Sistemi in vitro di co-coltura per riprodurre il ciclo cancro-immunità

Riepilogo

Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo semplice, veloce e affidabile di citometria a flusso multiparametrica e tumor-on-a-chip per monitorare e caratterizzare le fasi che costituiscono il ciclo cancro-immunità. In effetti, una comprensione approfondita delle interazioni tra cancro e cellule immunitarie fornisce informazioni critiche per superare in astuzia i tumori e guidare l'assistenza clinica.

Abstract

La ricerca fondamentale sul cancro e lo sviluppo di terapie efficaci di contrattacco si basano su studi sperimentali che descrivono in dettaglio le interazioni tra cancro e cellule immunitarie, il cosiddetto ciclo cancro-immunità. I sistemi di co-coltura in vitro combinati con la citometria a flusso multiparametrica (mFC) e i dispositivi microfluidici (ToC) tumor-on-a-chip consentono un monitoraggio e una caratterizzazione semplici, rapidi e affidabili di ogni fase del ciclo cancro-immunità e portano all'identificazione dei meccanismi responsabili dell'equilibrio tra immunosorveglianza e immunoevasione del cancro. Una comprensione approfondita delle interazioni dinamiche tra cancro e cellule immunitarie fornisce informazioni critiche per superare in astuzia i tumori e accelererà il ritmo della personalizzazione e dell'ottimizzazione terapeutica nei pazienti. In particolare, qui descriviamo in dettaglio un semplice protocollo assistito da mFC e ToC per svelare le complessità dinamiche di ogni fase del ciclo cancro-immunità nelle linee cellulari di cancro murino e nelle cellule immunitarie derivate dal topo e ci concentriamo sull'immunosorveglianza. Considerando le caratteristiche legate ai tempi e ai costi di questo protocollo, è certamente fattibile su larga scala. Inoltre, con piccole variazioni, questo protocollo può essere adattato sia a linee cellulari tumorali umane che a cellule immunitarie derivate da sangue periferico umano e combinato con l'inibizione genetica e/o farmacologica di percorsi specifici al fine di identificare biomarcatori della risposta immunitaria.

Introduzione

Negli ultimi decenni, l'immunoterapia è stata in prima linea tra le opzioni all'avanguardia per il trattamento del cancro. Lo sfruttamento del sistema immunitario con scopi antitumorali ha fornito una potente prova di concetto a beneficio del paziente in diverse neoplasie ematologiche e solide con prognosi storicamente sfavorevoli. Poiché l'immunoterapia sta offrendo un'opportunità per tumori altrimenti difficili da trattare, sta registrando un ritmo di progresso sorprendentemente rapido. Tali progressi possono essere, almeno in parte, attribuiti alla raffinata comprensione dell'interazione tra cellule tumorali e cellule immunitarie. Questa interazione assomiglia a un "motore" feed-forward che il sistema immunitario accende per distruggere le cellule tumorali, il cosiddetto ciclo cancro-immunità. Questa risposta immunitaria antitumorale progredisce attraverso tre livelli principali: riconoscimento, elaborazione e reazione. In primo luogo, nella fase di riconoscimento, gli antigeni tumorali (Ag) prodotti durante la formazione del tumore vengono rilasciati dalle cellule tumorali morenti nel microambiente tumorale (TME, fase 1) e inghiottiti dalle cellule dendritiche infiltranti il tumore (DC, fase 2). Successivamente, nella fase di elaborazione, le DC presentano gli epitopi dell'Ag tumorale catturato attraverso le molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), esprimono sulla loro superficie livelli più elevati di molecole costimolatorie (fase 3) e si spostano verso i linfonodi drenanti il tumore (dLN) per presentare in modo incrociato il loro carico alle cellule T CD8 naive (CD8_N, fase 4). Tutti questi passaggi convergono nel processo finale di reazione durante il quale le cellule T CD8 cross-primed (CD8_C-P) specifiche per l'Ag vengono attivate, maturano in cellule T effettrici CD8 (CD8_E) e subiscono un'espansione clonale (fase 5). Le cellule_E CD8 lasciano quindi i dLN e si dirigono verso il TME attraverso il sangue (fase 6) dove riconoscono e si legano specificamente alle cellule tumorali attraverso l'interazione tra il loro recettore delle cellule T (TCR) e il loro tumore affine Ags, rilasciano molecole citotossiche [cioè interferone (IFN)-γ, perforine e granzimi (Grz)] e uccidono le cellule tumorali (fase 7)^{1, 2}. L'uccisione delle cellule tumorali porta al rilascio di ulteriori Ag tumorali per alimentare il ciclo cancro-immunità. È un dato di fatto, attraverso tutti questi passaggi, il sistema immunitario distrugge e respinge le cellule tumorali molto più spesso di quanto si supponga. Tuttavia, nei pazienti oncologici, almeno uno di questi passaggi non funziona correttamente. Noi e altri abbiamo dimostrato che le cellule tumorali cercano di bloccare la risposta immunitaria evolvendosi in varianti più aggressive e immunoprivilegiate ^3,4,5 o ostacolando l'efficacia delle cellule T ^6,7.

La ricerca sul cancro e lo sviluppo di farmaci antitumorali si basano entrambi su modelli sperimentali che consentono lo studio della relazione tra cancro e cellule immunitarie, la cosiddetta onco-immunologia. Di seguito sono descritti modelli in vitro veloci, affidabili, riproducibili e a basso costo che riproducono in modo completo ogni fase del ciclo onco-immunologico e viene offerta una visione rapida e chiara delle caratteristiche fenotipiche e funzionali dell'immunosorveglianza e, infine, dell'immunoediting.

La citometria a flusso multiparametrica (mFC) è uno degli strumenti analitici a singola cellula di maggior successo nella ricerca fondamentale sul cancro, nella diagnosi e nella ricerca traslazionale negli studi clinici sul cancro. Poiché consente di catturare contemporaneamente più caratteristiche in ogni cellula, l'mFC si è guadagnata il suo posto come piattaforma di analisi gold standard in onco-immunologia. Abbina un'elevata sensibilità e specificità alla possibilità di misurare in modo rapido e riproducibile più pattern di espressione proteica e proprietà funzionali a livello di singola cellula da sospensioni cellulari eterogenee e persino eterotipiche, come quelle della TME ^8,9,10. Poiché sia i pattern di espressione fenotipici che quelli funzionali sono sensibili al tempo, un'attenta attenzione alla progettazione dell'esperimento, alla selezione di pannelli, controlli e anticorpi titolati appropriati e all'elaborazione appropriata dei campioni e all'uso della strumentazione sono fondamentali per l'affidabilità, la comparabilità e la riproducibilità dei risultati e per interpretare con sicurezza l'esito dell'esperimento¹¹.

I dispositivi microfluidici (ToC) tumor-on-a-chip modellano il TME consentendo la biomimetica in vitro su microscala del cancro e la dinamica delle cellule immunitarie e interagisce 12,13,14,15. In particolare, i ToC sono dispositivi di coltura cellulare microfluidica multicanale in grado di ospitare diversi tipi di cellule organizzate in contesti di coltura bidimensionali (2D) o tridimensionali (3D) e in grado di modellare con alta fedeltà e di controllare con elevata precisione unità strutturali e funzionali chiave come le interazioni cellulari eterotipiche e i flussi di gradienti chimici che si verificano fisiologicamente nel TME^12. 13,14,15. In particolare, la chemioattrazione e le traiettorie immunitarie, nonché l'interazione delle cellule immunitarie con le cellule tumorali, possono essere monitorate in tempo reale e quantificate mediante microscopia time-lapse e analisi di tracciamento automatizzato 5,12,13,14,15,16. Inoltre, i ToC offrono la possibilità di analizzare e manipolare processi cruciali che regolano l'insorgenza e la progressione del cancro e la risposta alla terapia¹⁷.

In questo articolo, le mFC con i ToC sono combinati per studiare tutti i livelli della risposta immunitaria antitumorale che passa attraverso la fagocitosi mediata da DC degli Ag tumorali (passaggi 1-3), il cross-priming delle cellule T (passaggio 4), l'attivazione e l'espansione clonale (quest'ultima per mezzo della tecnologia 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) e della cicloaddizione catalizzata da Cu(I), una metodologia altamente sensibile e accurata, fase 5), homing delle cellule_E CD8 al TME (fase 6) e, infine, uccisione delle cellule tumorali mediata dalle cellule_E CD8 (fase 7, Figura 1).

Questo lavoro contribuisce allo sforzo di stabilire protocolli standard semplici, veloci e affidabili per studiare il ciclo cancro-immunità. Il miglioramento e l'integrazione dei modelli mFC e ToC nella ricerca sul cancro, nelle dinamiche del TME e nella risposta alla terapia hanno un grande potenziale in quanto questi modelli forniscono fedeltà biologica insieme al controllo sperimentale. Pertanto, questo protocollo aiuta a ricreare, in modo graduale, il ciclo cancro-immunità, rendendo possibile caratterizzare, monitorare e manovrare tempestivamente i ruoli dei singoli attori cellulari e le loro interazioni reciproche in seguito all'immunosorveglianza naturale e acquisita. Questo in ultima analisi aiuterà a perfezionare, ridurre e sostituire gli studi sugli animali, fornendo al contempo informazioni critiche per superare in astuzia i tumori e guidare l'assistenza clinica. Infine, i vantaggi e i limiti di mFC e ToC sono discussi criticamente e confrontati con le tecnologie all'avanguardia (ad esempio, analisi spaziali ad alto plex a risoluzione di singola cellula e persino sub-cellulare) per far progredire la ricerca e la terapia onco-immunologica.

Protocollo

Tutte le fasi del protocollo che prevedono l'utilizzo di animali sono conformi alla Direttiva UE 63/2010 e inserite in un protocollo sperimentale approvato dal Comitato Istituzionale per la Sperimentazione Animale e dal Ministero della Salute italiano (approvazione numero 858/2015/PR).

1. Preparazione delle cellule tumorali

1. Routine di coltura cellulare tumorale (giorno -7; durata: 2 h)
   1. Coltivare cellule murine di fibrosarcoma MCA205 nel terreno di crescita 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) integrato con il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di L-glutammina, 100 UI/mL di sale sodico di penicillina G, 100 μg/mL di streptomicina solfato e 50 μg/mL di igromicina (terreno di crescita completo), in un incubatore per colture cellulari umidificato in condizioni di coltura standard (37 °C, 5% CO₂).
      NOTA: Adattare le condizioni di coltura in base alla linea cellulare scelta. In caso di scongelamento, le cellule hanno bisogno di ~1 settimana di tempo di recupero per adattarsi alle condizioni ottimali di coltura e ristabilire i normali cicli cellulari.
   2. Per ottimizzare la crescita delle colture cellulari, le cellule vengono piastrate in fiasche da 75 cm² a una densità di 1 x 10⁶ cellule/mL in 12-15 mL di terreno di crescita completo.
      NOTA: Il numero di cellule seminate può variare tra le diverse linee cellulari, di solito a seconda delle dimensioni specifiche della cellula e del tempo di raddoppio. La confluenza cellulare influenza notevolmente lo stato delle cellule. Se le cellule sono poco o troppo confluenti, possono verificarsi perturbazioni metaboliche che favoriscono l'arresto proliferativo, la selezione clonale o lo stress cellulare. Per le celle MCA205, il passaggio deve essere eseguito due volte a settimana con un rapporto di divisione 1:10-1:20.
   3. Quando le colture cellulari raggiungono una confluenza massima del 75%-80%, scartare l'intero terreno di crescita dal monostrato cellulare, lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pre-riscaldata per rimuovere FBS, quindi aggiungere 1,5 mL di tripsina/acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) preriscaldato allo 0,25% per 1-2 minuti a 37 °C per staccare le cellule.
      NOTA: FBS contiene inibitori della proteasi che possono inattivare l'attività enzimatica della tripsina, quindi la sua completa rimozione è un passaggio cruciale. Il tempo di incubazione della tripsina varia a seconda del tipo di cellula. Come linea guida generale, evitare l'incubazione a lungo termine di cellule con un'alta concentrazione di tripsina in quanto potrebbe striare le proteine della superficie cellulare e innescare la morte cellulare. A questo punto, controllare lo stato di distacco delle cellule con un microscopio ottico.
   4. Raccogliere le cellule staccate in 10 mL di terreno di crescita completo preriscaldato per inattivare l'attività enzimatica della tripsina e centrifugarle per 5 minuti a 1100 × g a temperatura ambiente (RT). Contare le cellule in un vetrino per il conteggio delle cellule utilizzando il test di esclusione del colorante Trypan Blue e quindi riseminarle dopo la diluizione in supporti appropriati per la coltura di mantenimento (non più di 8 passaggi dallo scongelamento) o per le procedure sperimentali a valle, come descritto di seguito.
2. Morte delle cellule tumorali - rilascio di Ag delle cellule tumorali (giorno 0; durata: 30 min)
   1. Per gli esperimenti funzionali a valle, piastra 3 × 10^cellule MCA205 in una piastra di Petri da 100 mm trattata con coltura tissutale in 10 mL di terreno di crescita completo.
      NOTA: Per applicazioni sperimentali specifiche (ad esempio, analisi dell'assorbimento di Ag mediato da DC tumorale), prima di indurre la morte cellulare, le cellule tumorali sono state marcate utilizzando un linker cellulare fluorescente (Tabella dei materiali), secondo le istruzioni del produttore.
   2. Irradiare le cellule con luce ultravioletta (UV)¹⁸ (ƛ = 254 nm) a una distanza di 9 cm per 3 minuti e poi incubarle a 37 °C, 5% CO₂ per almeno 6 ore per farle morire.
      NOTA: La morte delle cellule tumorali può essere indotta anche da un trattamento chemioterapico (ad esempio, farmaci immunogenici o non immunogenici⁵).

2. Co-coltura di cellule tumorali e immunitarie

1. Assorbimento e presentazione dell'Ag mediato da DC (giorno 0; Temporizzazione: 1 ora al banco, 24 ore di incubazione)
   1. Dopo 4-6 ore, raccogliere le DC, differenziate in vitro da cellule del midollo osseo (BM) di topi immunocompetenti come descritto in precedenza⁸, e lavarle due volte per 5 minuti a 1100 x g a RT in terreno di crescita completo.
      NOTA: Le DC possono essere isolate in alternativa dagli splenociti di topo mediante centrifugazione su un gradiente basato su Histodenz, come riportato in precedenza¹⁹. Come buona pratica, se si utilizzano DC crioconservate, assicurarsi di preriscaldare l'intero terreno di coltura e integrarlo con benzonasi 1:1000 per prevenire l'aggregazione delle cellule e garantire così un buon recupero dopo lo scongelamento.
   2. Raccogliere le cellule tumorali irradiate con raggi UV dal passaggio 1.2.2 e centrifugarle per 5 minuti a 1100 x g a RT. Contare le DC "vuote" derivate dal midollo osseo (DC_N) come sopra (vedere il passaggio 1.1.4) e quindi impostare la co-coltura con cellule apoptotiche irradiate con raggi UV a un rapporto 2:1 (5 × 10⁵ cellule MCA205 apoptotiche per 2,5 × 10⁵ DC, come precedentemente ottimizzato⁸) in piastre a 12 pozzetti in 1 mL di terreno di crescita completo fresco per 24 ore a 37 °C, 5% CO₂. Come controlli sperimentali, incubare le cellule a 4 °C, una condizione in cui la fagocitosi è ostacolata.
      NOTA: Non aumentare la superficie e il volume della co-coltura in quanto ciò potrebbe ostacolare le interazioni apoptotiche tra cellule tumorali e DC e quindi impedire una fagocitosi ottimale ed efficace. Inoltre, è necessario eseguire studi per ottimizzare il rapporto cellula tumorale:DC se vengono utilizzati altri modelli di cellule tumorali.
2. Valutazione dell'assorbimento di Ag nel cancro mediante mFC (giorno 1; durata: 2 ore)
   1. Dopo 24 ore di incubazione, raccogliere le cellule in provette da 15 mL e lavarle due volte per 5 minuti a 1100 x g a RT in 10 mL di terreno di crescita completo.
      NOTA: Per ridurre il rumore di fondo delle cellule apoptotiche attaccate alla membrana DC e non ancora completamente inghiottite, i pellet cellulari vengono incubati per 5 minuti a RT con EDTA 0,1 M. Le sospensioni cellulari (contenenti circa 2 x 10⁶ cellule) vengono quindi centrifugate due volte con 10 mL di terreno di crescita come al punto 2.2.1.
   2. Per la colorazione della superficie cellulare, risospendere le DC derivate dal midollo osseo in 20 μL di tampone di selezione cellulare attivato da fluorescenza fredda (FACS) (1% FBS, 0,1 M EDTA in PBS) contenente 0,5 μg di controllo dell'isotipo IgG o CD11c coniugato anti-ficoeritrina (PE) di topo in una micropiastra trattata con coltura di tessuto inferiore a forma di U a 96 pozzetti e incubarle per 20 minuti a 4 °C al buio per preservare il segnale fluorocromo ed evitare il fotosbiancamento.
      NOTA: Una volta che si verifica l'assorbimento dell'antigene tumorale, l'attivazione "completa" della DC (DC_PHAGO) può anche essere verificata controllando i livelli di espressione delle molecole costimolatorie (ad esempio, CD80 o CD86 e MHC-II e del ligando del checkpoint immunitario CD274 antigene [meglio noto come PDL1]). Come regola generale, per prestazioni ottimali del citometro a flusso, la concentrazione di anticorpi deve essere accuratamente titolata e il numero di cellule deve variare da 1 x 10⁵ a 1 x 10⁸ cellule/test.
   3. Successivamente, lavare due volte le cellule nel tampone FACS e aggiungere 100 μl di una soluzione PBS contenente un colorante fissabile nel vicino infrarosso (IR) fissabile alla vitalità a una concentrazione finale di 1 μM per 30 minuti a RT.
      NOTA: In alternativa, possono essere utilizzati altri coloranti fissabili alla vitalità (ad es. Viola, Blu, Arancio, Lime, Acqua) che non si sovrappongono alle emissioni di fluorescenza utilizzate.
   4. Lavare le cellule una volta in PBS e risospenderle in tampone FACS prima dell'analisi citofluorimetrica dei livelli di CD11c e PKH67 mediante mFC. Durante l'acquisizione di mFC e quindi nell'analisi dei dati, procedere con la seguente strategia di gating:
      1. Identifica le celle di interesse in base alle loro proprietà dell'area di dispersione diretta (FSC-A, asse x) e dell'area di dispersione laterale (SSC-A, asse y) (gate 1). Escludere i doppietti e i gruppi di cellule dall'analisi tracciando FSC-A (asse x) e l'altezza di dispersione in avanti (FSC-H, asse y, gate 2).
      2. Rimuovere le celle morte tracciando l'area del filtro passa-banda di emissione (bp) 780/60 nm (asse x) e SSC-A (asse y, gate 3). Infine, sulla base del gate 3, rilevare la positività cellulare per il marcatore CD11c e il linker cellulare fluorescente PKH67 in grafici di densità a due parametri utilizzando filtri bp di emissione 575/26 nm e 530/30 nm, rispettivamente.
   5. Eseguire l'analisi dei dati.
      NOTA: Assicurarsi di combinare gli anticorpi per garantire una marcatura facile ed efficiente con lunghezze d'onda di emissione ben separate. Ciò semplifica l'impostazione della compensazione per i fluorofori utilizzati e consente una quantificazione facile, rapida e affidabile dei parametri di interesse.
3. Priming e attivazione delle cellule T CD8 (giorno 1; Durata: 1 ora al banco, 72-96 ore di incubazione)
   1. Purificare le cellule T CD8 spleniche murine (CD8_N) come descritto in precedenza⁸.
   2. Contare e risospendere le cellule T CD8 isolate in 500 μL di terreno di crescita completo fresco e coltivarle con DC derivate da BM che avevano precedentemente assorbito cellule MCA205 apoptotiche in un rapporto 2,5:1 (2,5 × 10⁵ DC per 1 × 10⁵ cellule T, come precedentemente ottimizzato⁸) per 72 ore in piastre a 12 pozzetti in un volume finale di 1,5 mL a 37 °C, 5% CO₂.
      NOTA: Per enfatizzare i risultati sperimentali, sono stati testati diversi rapporti di coltura cellulare ed è stato scelto il migliore.
4. Analisi della proliferazione delle cellule T CD8 mediante saggio EdU mFC (giorno 4; Durata: 15 min al banco, 16-20 h di incubazione)
   1. Aggiungere l'analogo nucleosidico della timidina EdU al terreno di co-coltura a una concentrazione finale di 10 μM e mescolare bene.
      NOTA: Poiché le condizioni di coltura, le variazioni del tipo di cellula e la densità cellulare possono influenzare l'incorporazione di EdU nel DNA, testare una gamma di concentrazioni di EdU e tempi di incubazione in esperimenti pilota. Incubazioni più lunghe o più brevi possono richiedere concentrazioni più basse o più alte, rispettivamente. Includere cellule della stessa popolazione che non sono state trattate con EdU come controllo di colorazione negativo.
   2. Dopo 16-20 ore, recuperare e centrifugare CD8_CP due volte per 5 minuti a 1100 x g a RT.
   3. Colorare le cellule per i marcatori di superficie in 20 μL di tampone FACS freddo integrato con 0,5 μg di CD8a coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC) e 0,25 μg di CD3 coniugato con PE anti-topo o con i rispettivi controlli isotipi IgG in una micropiastra con TC con fondo a forma di U a 96 pozzetti e incubarle per 20 minuti a 4 °C al buio.
      NOTA: Per evitare qualsiasi interferenza, si consiglia di non utilizzare coniugati anticorpali Qdot prima di eseguire la reazione di clic.
   4. Lavare due volte le celle nel tampone FACS (come al punto 2.2.3) e risospendere i pellet cellulari in 100 μL di una soluzione PBS contenente il colorante Aqua fissabile alla vitalità a una concentrazione finale di 1 μM per 30 minuti a RT.
      1. Trasferire le sospensioni cellulari in provette di flusso, lavarle una volta con 3 mL di albumina sierica bovina (BSA) all'1% in PBS e procedere con la fissazione cellulare in 100 μL di un fissativo (cioè paraformaldeide al 4% in PBS) per 15 minuti a RT, al riparo dalla luce.
      2. Subito dopo, lavare una volta le cellule con 3 mL di BSA all'1% in PBS, incubarle in 100 μL di una soluzione contenente 1x permeabilizzazione a base di saponina e reagente di lavaggio per 15 minuti a RT, quindi passare direttamente alla reazione di marcatura.
         NOTA: 1x reagente di permeabilizzazione e lavaggio a base di saponina viene preparato diluendo un volume di 10x soluzione 1:10 con l'1% di BSA in PBS. Questo reagente può essere utilizzato anche con sospensioni cellulari contenenti sangue intero o globuli rossi, in quanto preserva le caratteristiche morfologiche di dispersione della luce dei leucociti mentre lisa i globuli rossi.
      3. In base al numero di campioni da analizzare, preparare il cocktail di reazione mescolando delicatamente e sequenzialmente i volumi indicati di PBS, catalizzatore protettivo per rame, picolilazide coniugato Alexa Fluor (AF) 647 e 1x additivo tampone EdU.
         1. Utilizzare il cocktail di reazione entro 15 minuti dalla preparazione. Aggiungere 500 μl della miscela di reazione in ciascuna provetta, mescolare bene e incubare per 30 minuti a RT al buio.
      4. Lavare le cellule una volta con 3 mL di reagente di permeabilizzazione e lavaggio a base di saponina 1x e risospenderle in 100 μL della stessa soluzione prima di procedere con i metodi mFC standard per determinare la percentuale di CD8_C-P proliferante in fase S nella popolazione cellulare per mezzo di mFC. Durante l'acquisizione dell'mFC e quindi nell'analisi dei dati, procedere con la seguente strategia di gating:
         1. Identificare le celle di interesse in base alle loro proprietà FSC-A (asse x) e SSC-A (asse y) (gate 1). Escludere i doppietti e i gruppi di cellule dall'analisi tracciando FSC-A (asse x) e FSC-H (asse y, porta 2). Rimuovere le celle morte tracciando l'area del filtro bp di emissione 525/50 nm (asse x) e SSC-A (asse y, gate 3).
         2. Rileva la positività cellulare per CD8a e CD3 in grafici di densità a due parametri utilizzando filtri bp di emissione a 530/30 nm e 575/26 nm, rispettivamente (gate 4). Infine, sulla base del gate 4, analizzare ulteriormente le celle per l'incorporazione di AF647-EdU come intensità fluorescente media in un istogramma a parametro singolo utilizzando un filtro di emissione bp 660/620 nm.
            NOTA: Il segnale fluorescente generato dalla marcatura EdU viene rilevato al meglio utilizzando una bassa portata durante l'acquisizione.
      5. Eseguire l'analisi dei dati.

3. Restimolazione di CD8_C-P con cellule tumorali

1. CD8_C-P riconosce le cellule tumorali vive (giorno 4; Durata: 1 ora di banco al banco, 48-72 ore di incubazione)
   1. Recuperare i CD8_C-P dalla co-coltura (fare riferimento al passaggio 2.3.2) e centrifugarli per 10 minuti a 1100 x g a RT in 10 mL di terreno di crescita completo.
      NOTA: A questo punto, verificare la differenziazione delle cellule T CD8 controllando i livelli di espressione del marcatore di attivazione CD95.
   2. Pellet di cellule di risospensione, contenenti circa 2,5 × 10⁶ cellule, in 100 μl di microsfere di rimozione delle cellule morte per 1 x 10⁷ celle totali.
      NOTA: Per un numero maggiore di celle, aumentare di conseguenza i volumi dei reagenti e dei volumi totali.
   3. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a RT.
      NOTA: Se necessario, il volume del campione viene regolato aggiungendo 1x tampone di legante, secondo le istruzioni del produttore, per ottenere un minimo di 500 μl necessari per la separazione magnetica.
   4. Subito dopo, procedere con la successiva separazione delle celle magnetiche. Posizionare le colonne di separazione nel campo magnetico di un separatore adatto e sciacquarle con la quantità appropriata di tampone legante 1x. Trasferire le sospensioni cellulari nelle colonne di separazione e raccogliere il flusso contenente la frazione di cellule vive non marcata.
   5. Lavare nuovamente le colonne con la quantità appropriata di 1x buffer di legatura. Raccogliere le cellule non etichettate che passano attraverso e combinarle con l'effluente del passaggio 3.1.4.
      NOTA: Per aumentare l'efficienza della rimozione magnetica delle cellule morte, la frazione di cellule vive può essere arricchita in una seconda procedura di separazione, come descritto nei passaggi 3.1.1-3.1.5, utilizzando una nuova colonna.
   6. Centrifugare CD8_C-P vivo arricchito per 5 minuti a 1100 x g a RT in terreno di crescita completo prima della conta cellulare e poi coltivarle con cellule MCA205 fresche in rapporto 2:1 (1 x 10⁵ cellule T CD8 per 5 x 10⁴ cellule MCA205, come precedentemente ottimizzato⁸) in 12 piastre a pozzetti in un volume finale di 1 mL. Dopo la semina cellulare, posizionare le piastre di co-coltura in un incubatore per colture cellulari umidificato o in un sistema di analisi di cellule vive per 72 ore a 37 °C, 5% CO_2, prima di procedere con i saggi a valle.
2. Traffico di cellule T CD8 verso cellule tumorali in modelli microfluidici ToC (giorno 5; Durata: 2 ore al banco, 72 ore di incubazione)
   1. Sterilizzare i dispositivi microfluidici ToC^13,20 fabbricati ad hoc sotto una cappa UV per 20 minuti, lavare due volte con PBS e quindi incubare con terreno di crescita completo per almeno 1 ora.
      NOTA: le cellule MCA205 e CD8_C-P non sono colorate in questo protocollo; Tuttavia, entrambi possono essere etichettati con localizzatori cellulari fluorescenti compatibili con il vivo.
   2. Risospendere delicatamente 1 × 10⁵ cellule MCA205 in 15 μL di terreno di crescita completo, facendo attenzione a ottenere una distribuzione cellulare omogenea, e iniettarle lentamente nelle camere del chip sul lato sinistro (camera tumorale) come descritto in precedenza. Attendi 5-10 minuti per far aderire le cellule tumorali al basamento del chip.
      1. Controllare al microscopio la distribuzione corretta e omogenea delle cellule tumorali nel chip microfluidico. I risultati sperimentali possono essere influenzati dalla presenza di bolle.
   3. Risospendere 1 x 10⁶ CD8_C-P in 50 μL di terreno di crescita completo. Pipettare delicatamente la sospensione di cellule immunitarie nelle camere del chip sul lato destro (camera immunitaria).
      NOTA: In questa fase, utilizzare un microscopio per confermare che le cellule immunitarie sono distribuite nella camera intermedia, creando un "fronte", che rappresenta il punto di partenza dell'esperimento.
   4. Per evitare fluttuazioni di pressione e microfluidiche, riempire accuratamente tutti i serbatoi dei chip come indicato in precedenza¹³ con un massimo di 150 μL di terreno di crescita completo e posizionare i chip assemblati su una superficie piana in un incubatore per colture cellulari umificato a 37 °C, 5% CO₂ per almeno 1 ora per stabilizzare il sistema prima delle registrazioni time-lapse.
      NOTA: Controllare attentamente le potenziali perdite di volume per evaporazione nei due serbatoi di ciascuna camera del chip e compensarle aggiungendo terreno fresco ogni 2 o 3 giorni. Se necessario, è possibile aspirare fino a 100 μL di surnatanti da ciascun compartimento cellulare per eseguire la profilazione delle citochine.
   5. Utilizzare la microscopia video dotata di un sistema di incubazione per registrare serie di immagini in campo chiaro dell'array di microcanali tra le regioni del dispositivo destro e sinistro contenenti rispettivamente MCA205 e cellule immunitarie e per visualizzare le dinamiche dell'infiltrazione delle cellule immunitarie e dell'interazione cellula immunitaria-cellula tumorale.
      NOTA: Nell'impostazione sperimentale qui utilizzata, le registrazioni time-lapse delle cellule sono state raccolte nell'incubatore per 72 ore con un microscopio che ha acquisito una microfotografia ogni 2 minuti. Ottimizza le condizioni di imaging per evitare un'eccessiva esposizione fotografica e per avere un frame rate di acquisizione elevato al fine di eseguire facilmente analisi di tracciamento delle cellule immunitarie a valle. Al termine del time-lapse, eseguire l'analisi di tracciamento semi-automatica^13,20.
3. Valutazione citofluorimetrica dell'attivazione di CD8_E e della reattività tumorale (giorni 7 e 8; Durata: 2 h)
   1. Dopo 48 e 72 ore di incubazione (vedere punto 3.1.6), recuperare il CD8_E e centrifugare due volte per 5 minuti a 1100 x g a RT.
      NOTA: Per valutare i livelli intracellulari di molecole citotossiche prodotte da CD8_E (cioè IFN-γ e Grz-B), le co-colture di cellule tumorali-immunitarie sono state precedentemente incubate per almeno 6 ore con 1:1000 brefeldina A e 1:1500 monensina.
   2. Per la colorazione della superficie cellulare, risospendere le cellule in 20 μL di tre diverse miscele di anticorpi primari preparate in tampone FACS freddo, come indicato nella Tabella 1 supplementare.
      NOTA: Per garantire la specificità del legame anticorpale, eseguire esperimenti con mFC in presenza di controlli appropriati dell'isotipo IgG come al punto 2.2.2.
   3. Incubare le cellule in una micropiastra trattata con coltura di tessuto inferiore a forma di U a 96 pozzetti per 20 minuti a 4 °C, al riparo dalla luce. Per i pellet di celle provenienti dalle miscele A e B (tabella supplementare 1), procedere direttamente al punto 3.3.5.
   4. Dopo un rapido lavaggio, aggiungere 100 μl di soluzione di fissaggio/permeabilizzazione ai pellet cellulari della miscela C (Tabella supplementare 1). Dopo un'incubazione di 20 minuti a 4° C al buio, lavare due volte le cellule in 200 μL di tampone di permeabilizzazione/lavaggio a freddo e risospenderle in 20 μL di tampone di permeabilizzazione/lavaggio a freddo contenenti 0,25 μg di IFN-γ coniugato FITC-anti-topo e 0,125 μg di Grz-B coniugato PE-di topo o con i rispettivi isotipi IgG. Incubare le cellule per 30 minuti a 4°C, al riparo dalla luce.
   5. Successivamente, lavare due volte le celle nel tampone FACS e aggiungere ai pellet cellulari 100 μl di una soluzione PBS contenente il colorante Aqua fissabile alla vitalità a una concentrazione finale di 1 μM per 30 minuti a RT (come al punto 2.2.4).
   6. Lavare le cellule una volta in PBS e risospenderle nel tampone FACS prima dell'analisi citofluorimetrica dell'attivazione delle cellule T CD8 contro le cellule tumorali per mezzo di una mFC. Durante l'acquisizione dell'mFC e quindi nell'analisi dei dati, procedere con la seguente strategia di gating:
      1. Identificare le celle di interesse in base alle loro proprietà FSC-A (asse x) e SSC-A (asse y) (gate 1). Escludere i doppietti e i gruppi di cellule dall'analisi tracciando FSC-A (asse x) e FSC-H (asse y, porta 2). Rimuovere le celle morte tracciando l'area del filtro bp di emissione 525/50 nm (asse x) e SSC-A (asse y, gate 3).
      2. Rilevare la positività cellulare per CD8a e CD3 in grafici di densità a due parametri utilizzando filtri di emissione BP a 660/20 nm e 780/60 nm o 530/30 nm e 575/26 nm (gate 4). Infine, sulla base del gate 4, analizzare ulteriormente le celle nei grafici di densità a due parametri per i marcatori CD44 (filtro bp di emissione 530/30 nm), CD25 (filtro bp di emissione 575/26 nm) e CD69 (filtro bp di emissione 450/50 nm) per il marcatore CD137 (filtro bp di emissione 660/20 nm) e per IFN-γ (filtro bp di emissione 530/30 nm) e Grz-B (filtro bp di emissione 575/26 nm) per la miscela A, B e C (Tabella supplementare 1), rispettivamente.
         NOTA: La reattività tumorale delle cellule_E CD8 può essere ulteriormente testata valutando l'espressione superficiale della proteina CD107a associata ai lisosomi attraverso un saggio di degranulazione ad hoc .
   7. Eseguire l'analisi dei dati.
4. Indagine sull'uccisione del tumore mediata da cellule CD8_E mediante sistema di analisi di cellule vive e mFC (giorno 8; Durata: 1 ora di banco di cottura, 72 ore di incubazione)
   1. Per il saggio di uccisione del tumore mediante un sistema di analisi di cellule vive, integrare il terreno di co-coltura (vedere la fase 3.1.6) con un colorante di quantificazione della morte cellulare in tempo reale a una concentrazione finale di 250 nM.
   2. Dopo aver posizionato le piastre di co-coltura nel sistema di analisi delle cellule vive, lasciare che la piastra si riscaldi a 37 °C per 30 minuti prima della scansione. Eseguire la scansione dei dati ogni 2 ore fino a 72 ore per raccogliere registrazioni time-lapse, che verranno analizzate da appositi software.
   3. Per il test di uccisione del tumore utilizzando mFC, 72 ore dopo (vedere la fase 3.1.6), raccogliere e centrifugare le cellule due volte per 5 minuti a 1100 x g a RT.
   4. Colorare le cellule per i marcatori di superficie in 20 μL di tampone FACS freddo contenente 0,125 μg di controllo dell'isotipo IgG o CD45 coniugato con blu pacifico (PB) anti-topo in una micropiastra trattata con TC con fondo a forma di U a 96 pozzetti e incubarle per 20 minuti a 4 °C al buio. Subito dopo, lavare due volte le cellule nel tampone FACS e aggiungere il colorante vitality propidium iodure (PI) a una concentrazione finale di 1 μM prima dell'analisi citofluorimetrica. Durante l'acquisizione dell'mFC e quindi nell'analisi dei dati, procedere con la seguente strategia di gating:
      1. Identificare le celle di interesse in base alle loro proprietà FSC-A (asse x) e SSC-A (asse y) (gate 1). Escludere i doppietti e i gruppi di cellule dall'analisi tracciando FSC-A (asse x) e FSC-H (asse y, porta 2).
      2. Rilevare le cellule tumorali per la negatività al CD45 utilizzando un filtro bp di emissione a 450/50 nm (gate 3). Infine, analizzare le cellule per l'incorporazione di PI come intensità fluorescente media in un istogramma a parametro singolo utilizzando un filtro di emissione a 610/620 nm bp.
         NOTA: La morte delle cellule tumorali può essere analizzata anche eseguendo il saggio di apoptosi dell'annessina V-PI o valutando i livelli di espressione delle Caspasi-3 e -7 scisse.
   5. Eseguire l'analisi dei dati.
      NOTA: Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software Prism GraphPad v.8.4.0.

Risultati

La capacità delle DC CD11c⁺, il sottogruppo di fagociti ampiamente noto specializzato per la presentazione incrociata^21,22 e gated come mostrato nella Figura 2A, di inghiottire corpi apoptotici da cellule tumorali MCA205 irradiate con raggi UV che erano state precedentemente marcate con il linker cellulare fluorescente PKH67 è stata valutata mediante mFC. Come previsto, le DC CD11c⁺ hanno catturato in modo eff...

Discussione

Il monitoraggio della risposta immunitaria antitumorale è della massima importanza per chiarire e comprendere le intricate interazioni molecolari e cellulari che agiscono nel TME e supportano una costante battaglia per la supremazia²³. Qui, descriviamo in dettaglio un semplice protocollo assistito da mFC e ToC per il monitoraggio e la caratterizzazione delle fasi che costituiscono il ciclo cancro-immunità. Con piccole variazioni, questo protocollo, basato su linee cellulari murine e cellule immu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtubes	Eppendorf	30120086
100 kV e-beam litography	Vistec
100 mm Petri dishes	Greiner Bio One	664160
12-well plates	Euroclone	ET3012
15 and 50 mL tubes	Corning	352096; 352070
40 μm cell strainer	Corning	CLS431750
5 mL polystyrene tubes	Greiner Bio-One	120180
70 μm cell strainer	Corning	CLS431751
75 cm2 cell culture treated flask	Euroclone	ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody	Miltenyi Biotec	130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) Antibody	BioLegend	100206
Aptes	Sigma Aldrich	440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug	BD Biosciences	555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)	BD Biosciences	555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD Biosciences	554724
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological, Salem	A1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)	eBioscience	12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)	eBioscience	17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)	eBioscience	25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)	eBioscience	11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	MCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)	eBioscience	48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)	eBioscience	11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)	eBioscience	17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)	eBioscience	53-0951-82
Cell counting slides	Kova International	87144E
Chromium quartz masks	MB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10635
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman Coulter
Dead Cell Removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)	EuroClone	ECB4053L
EDTA	Invitrogen	AM9260G
Fetal bovine serum (FBS)	EuroClone	ECS0180L
Flowjo v10.0.7	Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)	eBioscience	12-8898-82
H2O2	Sigma Aldrich
H2SO4	Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)	Thermo Scientific
Ice machine	Brema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)	eBioscience	11-7311-82
Illustrator CC 2015	Adobe Systems Inc.
ImageJ	National Institute of Health
Incucyte 2022A Software	Sartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells	Sartorius	4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System	Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope	Bulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Angelantoni
L-glutamine 200 mM	EuroClone	ECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L10119
MACS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201; 130-042-401
MACS separators	Miltenyi Biotec	130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell line	Sigma-Aldrich	SCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002552
Microsoft Excel	Microsoft, Redmond
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2	Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT	Nikon Instruments Inc.
Optical litography	EVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate	EuroClone	ECB3001D/1
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201
Pipettes	Eppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits	Sigma-Aldrich	PKH67GL-1KT	fluorescent cell linker  kit
plastic coverslip	IBIDI	10812
Propidium Iodide	Thermo Scientific	P1304MP
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	EuroClone	ECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge Series	Thermo Scientific	75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 series	MicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punches	Kai Medical, Tedpella
Sylgard 184	Dowsil, Dow Corning	101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)	eBioscience	12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS	Sigma Aldrich	92360
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Scientific	15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol Red	EuroClone	ECM0920
Vacuum dessicator