Sistemi in vitro di co-coltura per riprodurre il ciclo cancro-immunità

Riepilogo

Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo semplice, veloce e affidabile di citometria a flusso multiparametrica e tumor-on-a-chip per monitorare e caratterizzare le fasi che costituiscono il ciclo cancro-immunità. In effetti, una comprensione approfondita delle interazioni tra cancro e cellule immunitarie fornisce informazioni critiche per superare in astuzia i tumori e guidare l'assistenza clinica.

Abstract

La ricerca fondamentale sul cancro e lo sviluppo di terapie efficaci di contrattacco si basano su studi sperimentali che descrivono in dettaglio le interazioni tra cancro e cellule immunitarie, il cosiddetto ciclo cancro-immunità. I sistemi di co-coltura in vitro combinati con la citometria a flusso multiparametrica (mFC) e i dispositivi microfluidici (ToC) tumor-on-a-chip consentono un monitoraggio e una caratterizzazione semplici, rapidi e affidabili di ogni fase del ciclo cancro-immunità e portano all'identificazione dei meccanismi responsabili dell'equilibrio tra immunosorveglianza e immunoevasione del cancro. Una comprensione approfondita delle interazioni dinamiche tra cancro e cellule immunitarie fornisce informazioni critiche per superare in astuzia i tumori e accelererà il ritmo della personalizzazione e dell'ottimizzazione terapeutica nei pazienti. In particolare, qui descriviamo in dettaglio un semplice protocollo assistito da mFC e ToC per svelare le complessità dinamiche di ogni fase del ciclo cancro-immunità nelle linee cellulari di cancro murino e nelle cellule immunitarie derivate dal topo e ci concentriamo sull'immunosorveglianza. Considerando le caratteristiche legate ai tempi e ai costi di questo protocollo, è certamente fattibile su larga scala. Inoltre, con piccole variazioni, questo protocollo può essere adattato sia a linee cellulari tumorali umane che a cellule immunitarie derivate da sangue periferico umano e combinato con l'inibizione genetica e/o farmacologica di percorsi specifici al fine di identificare biomarcatori della risposta immunitaria.

Introduzione

Negli ultimi decenni, l'immunoterapia è stata in prima linea tra le opzioni all'avanguardia per il trattamento del cancro. Lo sfruttamento del sistema immunitario con scopi antitumorali ha fornito una potente prova di concetto a beneficio del paziente in diverse neoplasie ematologiche e solide con prognosi storicamente sfavorevoli. Poiché l'immunoterapia sta offrendo un'opportunità per tumori altrimenti difficili da trattare, sta registrando un ritmo di progresso sorprendentemente rapido. Tali progressi possono essere, almeno in parte, attribuiti alla raffinata comprensione dell'interazione tra cellule tumorali e cellule immunitarie. Questa interazione assomiglia a un....

Protocollo

Tutte le fasi del protocollo che prevedono l'utilizzo di animali sono conformi alla Direttiva UE 63/2010 e inserite in un protocollo sperimentale approvato dal Comitato Istituzionale per la Sperimentazione Animale e dal Ministero della Salute italiano (approvazione numero 858/2015/PR).

1. Preparazione delle cellule tumorali

1. Routine di coltura cellulare tumorale (giorno -7; durata: 2 h)
   1. Coltivare cellule murine di fibrosarcoma MCA205 nel terreno di crescita 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) integrato con il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di L-glutammina, 100 UI/mL di sale sodico d....

Discussione

Il monitoraggio della risposta immunitaria antitumorale è della massima importanza per chiarire e comprendere le intricate interazioni molecolari e cellulari che agiscono nel TME e supportano una costante battaglia per la supremazia²³. Qui, descriviamo in dettaglio un semplice protocollo assistito da mFC e ToC per il monitoraggio e la caratterizzazione delle fasi che costituiscono il ciclo cancro-immunità. Con piccole variazioni, questo protocollo, basato su linee cellulari murine e cellule immu.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtubes	Eppendorf	30120086
100 kV e-beam litography	Vistec
100 mm Petri dishes	Greiner Bio One	664160
12-well plates	Euroclone	ET3012
15 and 50 mL tubes	Corning	352096; 352070
40 μm cell strainer	Corning	CLS431750
5 mL polystyrene tubes	Greiner Bio-One	120180
70 μm cell strainer	Corning	CLS431751
75 cm2 cell culture treated flask	Euroclone	ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody	Miltenyi Biotec	130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) Antibody	BioLegend	100206
Aptes	Sigma Aldrich	440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug	BD Biosciences	555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)	BD Biosciences	555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD Biosciences	554724
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological, Salem	A1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)	eBioscience	12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)	eBioscience	17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)	eBioscience	25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)	eBioscience	11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	MCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)	eBioscience	48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)	eBioscience	11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)	eBioscience	17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)	eBioscience	53-0951-82
Cell counting slides	Kova International	87144E
Chromium quartz masks	MB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10635
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman Coulter
Dead Cell Removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)	EuroClone	ECB4053L
EDTA	Invitrogen	AM9260G
Fetal bovine serum (FBS)	EuroClone	ECS0180L
Flowjo v10.0.7	Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)	eBioscience	12-8898-82
H2O2	Sigma Aldrich
H2SO4	Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)	Thermo Scientific
Ice machine	Brema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)	eBioscience	11-7311-82
Illustrator CC 2015	Adobe Systems Inc.
ImageJ	National Institute of Health
Incucyte 2022A Software	Sartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells	Sartorius	4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System	Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope	Bulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Angelantoni
L-glutamine 200 mM	EuroClone	ECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L10119
MACS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201; 130-042-401
MACS separators	Miltenyi Biotec	130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell line	Sigma-Aldrich	SCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002552
Microsoft Excel	Microsoft, Redmond
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2	Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT	Nikon Instruments Inc.
Optical litography	EVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate	EuroClone	ECB3001D/1
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201
Pipettes	Eppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits	Sigma-Aldrich	PKH67GL-1KT	fluorescent cell linker  kit
plastic coverslip	IBIDI	10812
Propidium Iodide	Thermo Scientific	P1304MP
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	EuroClone	ECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge Series	Thermo Scientific	75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 series	MicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punches	Kai Medical, Tedpella
Sylgard 184	Dowsil, Dow Corning	101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)	eBioscience	12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS	Sigma Aldrich	92360
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Scientific	15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol Red	EuroClone	ECM0920
Vacuum dessicator