Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Kanser-Bağışıklık Döngüsünü Çoğaltmak için İn Vitro Sistemlerde Ko-Kültür
Bu Makalede
Özet
Burada, kanser-bağışıklık döngüsünü oluşturan adımları izlemek ve karakterize etmek için basit, hızlı ve güvenilir bir multiparametrik akış sitometrisi ve çip üzerinde tümör destekli protokolü detaylandırıyoruz. Gerçekten de, kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, tümörleri alt etmek ve klinik bakıma rehberlik etmek için kritik bilgiler sağlar.
Özet
Temel kanser araştırmaları ve etkili karşı saldırı tedavilerinin geliştirilmesi, kanser-bağışıklık döngüsü olarak adlandırılan kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri detaylandıran deneysel çalışmalara dayanmaktadır. Multiparametrik akış sitometrisi (mFC) ve çip üzerinde tümör mikroakışkan cihazları (ToC'ler) ile birleştirilmiş in vitro ko-kültür sistemleri, kanser-bağışıklık döngüsünün her adımının basit, hızlı ve güvenilir bir şekilde izlenmesini ve karakterizasyonunu sağlar ve kanser immünosürveyansı ile immünoevazyon arasındaki dengeyi bozmaktan sorumlu mekanizmaların tanımlanmasına yol açar. Kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki dinamik etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, tümörleri alt etmek için kritik bilgiler sağlar ve hastalarda terapötik kişiselleştirme ve optimizasyonun hızını hızlandırır. Spesifik olarak, burada, murin kanseri hücre dizilerinde ve fareden türetilen bağışıklık hücrelerinde kanser-bağışıklık döngüsünün her adımının dinamik karmaşıklıklarını çözmek ve immünosürveyansa odaklanmak için basit bir mFC ve ToC destekli protokolü detaylandırıyoruz. Bu protokolün zaman ve maliyetle ilgili özellikleri göz önüne alındığında, kesinlikle büyük ölçekte uygulanabilir. Ayrıca, küçük varyasyonlarla, bu protokol hem insan kanser hücre hatlarına hem de insan periferik kan kaynaklı bağışıklık hücrelerine uyarlanabilir ve bağışıklık yanıtının biyobelirteçlerini tanımlamak için spesifik yolların genetik ve / veya farmakolojik inhibisyonu ile birleştirilebilir.
Giriş
Son birkaç on yılda, immünoterapi, kanser tedavisi için en son seçeneklerin ön saflarında yer almıştır. Bağışıklık sistemini antitümör amaçlarla kullanmak, tarihsel olarak kötü prognozlara sahip çeşitli hematolojik ve katı malignitelerde hasta yararı için güçlü bir kavram kanıtı sağlamıştır. İmmünoterapi, aksi takdirde tedavi edilmesi zor kanserler için bir fırsat sunduğundan, şaşırtıcı derecede hızlı bir ilerleme hızı yaşamaktadır. Bu tür bir ilerleme, en azından kısmen, kanser hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimin rafine bir şekilde anlaşılmasına bağlanabilir. Bu etkileşim, bağışıklık sisteminin kanser-bağışıklık döngüsü olarak adlandırılan kanser....
Protokol
Protokolün hayvanların kullanımını gerektiren tüm adımları, 63/2010 sayılı AB Direktifi ile uyumludur ve Kurumsal Hayvan Deneyleri Komitesi ve İtalya Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanan bir deney protokolünde yer almaktadır (onay numarası 858/2015/PR).
1. Kanser hücrelerinin hazırlanması
- Kanser hücre kültürü rutini (gün -7; süre: 2 saat)
- Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 büyüme ortamında murin MCA205 fibrosarkom hücrelerini% 10 (h / h) fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 IU / mL penisilin G sodyum tuzu, 100 μg / mL streptomisin sülfat ve 50 μg / mL higromisin (tam büyüme ortamı), stan....
Temsili Sonuçlar
Çapraz sunum21,22 için özelleşmiş ve Şekil 2A'da gösterildiği gibi kapılı, yaygın olarak bilinen fagosit alt kümesi olan CD11c+ DC'lerin, daha önce PKH67 floresan hücre bağlayıcısı ile etiketlenmiş UV ışınlanmış MCA205 kanser hücrelerinden apoptotik cisimleri yutma yeteneği mFC tarafından değerlendirildi. Beklendiği gibi, CD11c + DC'ler, apoptotik MCA205 hücrelerini in vitro ola.......
Tartışmalar
Antikanser immün yanıtının izlenmesi, TME'de rol oynayan ve üstünlük için sürekli bir savaşı destekleyen karmaşık moleküler ve hücresel etkileşimleri aydınlatmak ve anlamak için son derece önemlidir23. Burada, kanser-bağışıklık döngüsünü oluşturan adımların izlenmesi ve karakterizasyonu için basit bir mFC ve ToC destekli protokolü detaylandırıyoruz. Küçük varyasyonlarla, murin hücre hatlarına ve fare kaynaklı bağışıklık hücrelerine dayanan bu protokol.......
Açıklamalar
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
A.S., AIRC (IG #28807) ve PRIN (#P2022YE2MX) tarafından desteklenmektedir. M.M., AIRC-FIRC bursu (#25558) tarafından desteklenmektedir. ADN, AB - Yeni Nesil AB, PNRR Misyon 4 Bileşen 2, Yatırım 1.5 tarafından finanse edilen İnovasyon Ekosistemi Roma Technopole tarafından desteklenmektedir ECS00000024.
....Malzemeler
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorf | 30120086 | |
| 100 kV e-beam litography | Vistec | ||
| 100 mm Petri dishes | Greiner Bio One | 664160 | |
| 12-well plates | Euroclone | ET3012 | |
| 15 and 50 mL tubes | Corning | 352096; 352070 | |
| 40 μm cell strainer | Corning | CLS431750 | |
| 5 mL polystyrene tubes | Greiner Bio-One | 120180 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| 75 cm2 cell culture treated flask | Euroclone | ET7076 | |
| Adsorbent wipes | |||
| Allumin foil | |||
| anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-319 | |
| anti-mouse CD25 (7D4) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-118-678 | |
| anti-mouse CD3 (17A2) Antibody | BioLegend | 100206 | |
| Aptes | Sigma Aldrich | 440140 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
| BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological, Salem | A1312 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418) | eBioscience | 12-0114-81 | |
| CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5) | eBioscience | 17-1371-82 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (17A2) | eBioscience | 25-0032-82 | |
| CD44 Monoclonal Antibody (IM7) | eBioscience | 11-0441-82 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | MCD4528 | |
| CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3) | eBioscience | 48-0691-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 11-0081-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7) | eBioscience | 53-0951-82 | |
| Cell counting slides | Kova International | 87144E | |
| Chromium quartz masks | MB W&A, Germany | ||
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10635 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | EuroClone | ECB4053L | |
| EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| Fetal bovine serum (FBS) | EuroClone | ECS0180L | |
| Flowjo v10.0.7 | Flowjo, LLC | ||
| Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB) | eBioscience | 12-8898-82 | |
| H2O2 | Sigma Aldrich | ||
| H2SO4 | Sigma Aldrich | ||
| hotplate | |||
| Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2) | Thermo Scientific | ||
| Ice machine | Brema Ice Makers | ||
| IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2) | eBioscience | 11-7311-82 | |
| Illustrator CC 2015 | Adobe Systems Inc. | ||
| ImageJ | National Institute of Health | ||
| Incucyte 2022A Software | Sartorius | ||
| Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells | Sartorius | 4632 | |
| Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System | Sartorius | ||
| JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope | Bulldog Bio | ||
| Laboratory bench | |||
| Laboratory refrigerator (4°C) | |||
| Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Angelantoni | ||
| L-glutamine 200 mM | EuroClone | ECB3004D | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34957 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L10119 | |
| MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201; 130-042-401 | |
| MACS separators | Miltenyi Biotec | 130-042-10; 130-042-302 | |
| MCA205 mouse fibrosarcoma cell line | Sigma-Aldrich | SCC173 | |
| Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine | |||
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002552 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Redmond | ||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-096-543 | |
| Nikon ECLIPSE Ts2 | Nikon Instruments Inc. | ||
| NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT | Nikon Instruments Inc. | ||
| Optical litography | EVG | ||
| Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate | EuroClone | ECB3001D/1 | |
| Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | |
| Pipettes | Eppendorf | ||
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | PKH67GL-1KT | fluorescent cell linker kit |
| plastic coverslip | IBIDI | 10812 | |
| Propidium Iodide | Thermo Scientific | P1304MP | |
| Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab | ||
| Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | EuroClone | ECB9006L | |
| serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489 | |
| SL 16 Centrifuge Series | Thermo Scientific | 75004031 | |
| Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers | |||
| Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | |
| SU-8 3000 series | MicroChem corp, Newton, (MA) | ||
| Suite of dermal biopsy punches | Kai Medical, Tedpella | ||
| Sylgard 184 | Dowsil, Dow Corning | 101697 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597) | eBioscience | 12-5961-82 | |
| Thermostatic bath | |||
| Timer | |||
| TMCS | Sigma Aldrich | 92360 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA w/ Phenol Red | EuroClone | ECM0920 | |
| Vacuum dessicator |
Referanslar
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.
Yeniden Basımlar ve İzinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır