرطانية. تتقدم هذه الاستجابة المناعية المضادة للسرطان عبر ثلاثة مستويات رئيسية: التعرف والمعالجة و....

Protocol

تتوافق جميع خطوات البروتوكول التي تتطلب استخدام مع توجيه الاتحاد الأوروبي 63/2010 ويتم تضمينها في بروتوكول تجريبي معتمد من قبل لجنة التجارب المؤسسية على ووزارة الصحة الإيطالية (رقم الموافقة 858/2015 / PR).

1. تحضير الخلايا السرطانية

  1. روتين زراعة الخلايا السرطانية (اليوم -7 ؛ المدة: 2 ساعة)
    1. تنمو خلايا الساركوما الليفية MCA205 في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 وسط نمو مكمل ب 10٪ (v / v) مصل بقري جنيني (FBS) ، 2 mM L-glutamine ، 100 وحدة دولية / مل بنسلين G ملح الصوديوم ، 100 ميكروغرام / مل كبريتات الستربتومايسين ، و 50 ميكروغرام / مل hygromycin (وسط نمو كامل) ، في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة في ظل ظروف ا....

النتائج

تم تقييم قدرة CD11c + DCs ، وهي مجموعة فرعية من البلعمة المعروفة على نطاق واسع والمتخصصة في العرض المتقاطع21,22 والبوابات كما هو موضح في الشكل 2A ، على ابتلاع الأجسام المبرمج من الخلايا السرطانية MCA205 المشععة بالأشعة فوق البنفسجية والتي تم تصن.......

Discussion

تعد مراقبة الاستجابة المناعية المضادة للسرطان ذات أهمية قصوى لتوضيح وفهم التفاعلات الجزيئية والخلوية المعقدة التي تعمل في TME ودعم معركة مستمرة من أجل التفوق23. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول بسيط بمساعدة mFC و ToC لمراقبة وتوصيف الخطوات التي تشكل دورة المناعة السرطانية. مع اختلافات .......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

يتم دعم A.S. من قبل AIRC (IG # 28807) و PRIN (#P2022YE2MX). M.M. مدعوم من زمالة AIRC-FIRC (# 25558). يتم دعم ADN من قبل النظام البيئي للابتكار Rome Technopole ECS00000024 بتمويل من الاتحاد الأوروبي - الجيل القادم من الاتحاد الأوروبي ، PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubes Eppendorf30120086
100 kV e-beam litographyVistec
100 mm Petri dishes Greiner Bio One664160
12-well platesEuroclone ET3012
15 and 50 mL tubesCorning 352096; 352070
40 μm cell strainer Corning CLS431750
5 mL polystyrene tubes Greiner Bio-One120180
70 μm cell strainer Corning CLS431751
75 cm2 cell culture treated flaskEuroclone ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) AntibodyMiltenyi Biotec130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody Miltenyi Biotec130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) AntibodyBioLegend100206
AptesSigma Aldrich440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlugBD Biosciences555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)BD Biosciences555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)BD Biosciences554724
Bovine serum albumin (BSA)US Biological, SalemA1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)eBioscience12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)eBioscience17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)eBioscience25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)eBioscience11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)InvitrogenMCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)eBioscience48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)eBioscience53-0951-82
Cell counting slidesKova International87144E
Chromium quartz masksMB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay KitInvitrogenC10635
CytoFLEX Flow CytometerBeckman Coulter
Dead Cell Removal KitMiltenyi Biotec130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)EuroCloneECB4053L
EDTAInvitrogenAM9260G
Fetal bovine serum (FBS)EuroCloneECS0180L
Flowjo v10.0.7Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)eBioscience12-8898-82
H2O2Sigma Aldrich
H2SO4Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)Thermo Scientific
Ice machineBrema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)eBioscience11-7311-82
Illustrator CC 2015Adobe Systems Inc.
ImageJNational Institute of Health
Incucyte 2022A SoftwareSartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead CellsSartorius4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging MicroscopeBulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)Angelantoni
L-glutamine 200 mMEuroCloneECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitInvitrogenL10119
MACS columnsMiltenyi Biotec130-042-201; 130-042-401 
MACS separatorsMiltenyi Biotec130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell lineSigma-AldrichSCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R MicrocentrifugeThermo Scientific75002552
Microsoft Excel Microsoft, Redmond 
Mouse: C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouseMiltenyi Biotec130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BITNikon Instruments Inc.
Optical litographyEVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfateEuroCloneECB3001D/1
Pipet aidDrummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201
PipettesEppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker KitsSigma-AldrichPKH67GL-1KTfluorescent cell linker  kit
plastic coverslipIBIDI10812
Propidium IodideThermo ScientificP1304MP
Reactive Ion Etching systemOxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)EuroCloneECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)Corning- Millipore-Sigma; St. Louis,
MO
CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge SeriesThermo Scientific75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)EuroClone Spa, Milan, ItalyECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 seriesMicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punchesKai Medical, Tedpella
Sylgard 184Dowsil, Dow Corning101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)eBioscience12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS Sigma Aldrich92360
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol RedEuroCloneECM0920
Vacuum dessicator

References

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved