Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, kanser-bağışıklık döngüsünü oluşturan adımları izlemek ve karakterize etmek için basit, hızlı ve güvenilir bir multiparametrik akış sitometrisi ve çip üzerinde tümör destekli protokolü detaylandırıyoruz. Gerçekten de, kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, tümörleri alt etmek ve klinik bakıma rehberlik etmek için kritik bilgiler sağlar.

Özet

Temel kanser araştırmaları ve etkili karşı saldırı tedavilerinin geliştirilmesi, kanser-bağışıklık döngüsü olarak adlandırılan kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri detaylandıran deneysel çalışmalara dayanmaktadır. Multiparametrik akış sitometrisi (mFC) ve çip üzerinde tümör mikroakışkan cihazları (ToC'ler) ile birleştirilmiş in vitro ko-kültür sistemleri, kanser-bağışıklık döngüsünün her adımının basit, hızlı ve güvenilir bir şekilde izlenmesini ve karakterizasyonunu sağlar ve kanser immünosürveyansı ile immünoevazyon arasındaki dengeyi bozmaktan sorumlu mekanizmaların tanımlanmasına yol açar. Kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki dinamik etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, tümörleri alt etmek için kritik bilgiler sağlar ve hastalarda terapötik kişiselleştirme ve optimizasyonun hızını hızlandırır. Spesifik olarak, burada, murin kanseri hücre dizilerinde ve fareden türetilen bağışıklık hücrelerinde kanser-bağışıklık döngüsünün her adımının dinamik karmaşıklıklarını çözmek ve immünosürveyansa odaklanmak için basit bir mFC ve ToC destekli protokolü detaylandırıyoruz. Bu protokolün zaman ve maliyetle ilgili özellikleri göz önüne alındığında, kesinlikle büyük ölçekte uygulanabilir. Ayrıca, küçük varyasyonlarla, bu protokol hem insan kanser hücre hatlarına hem de insan periferik kan kaynaklı bağışıklık hücrelerine uyarlanabilir ve bağışıklık yanıtının biyobelirteçlerini tanımlamak için spesifik yolların genetik ve / veya farmakolojik inhibisyonu ile birleştirilebilir.

Giriş

Son birkaç on yılda, immünoterapi, kanser tedavisi için en son seçeneklerin ön saflarında yer almıştır. Bağışıklık sistemini antitümör amaçlarla kullanmak, tarihsel olarak kötü prognozlara sahip çeşitli hematolojik ve katı malignitelerde hasta yararı için güçlü bir kavram kanıtı sağlamıştır. İmmünoterapi, aksi takdirde tedavi edilmesi zor kanserler için bir fırsat sunduğundan, şaşırtıcı derecede hızlı bir ilerleme hızı yaşamaktadır. Bu tür bir ilerleme, en azından kısmen, kanser hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimin rafine bir şekilde anlaşılmasına bağlanabilir. Bu etkileşim, bağışıklık sisteminin kanser-bağışıklık döngüsü olarak adlandırılan kanser hücrelerini yok etmek için ateşlediği ileri beslemeli bir "motora" benzer. Bu antikanser bağışıklık tepkisi üç ana seviyede ilerler: tanıma, işleme ve reaksiyon. İlk olarak, tanıma aşamasında, tümör oluşumu sırasında üretilen tümör antijenleri (Ag'ler), tümör mikroçevresinde ölen kanser hücreleri tarafından salınır (TME, adım 1) ve tümöre sızan dendritik hücreler tarafından yutulur (DC'ler, adım 2). Daha sonra, işleme aşamasında, DC'ler, yakalanan tümör Ag'lerinin epitoplarını majör histouyumluluk kompleksi (MHC) molekülleri aracılığıyla sunar, yüzeylerinde daha yüksek seviyelerde kostimülatör molekülleri eksprese eder (aşama 3) ve yüklerini saf CD8 T hücrelerine çapraz sunmak için tümör boşaltan lenf düğümlerine (dLN'ler) hareket eder (CD8N, adım 4). Tüm bu adımlar, tümör Ag'ye özgü çapraz astarlı CD8 T hücrelerinin (CD8C-P) aktive edildiği, efektör CD8 T (CD8E) hücrelerine olgunlaştığı ve klonal bir genişlemeye uğradığı son reaksiyon sürecinde birleşir (aşama 5). CD8E hücreleri daha sonra dLN'leri terk eder ve kan yoluyla TME'ye (adım 6) gider, burada T hücresi reseptörü (TCR) ile akraba tümörleri Ags arasındaki etkileşim yoluyla kanser hücrelerini spesifik olarak tanır ve bunlara bağlanır, sitotoksik molekülleri serbest bırakır [yani, interferon (IFN)-γ, perforinler ve granzimler (Grzs)] ve kanser hücrelerini öldürür (adım 7)1, 2. Kanser hücresinin öldürülmesi, kanser-bağışıklık döngüsünü beslemek için daha fazla tümör Ag'sinin salınmasına yol açar. Nitekim, tüm bu adımlar sayesinde, bağışıklık sistemi kanser hücrelerini tahmin edilenden çok daha sık yok eder ve reddeder. Ancak kanser hastalarında bu adımlardan en az biri düzgün çalışmaz. Biz ve diğerleri, kanser hücrelerinin ya daha agresif ve bağışıklık ayrıcalıklı varyantlara evrimleşerek ya da T hücresi etkinliğiniengelleyerek bağışıklık tepkisini durdurmaya çalıştığınıgösterdik 3,4,5 ya da T hücresi etkinliğini 6,7 engelleyerek.

Kanser araştırmaları ve kanser ilacı geliştirme, onko-immünoloji olarak adlandırılan kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki ilişkinin incelenmesine izin veren deneysel modellere dayanır. Burada, onko-immünoloji döngüsünün her adımını kapsamlı bir şekilde yeniden üreten ve immünosürveyans ve nihayetinde immüno-düzenlemenin fenotipik ve fonksiyonel özellik setlerinin hızlı ve net bir görünümü sunulan hızlı, güvenilir, tekrarlanabilir ve düşük maliyetli in vitro modeller açıklanmaktadır.

Multiparametrik akış sitometrisi (mFC), kanser klinik çalışmalarında temel kanser araştırmaları, teşhisi ve translasyonel araştırmalarda en başarılı tek hücreli analitik araçlardan biridir. Her hücrede aynı anda daha fazla özellik yakalamaya izin verdiği için mFC, onko-immünolojide altın standart bir analiz platformu olarak yerini almıştır. Yüksek hassasiyet ve özgüllüğü, TME 8,9,10'dan olduğu gibi, heterojen ve hatta heterotipik hücre süspansiyonlarından tek bir hücre düzeyinde çoklu protein ekspresyon paternlerini ve fonksiyonel özellikleri hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçme olasılığı ile birleştirir. Hem fenotipik hem de fonksiyonel ifade kalıpları zamana duyarlı olduğundan, deney tasarımına, uygun panellerin, kontrollerin ve titre edilmiş antikorların seçimine ve uygun numune işleme ve enstrümantasyon kullanımına dikkat edilmesi, sonuçların güvenilirliği, karşılaştırılabilirliği ve tekrarlanabilirliği için kritik öneme sahiptir ve deney sonucunu güvenle yorumlamak için kritik öneme sahiptir11.

Çip üzerinde tümör mikroakışkan cihazlar (ToC'ler), kanser ve bağışıklık hücresi dinamiklerinin in vitro mikro ölçekli biyomimetiklerine ve etkileşimlerine izin vererek TME'yi modeller 12,13,14,15. Spesifik olarak, ToC'ler, iki boyutlu (2D) veya üç boyutlu (3D) kültür ayarlarında organize edilmiş çeşitli hücre tiplerini barındırabilen ve yüksek doğrulukla modelleme yapabilen ve yüksek hassasiyetle kontrol edebilen çok kanallı mikroakışkan hücre kültürü cihazlarıdır, heterotipik hücresel etkileşimler ve TME12'de fizyolojik olarak meydana gelen kimyasal gradyan akışları gibi temel yapısal ve fonksiyonel birimleri, 13,14,15. Özellikle, immün kemocazibe ve yörüngelerin yanı sıra kanser hücreleri ile immün hücre etkileşimi, gerçek zamanlı olarak izlenebilir ve hızlandırılmış mikroskopi ve otomatik izleme analiziile ölçülebilir 5,12,13,14,15,16. Ayrıca, İçindekiler, kanserin başlangıcını ve ilerlemesini ve tedaviye yanıtı düzenleyen önemli süreçleri hem analiz etme hem de manipüle etme imkanı sunar17.

Bu makalede, kanser Ag'lerinin DC aracılı fagositozu (aşama 1-3), T hücresi çapraz hazırlama (adım 4), aktivasyon ve klonal genişleme (sonuncusu 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ve Cu (I) katalizli siklo ekleme [tıklama] teknolojisi, son derece hassas ve doğru bir metodoloji aracılığıyla, adım 5), TME'ye CD8E hücresi homing (adım 6) ve son olarak CD8E hücresi aracılı kanser hücresi öldürme (adım 7, Şekil 1).

Bu çalışma, kanser-bağışıklık döngüsünü incelemek için basit, hızlı ve güvenilir standart protokoller oluşturma çabasına katkıda bulunur. mFC ve ToC modellerinin kanser araştırmalarına, TME dinamiklerine ve tedaviye yanıta iyileştirilmesi ve entegrasyonu, bu modeller deneysel kontrol ile birlikte biyolojik doğruluk sağladığı için büyük bir potansiyele sahiptir. Bu nedenle, bu protokol, bireysel hücre oyuncularının rollerini ve doğal ve edinilmiş immünosürveyans üzerindeki karşılıklı etkileşimlerini karakterize etmeyi, izlemeyi ve zamanında manevra yapmayı mümkün kılarak kanser-bağışıklık döngüsünün aşamalı bir şekilde yeniden oluşturulmasına yardımcı olur. Bu, sonuçta, tümörleri alt etmek ve klinik bakıma rehberlik etmek için kritik bilgiler sağlarken, hayvan çalışmalarının rafine edilmesine, azaltılmasına ve değiştirilmesine yardımcı olacaktır. Son olarak, mFC ve ToC avantajları ve sınırlamaları eleştirel bir şekilde tartışılır ve onko-immünoloji araştırmalarını ve tedavisini ilerletmek için en son teknolojilerle (örneğin, tek hücreli ve hatta hücre altı çözünürlükte yüksek plex uzamsal analizler) karşılaştırılır.

Protokol

Protokolün hayvanların kullanımını gerektiren tüm adımları, 63/2010 sayılı AB Direktifi ile uyumludur ve Kurumsal Hayvan Deneyleri Komitesi ve İtalya Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanan bir deney protokolünde yer almaktadır (onay numarası 858/2015/PR).

1. Kanser hücrelerinin hazırlanması

  1. Kanser hücre kültürü rutini (gün -7; süre: 2 saat)
    1. Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 büyüme ortamında murin MCA205 fibrosarkom hücrelerini% 10 (h / h) fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 IU / mL penisilin G sodyum tuzu, 100 μg / mL streptomisin sülfat ve 50 μg / mL higromisin (tam büyüme ortamı), standart kültür koşulları altında (37 ° C, % 5 CO2).
      NOT: Kültür koşullarını tercih edilen hücre hattına göre uyarlayın. Çözülme durumunda, hücrelerin optimal kültür koşullarına uyum sağlaması ve normal hücre döngülerini yeniden kurması için ~ 1 haftalık iyileşme süresine ihtiyacı vardır.
    2. Hücre kültürü büyümesini optimize etmek için, 75 cm'deki plaka hücreleri2 12-15 mL tam büyüme ortamında 1 x 106 hücre / mL yoğunlukta şişeler.
      NOT: Tohumlanan hücrelerin sayısı, genellikle belirli hücre boyutuna ve iki katına çıkma süresine bağlı olarak farklı hücre dizileri arasında değişebilir. Hücre birleşmesi, hücrelerin durumunu önemli ölçüde etkiler. Hücreler çok az veya çok birleşikse, metabolik bozulmalar meydana gelebilir ve proliferatif arrest, klonal seçim veya hücre stresini destekleyebilir. MCA205 hücreleri için, pasajın haftada iki kez 1: 10-1: 20 bölünme oranında yapılması gerekir.
    3. Hücre kültürleri maksimum %75-80'lik bir birleşmeye ulaştığında, hücre tek tabakasından tüm büyüme ortamını atın, FBS'yi çıkarmak için hücreleri önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve ardından hücreleri ayırmak için 1.5 mL önceden ısıtılmış %0,25 tripsin/etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 1-2 dakika boyunca 37 ° C'de.
      NOT: FBS, tripsin enzimatik aktivitesini inaktive edebilen proteaz inhibitörleri içerir, bu nedenle tamamen çıkarılması çok önemli bir adımdır. Tripsin inkübasyon süresi hücre tipine bağlı olarak değişir. Genel bir kural olarak, hücre yüzey proteinlerini şeritleyebileceği ve hücre ölümünü tetikleyebileceği için yüksek tripsin konsantrasyonuna sahip hücrelerin uzun süreli inkübasyonundan kaçının. Bu adımda, hücre ayrılma durumunu bir ışık mikroskobu ile kontrol edin.
    4. Tripsin enzimatik aktivitesini etkisiz hale getirmek için ayrılmış hücreleri 10 mL önceden ısıtılmış tam büyüme ortamında toplayın ve oda sıcaklığında (RT) 1100 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Tripan Blue boya dışlama testini kullanarak bir hücre sayma slaytındaki hücreleri sayın ve daha sonra aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, idame kültürü (çözülmeden en fazla 8 pasaj) veya aşağı akış deneysel prosedürleri için uygun desteklere seyreltildikten sonra yeniden tohumlayın.
  2. Kanser hücresi ölümü - kanser hücresi Ag'lerin salınımı (gün 0; süre: 30 dk)
    1. Aşağı akış fonksiyonel deneyler için, plaka 3 × 106 MCA205 hücrelerini, 10 mL tam büyüme ortamında 100 mm'lik doku kültürü ile muamele edilmiş bir Petri kabında 100 mL'lik bir petri kabında birleştirir.
      NOT: Spesifik deneysel uygulamalar için (örneğin, DC aracılı tümör Ag alımının analizi), hücre ölümünü indüklemeden önce, kanser hücreleri, üreticinin talimatlarına göre bir floresan hücre bağlayıcısı (Malzeme Tablosu) kullanılarak etiketlenmiştir.
    2. Hücreleri ultraviyole (UV) ışık18 (ƛ = 254 nm) ile 9 cm mesafede 3 dakika ışınlayın ve ardından ölmelerini sağlamak için en az 6 saat boyunca 37 °C,% 5 CO2'de inkübe edin.
      NOT: Kanser hücresi ölümü kemoterapötik tedavi ile de indüklenebilir (ör., immünojenik veya immünojenik olmayan ilaçlar5).

2. Kanser ve bağışıklık hücrelerinin ko-kültürü

  1. DC aracılı kanser Ag tutulumu ve prezentasyonu (gün 0; Zamanlama: 1 saat tezgah süresi, 24 saat kuluçka süresi)
    1. 4-6 saat sonra, daha önce8 tarif edildiği gibi immünokompetan farelerin kemik iliği (BM) hücrelerinden in vitro olarak farklılaşmış DC'leri toplayın ve tam büyüme ortamında RT'de 1100 x g'da 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
      NOT: DC'ler alternatif olarak, daha önce bildirildiği gibi Histodenz tabanlı bir gradyan üzerinde santrifüjleme yoluyla fare splenositlerinden izole edilebilir19. İyi bir uygulama olarak, kriyoprezervasyonlu DC'ler kullanılıyorsa, hücre topaklanmasını önlemek ve böylece çözülme sonrasında iyi bir toparlanma sağlamak için tüm büyüme ortamını önceden ısıttığınızdan ve 1:1000 benzonaz ile takviye ettiğinizden emin olun.
    2. Adım 1.2.2'den UV ışınlanmış kanser hücrelerini toplayın ve RT'de 1100 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. BM'den türetilen "boş" DC'leri (DCN) yukarıdaki gibi sayın (bkz. adım 1.1.4) ve ardından UV ışınlanmış apoptotik hücrelerle ko-kültürü 2: 1 oranında ayarlayın (dahaönce optimize edildiği gibi 2.5 × 10 5 DC için 5 ×10 5 apoptotik MCA205 hücreleri 8) 37 ° C'de 24 saat boyunca 1 mL taze tam büyüme ortamında 12 oyuklu plakalardaC,% 5 CO2. Deneysel kontroller olarak, hücreleri fagositozun engellendiği bir durum olan 4 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Apoptotik kanser hücresi-DC etkileşimlerini engelleyebileceği ve dolayısıyla optimal ve etkili fagositozu engelleyebileceği için ko-kültür yüzeyini ve hacmini artırmayın. Ayrıca, diğer kanser hücresi modelleri kullanılıyorsa, kanser hücresi: DC oranını optimize etmek için çalışmalar yapılması gerekir.
  2. mFC ile Cancer Ag tutulum değerlendirmesi (1. gün; süre: 2 saat)
    1. 24 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri 15 mL'lik tüplerde toplayın ve 10 mL tam büyüme ortamında RT'de 1100 x g'da 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
      NOT: DC membranına yapışmış ve henüz tamamen yutulmamış apoptotik hücrelerin arka plan gürültüsünü azaltmak için, hücre peletleri 0.1 M EDTA ile RT'de 5 dakika inkübe edilir. Hücre süspansiyonları (yaklaşık 2 x 106 hücre içeren) daha sonra adım 2.2.1'deki gibi 10 mL büyüme ortamı ile iki kez santrifüjlenir.
    2. Hücre yüzeyi boyama için, BM'den türetilmiş DC'leri 20 μL soğuk floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponunda (% 1 FBS, PBS'de 0.1 M EDTA) 0.5 μg IgG izotip kontrolü veya anti-fare fikoeritrin (PE) konjuge CD11c içeren 96 oyuklu U şeklinde alt doku kültürü ile muamele edilmiş bir mikroplakada yeniden askıya alın ve florokrom sinyalini korumak ve fotoağartmayı önlemek için karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
      NOT: Kanser antijen alımı meydana geldiğinde, "tam" DC (DCPHAGO) aktivasyonu, kostimülatör moleküllerin ekspresyon seviyeleri kontrol edilerek de doğrulanabilir (yani, CD80 veya CD86 ve MHC-II ve bağışıklık kontrol noktası ligandı CD274 antijeni [en iyi PDL1 olarak bilinir]). Genel bir kural olarak, optimal bir akış sitometresi performansı için, antikor konsantrasyonunun dikkatli bir şekilde titre edilmesi ve hücre sayısının 1 x 105 ila 1 x 108 hücre/test arasında değişmesi gerekir.
    3. Daha sonra, hücreleri FACS tamponunda iki kez yıkayın ve RT'de 30 dakika boyunca 1 μM'lik bir nihai konsantrasyonda canlılıkla sabitlenebilir yakın kızılötesi (IR) boya içeren 100 μL bir PBS çözeltisi ekleyin.
      NOT: Alternatif olarak, kullanılan floresan emisyonları ile örtüşmeyen diğer canlılık sabitlenebilir boyalar (örn. Menekşe, Mavi, Turuncu, Kireç, Aqua) kullanılabilir.
    4. Hücreleri PBS'de bir kez yıkayın ve CD11c ve PKH67 seviyelerinin mFC vasıtasıyla akış sitometrik analizinden önce FACS tamponunda yeniden süspanse edin. MFC alımı sırasında ve ardından veri analizinde, aşağıdaki geçit stratejisiyle devam edin:
      1. İlgilenilen hücreleri ileri saçılma alanı (FSC-A, x ekseni) ve yan saçılma alanı (SSC-A, y ekseni) özelliklerine (kapı 1) göre tanımlayın. FSC-A (x ekseni) ve ileri saçılma yüksekliğini (FSC-H, y ekseni, geçit 2) çizerek hücre çiftlerini ve kümelerini analizden hariç tutun.
      2. 780/60 nm emisyon bant geçiren (bp) filtre alanını (x ekseni) ve SSC-A'yı (y ekseni, geçit 3) çizerek ölü hücreleri çıkarın. Son olarak, kapı 3'e dayalı olarak, sırasıyla 575/26 nm ve 530/30 nm emisyon bp filtreleri kullanarak iki parametreli yoğunluk grafiklerinde CD11c markörü ve PKH67 floresan hücre bağlayıcısı için hücre pozitifliğini tespit edin.
    5. Veri analizi gerçekleştirin.
      NOT: İyi ayrılmış emisyon dalga boyları ile kolay ve verimli etiketlemeyi garanti etmek için antikorları birleştirdiğinizden emin olun. Bu, kullanılan floroforlar için kompanzasyon ayarını basitleştirir ve ilgilenilen parametrelerin kolay, hızlı ve güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar.
  3. CD8 T hücresi hazırlama ve aktivasyonu (1. gün; Süre: 1 saat tezgah süresi, 72-96 saat kuluçka süresi)
    1. Murin splenic CD8 T hücrelerini (CD8N) daha önce tarif edildiği gibi saflaştırın8.
    2. İzole edilmiş CD8 T hücrelerini 500 μL taze tam büyüme ortamında sayın ve yeniden süspanse edin ve bunları daha önce apoptotik MCA205 hücrelerini 2.5: 1 oranında almış olan BM'den türetilmiş DC'lerle kültürleyin (daha önce optimize edildiği gibi 1 × 105 T hücreleri için 2.5 ×5 DC, daha önce optimize edildiği gibi8) 37 ° C'de 1.5 mL'lik bir nihai hacimde 12 oyuklu plakalarda 72 saat boyunca, % 5 CO2.
      NOT: Deneysel sonuçları vurgulamak için farklı hücre kültürü oranları test edilmiş ve en iyisi seçilmiştir.
  4. EdU mFC testi ile CD8 T hücre proliferasyon analizi (4. gün; Süre: 15 dk tezgah süresi, 16-20 saat inkübasyon)
    1. Nükleosit analogunu timidin EdU'ya 10 μM'lik bir son konsantrasyonda ko-kültür ortamına ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: Kültür koşulları, hücre tipi varyasyonları ve hücre yoğunluğu EdU'nun DNA'ya dahil edilmesini etkileyebileceğinden, pilot deneylerde bir dizi EdU konsantrasyonunu ve inkübasyon süresini test edin. Daha uzun veya daha kısa inkübasyonlar sırasıyla daha düşük veya daha yüksek konsantrasyonlar gerektirebilir. Negatif boyama kontrolü olarak EdU ile tedavi edilmemiş aynı popülasyondan hücreleri dahil edin.
    2. 16-20 saat sonra, CD8C-P'yi RT'de 1100 x g'de 5 dakika boyunca iki kez kurtarın ve santrifüjleyin.
    3. Hücreleri, 0.5 μg anti-fare floresein izotiyosiyanat (FITC) konjuge CD8a ve 0.25 μg anti-fare PE konjuge CD3 ile desteklenmiş 20 μL soğuk FACS tamponunda veya ilgili IgG izotip kontrolleri ile 96 oyuklu U şeklinde bir alt TC ile muamele edilmiş mikroplakada boyayın ve karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
      NOT: Herhangi bir paraziti önlemek için, tıklama reaksiyonunu gerçekleştirmeden önce Qdot antikor konjugatlarının kullanılmaması önerilir.
    4. Hücreleri FACS tamponunda iki kez yıkayın (adım 2.2.3'te olduğu gibi) ve hücre peletlerini RT'de 30 dakika boyunca 1 μM'lik bir nihai konsantrasyonda canlılıkla sabitlenebilir Aqua boyası içeren 100 μL'lik bir PBS çözeltisinde yeniden süspanse edin.
      1. Hücre süspansiyonlarını akış tüplerine aktarın, PBS'de 3 mL% 1 sığır serum albümini (BSA) ile bir kez yıkayın ve 100 μL bir fiksatifte hücre fiksasyonuna devam edin (ör., PBS'de% 4 paraformaldehit) RT'de 15 dakika boyunca, ışıktan korunarak.
      2. Hemen ardından, hücreleri PBS'de 3 mL% 1 BSA ile bir kez yıkayın, 1x saponin bazlı geçirgenlik ve RT'de 15 dakika boyunca yıkama reaktifi içeren 100 μL'lik bir çözelti içinde inkübe edin ve ardından doğrudan etiketleme reaksiyonuna devam edin.
        NOT: 1x saponin bazlı geçirgenleştirme ve yıkama reaktifi, PBS'de 10x çözelti 1:10'luk bir hacmin %1 BSA ile seyreltilmesiyle hazırlanır. Bu reaktif, kırmızı kan hücrelerini parçalarken lökositlerin morfolojik ışık saçılma özelliklerini koruduğu için tam kan veya kırmızı kan hücreleri içeren hücre süspansiyonları ile de kullanılabilir.
      3. Analiz edilecek numune sayısına göre, belirtilen hacimlerde PBS, bakır koruyucu katalizör, Alexa Fluor (AF) 647 konjuge pikolil azid ve 1x EdU tampon katkı maddesini nazikçe ve sırayla karıştırarak reaksiyon kokteylini hazırlayın.
        1. Reaksiyon kokteylini hazırlandıktan sonra 15 dakika içinde kullanın. Her tüpe 500 μL reaksiyon karışımı ekleyin, iyice karıştırın ve karanlıkta RT'de 30 dakika inkübe edin.
      4. Hücreleri 3 mL 1x saponin bazlı geçirgenlik ve yıkama reaktifi ile bir kez yıkayın ve hücre popülasyonundaki S-fazı proliferatif CD8C-P yüzdesini belirlemek için standart mFC yöntemlerine geçmeden önce aynı çözeltinin 100 μL'sinde yeniden süspanse edin. MFC edinimi ve ardından veri analizi sırasında, aşağıdaki geçit stratejisiyle devam edin:
        1. FSC-A (x ekseni) ve SSC-A (y ekseni) özelliklerine (kapı 1) göre ilgilenilen hücreleri tanımlayın. FSC-A (x ekseni) ve FSC-H'yi (y ekseni, kapı 2) çizerek hücre çiftlerini ve kümelerini analizden çıkarın. 525/50 nm emisyon bp filtre alanını (x ekseni) ve SSC-A'yı (y ekseni, geçit 3) çizerek ölü hücreleri çıkarın.
        2. Sırasıyla 530/30 nm ve 575/26 nm emisyon bp filtreleri kullanarak iki parametreli yoğunluk grafiklerinde CD8a ve CD3 için hücre pozitifliğini tespit edin (kapı 4). Son olarak, kapı 4'e dayanarak, 660/620 nm bp emisyon filtresi kullanarak tek parametreli bir histogramda ortalama floresan yoğunluğu olarak AF647-EdU dahil edilmesi için hücreleri daha fazla analiz edin.
          NOT: EdU etiketlemesi tarafından üretilen floresan sinyali, alım sırasında düşük bir akış hızı kullanılarak en iyi şekilde tespit edilir.
      5. Veri analizi gerçekleştirin.

3. CD8C-P'nin kanser hücreleri ile yeniden uyarılması

  1. CD8C-P canlı kanser hücrelerini tanır (4. gün; Süre: 1 saat tezgah süresi, 48-72 saat inkübasyon)
    1. CD8C-P'yi ko-kültürden geri kazanın (bkz. adım 2.3.2) ve bunları 10 mL tam büyüme ortamında RT'de 1100 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Bu adımda, aktivasyon markörü CD95'in ekspresyon seviyelerini kontrol ederek CD8 T hücresi farklılaşmasını doğrulayın.
    2. Yaklaşık 2,5 × 106 hücre içeren hücre peletlerini, toplam 1 x 107 hücre başına 100 μL ölü hücre çıkarma mikro boncuklarında yeniden süspanse edin.
      NOT: Daha yüksek hücre sayıları için, reaktifi ve toplam hacimleri buna göre ölçeklendirin.
    3. İyice karıştırın ve RT'de 15 dakika inkübe edin.
      NOT: Gerekirse, numune hacmi, manyetik ayırma için gereken minimum 1 μL'yi elde etmek için üreticinin talimatlarına göre 500x bağlama tamponu eklenerek ayarlanır.
    4. Hemen ardından, sonraki manyetik hücre ayrımına devam edin. Ayırma kolonlarını uygun bir ayırıcının manyetik alanına yerleştirin ve uygun miktarda 1x bağlayıcı tampon ile durulayın. Hücre süspansiyonlarını ayırma kolonlarına aktarın ve etiketlenmemiş canlı hücre fraksiyonunu içeren akışı toplayın.
    5. Sütunları uygun miktarda 1x bağlama tamponu ile tekrar yıkayın. İçinden geçen etiketlenmemiş hücreleri toplayın ve bunları adım 3.1.4'teki atık su ile birleştirin.
      NOT: Ölü hücrelerin manyetik olarak uzaklaştırılmasının verimliliğini artırmak için, canlı hücre fraksiyonu, yeni bir sütun kullanılarak adım 3.1.1-3.1.5'te açıklandığı gibi ikinci bir ayırma prosedürü ile zenginleştirilebilir.
    6. Hücre sayımından önce tam büyüme ortamında RT'de 1100 x g'da 5 dakika boyunca zenginleştirilmiş canlı CD8CP'yi santrifüjleyin ve daha sonra bunları 2: 1 oranında taze MCA205 hücreleri ile kültürleyin (5 x 104 MCA205 hücre için 1 x 105 CD8 T hücreleri, daha önce optimize edildiği gibi8) 1 mL'lik bir nihai hacimde 12 kuyucuklu plakada. Hücre tohumlamayı takiben, aşağı akış tahlillerine devam etmeden önce, ko-kültür plakalarını ya nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatörüne ya da 37 ° C'de,% 5 CO2'de 72 saat boyunca bir canlı hücre analiz sistemine yerleştirin.
  2. ToC mikroakışkan modellerinde kanser hücrelerine doğru CD8 T hücresi kaçakçılığı (5. gün; Süre: 2 saat tezgah süresi, 72 saat inkübasyon)
    1. Geçici fabrikasyon ToC mikroakışkan cihazlarını13,20 UV kabini altında 20 dakika sterilize edin, PBS ile iki kez yıkayın ve ardından en az 1 saat boyunca tam büyüme ortamı ile inkübe edin.
      NOT: MCA205 hücreleri ve CD8C-P bu protokolde lekelenmez; Bununla birlikte, her ikisi de floresan canlı uyumlu hücre izleyicileri ile etiketlenebilir.
    2. 1 × 105 MCA205 hücrelerini 15 μL'lik tam büyüme ortamında nazikçe yeniden süspanse edin, homojen bir hücre dağılımı elde etmeye dikkat edin ve bunları daha önce tarif edildiği gibi sol taraftaki çip odalarına (tümör odası) yavaşça enjekte edin. Kanser hücrelerinin çip tabanına yapışması için 5-10 dakika bekleyin.
      1. Mikroskop altında mikroakışkan çipteki kanser hücrelerinin doğru ve homojen dağılımını kontrol edin. Deneysel sonuçlar kabarcıkların varlığından etkilenebilir.
    3. 1 x 106 CD8 C-P'yi 50 μL tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Bağışıklık hücresi süspansiyonunu sağ taraftaki çip odalarına (bağışıklık odası) nazikçe pipetleyin.
      NOT: Bu adımda, bağışıklık hücrelerinin ara odaya dağıtıldığını doğrulamak için bir mikroskop kullanın ve deneyin başlangıç noktasını temsil eden bir "ön" oluşturun.
    4. Basınç ve mikroakışkan dalgalanmalarını önlemek için, daha önce belirtildiği gibi tüm talaş rezervuarlarını13 150 μL'ye kadar tam büyüme ortamı ile dikkatlice doldurun ve monte edilmiş talaşları, hızlandırılmış kayıtlardan önce sistemi stabilize etmek için en az 1 saat boyunca 37 °C, %5CO2'de humifiye edilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe düz bir yüzeye yerleştirin.
      NOT: Her bir talaş odasının iki rezervuarındaki potansiyel buharlaşma hacim kayıplarını dikkatlice kontrol edin ve her 2 ila 3 günde bir taze ortam ekleyerek bunları telafi edin. Gerekirse, sitokin profili oluşturmak için her hücre bölmesinden 100 μL'ye kadar süpernatan aspire edilebilir.
    5. Sırasıyla MCA205 ve bağışıklık hücrelerini içeren sağ ve sol cihaz bölgeleri arasındaki mikrokanal dizisinin parlak alan görüntü serilerini kaydetmek ve bağışıklık hücresi infiltrasyonu ve bağışıklık hücresi-kanser hücresi etkileşiminin dinamiklerini görselleştirmek için bir inkübasyon sistemi ile donatılmış video mikroskobu kurulumunu kullanın.
      NOT: Burada kullanılan deney ortamında, hücrelerin hızlandırılmış kayıtları, her 2 dakikada bir mikrofotoğraf elde eden bir mikroskopla 72 saat boyunca inkübatörde toplandı. Aşırı fotoğraf maruziyetini önlemek ve aşağı akış bağışıklık hücresi izleme analizlerini kolayca gerçekleştirmek için yüksek bir çekim kare hızına sahip olmak için görüntüleme koşullarını optimize edin. Hızlandırılmış çekimin sonunda, yarı otomatik izleme analizi13,20 gerçekleştirin.
  3. CD8E aktivasyonu ve tümör reaktivite akımı sitometrik değerlendirmesi (7. ve 8. gün; Süre: 2 saat)
    1. 48 ve 72 saatlik inkübasyondan sonra (bkz. adım 3.1.6), CD8E'yi geri kazanın ve RT'de 1100 x g'da 5 dakika boyunca iki kez santrifüjleyin.
      NOT: CD8E (yani IFN-γ ve Grz-B) tarafından üretilen sitotoksik moleküllerin hücre içi seviyelerini değerlendirmek için, kansere karşı bağışıklık hücresi ko-kültürleri daha önce 1:1000 brefeldin A ve 1:1500 monensin ile en az 6 saat inkübe edilmiştir.
    2. Hücre yüzeyi boyaması için, Ek Tablo 1'deki gibi soğuk FACS tamponunda hazırlanan üç farklı primer antikor karışımının 20 μL'lik hücrelerinde yeniden süspansiyon haline getirin.
      NOT: Antikor bağlanmasının özgüllüğünü sağlamak için, adım 2.2.2'deki gibi uygun IgG izotip kontrollerinin varlığında mFC deneyleri yapın.
    3. Hücreleri, ışıktan korunarak 4 ° C'de 20 dakika boyunca 96 oyuklu U şeklinde bir alt doku kültürü ile muamele edilmiş mikroplakada inkübe edin. A ve B karışımlarından elde edilen hücre peletleri için (Ek Tablo 1), doğrudan adım 3.3.5'e ilerleyin.
    4. Hızlı bir yıkamadan sonra, C karışımından hücre peletlerine 100 μL fiksasyon/geçirgenleştirme çözeltisi ekleyin (Ek Tablo 1). Karanlıkta 4 ° C'de 20 dakikalık inkübasyondan sonra, hücreleri 200 μL soğuk geçirgenleştirme / yıkama tamponunda iki kez yıkayın ve 0.25 μg anti-fare FITC konjuge IFN-γ ve 0.125 μg anti-fare PE konjuge Grz-B içeren 20 μL soğuk geçirgenleştirme / yıkama tamponunda yeniden süspanse edin veya ilgili IgG izotipleri ile. Hücreleri ışıktan koruyarak 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    5. Daha sonra, hücreleri FACS tamponunda iki kez yıkayın ve RT'de 30 dakika boyunca 1 μM'lik bir nihai konsantrasyonda canlılıkla sabitlenebilir Aqua boyası içeren 100 μL'lik bir PBS solüsyonunu hücre peletlerine ekleyin (adım 2.2.4'te olduğu gibi).
    6. Hücreleri PBS'de bir kez yıkayın ve bir mFC vasıtasıyla kanser hücrelerine karşı CD8 T hücresi aktivasyonunun akış sitometrik analizinden önce FACS tamponunda yeniden süspanse edin. MFC edinimi ve ardından veri analizi sırasında, aşağıdaki geçit stratejisiyle devam edin:
      1. FSC-A (x ekseni) ve SSC-A (y ekseni) özelliklerine (kapı 1) göre ilgilenilen hücreleri tanımlayın. FSC-A (x ekseni) ve FSC-H'yi (y ekseni, kapı 2) çizerek hücre çiftlerini ve kümelerini analizden çıkarın. 525/50 nm emisyon bp filtre alanını (x ekseni) ve SSC-A'yı (y ekseni, geçit 3) çizerek ölü hücreleri çıkarın.
      2. 660/20 nm ve 780/60 nm veya 530/30 nm ve 575/26 nm emisyon bp filtreleri (kapı 4) kullanarak iki parametreli yoğunluk grafiklerinde CD8a ve CD3 için hücre pozitifliğini tespit edin. Son olarak, kapı 4'e dayanarak, CD44 (530/30 nm emisyon bp filtresi), CD25 (575/26 nm emisyon bp filtresi) ve CD69 (450/50 nm emisyon bp filtresi) için iki parametreli yoğunluk grafiklerindeki hücreleri daha fazla analiz edin CD137 işaretleyicisi (660/20 nm emisyon bp filtresi) ve IFN-γ (530/30 nm emisyon bp filtresi) ve Grz-B (575/26 nm emisyon bp filtresi) için karışım A için, Sırasıyla B ve C (Ek Tablo 1).
        NOT:CD8 E hücre tümörü reaktivitesi, CD107a lizozomal ile ilişkili proteinin yüzey ekspresyonunun bir ad hoc degranülasyon testi yoluyla değerlendirilmesiyle daha fazla test edilebilir.
    7. Veri analizi gerçekleştirin.
  4. CD8E hücre aracılı tümör öldürme araştırması, canlı hücre analiz sistemi ve mFC ile (8. gün; Süre: 1 saat tezgah süresi, 72 saat inkübasyon)
    1. Bir canlı hücre analiz sistemi vasıtasıyla tümör öldürme deneyi için, ko-kültür ortamını (bkz. adım 3.1.6) 250 nM'lik bir nihai konsantrasyonda gerçek zamanlı bir hücre ölümü miktar tayin boyası ile destekleyin.
    2. Ko-kültür plakalarını canlı hücre analiz sistemine yerleştirdikten sonra, taramadan önce plakanın 30 dakika boyunca 37 °C'ye ısınmasını bekleyin. Uygun yazılımlar tarafından analiz edilecek olan hızlandırılmış kayıtları toplamak için her 2 saatte bir 72 saate kadar veri taraması yapın.
    3. mFC kullanılarak tümör öldürme deneyi için, 72 saat sonra (bkz. adım 3.1.6), hücreleri RT'de 1100 x g'da 5 dakika boyunca iki kez hasat edin ve santrifüjleyin.
    4. 96 oyuklu U şeklinde alt TC ile muamele edilmiş bir mikroplakada 0.125 μg IgG izotip kontrolü veya anti-fare pasifik mavisi (PB) konjuge CD45 içeren 20 μL soğuk FACS tamponunda yüzey belirteçleri için hücreleri boyayın ve karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin. Hemen ardından, hücreleri FACS tamponunda iki kez yıkayın ve akış sitometrik analizinden önce 1 μM'lik bir son konsantrasyonda canlılık boyası propidyum iyodür (PI) ekleyin. MFC edinimi ve ardından veri analizi sırasında, aşağıdaki geçit stratejisiyle devam edin:
      1. FSC-A (x ekseni) ve SSC-A (y ekseni) özelliklerine (kapı 1) göre ilgilenilen hücreleri tanımlayın. FSC-A (x ekseni) ve FSC-H'yi (y ekseni, kapı 2) çizerek hücre çiftlerini ve kümelerini analizden çıkarın.
      2. 450/50 nm emisyon bp filtresi (kapı 3) kullanarak CD45 negatifliği için kanser hücrelerini tespit edin. Son olarak, 610/620 nm bp emisyon filtresi kullanarak tek parametreli bir histogramda ortalama floresan yoğunluğu olarak PI dahil etmek için hücreleri analiz edin.
        NOT: Kanser hücresi ölümü, Annexin V-PI apoptoz testi yapılarak veya parçalanmış Kaspaz-3 ve -7'nin ekspresyon seviyeleri değerlendirilerek de analiz edilebilir.
    5. Veri analizi gerçekleştirin.
      NOT: İstatistiksel analizler Prism GraphPad Yazılımı v.8.4.0 kullanılarak yapılmıştır.

Sonuçlar

Çapraz sunum21,22 için özelleşmiş ve Şekil 2A'da gösterildiği gibi kapılı, yaygın olarak bilinen fagosit alt kümesi olan CD11c+ DC'lerin, daha önce PKH67 floresan hücre bağlayıcısı ile etiketlenmiş UV ışınlanmış MCA205 kanser hücrelerinden apoptotik cisimleri yutma yeteneği mFC tarafından değerlendirildi. Beklendiği gibi, CD11c + DC'ler, apoptotik MCA205 hücrelerini in vitro ola...

Tartışmalar

Antikanser immün yanıtının izlenmesi, TME'de rol oynayan ve üstünlük için sürekli bir savaşı destekleyen karmaşık moleküler ve hücresel etkileşimleri aydınlatmak ve anlamak için son derece önemlidir23. Burada, kanser-bağışıklık döngüsünü oluşturan adımların izlenmesi ve karakterizasyonu için basit bir mFC ve ToC destekli protokolü detaylandırıyoruz. Küçük varyasyonlarla, murin hücre hatlarına ve fare kaynaklı bağışıklık hücrelerine dayanan bu protokol...

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

A.S., AIRC (IG #28807) ve PRIN (#P2022YE2MX) tarafından desteklenmektedir. M.M., AIRC-FIRC bursu (#25558) tarafından desteklenmektedir. ADN, AB - Yeni Nesil AB, PNRR Misyon 4 Bileşen 2, Yatırım 1.5 tarafından finanse edilen İnovasyon Ekosistemi Roma Technopole tarafından desteklenmektedir ECS00000024.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubes Eppendorf30120086
100 kV e-beam litographyVistec
100 mm Petri dishes Greiner Bio One664160
12-well platesEuroclone ET3012
15 and 50 mL tubesCorning 352096; 352070
40 μm cell strainer Corning CLS431750
5 mL polystyrene tubes Greiner Bio-One120180
70 μm cell strainer Corning CLS431751
75 cm2 cell culture treated flaskEuroclone ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) AntibodyMiltenyi Biotec130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody Miltenyi Biotec130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) AntibodyBioLegend100206
AptesSigma Aldrich440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlugBD Biosciences555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)BD Biosciences555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)BD Biosciences554724
Bovine serum albumin (BSA)US Biological, SalemA1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)eBioscience12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)eBioscience17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)eBioscience25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)eBioscience11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)InvitrogenMCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)eBioscience48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)eBioscience53-0951-82
Cell counting slidesKova International87144E
Chromium quartz masksMB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay KitInvitrogenC10635
CytoFLEX Flow CytometerBeckman Coulter
Dead Cell Removal KitMiltenyi Biotec130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)EuroCloneECB4053L
EDTAInvitrogenAM9260G
Fetal bovine serum (FBS)EuroCloneECS0180L
Flowjo v10.0.7Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)eBioscience12-8898-82
H2O2Sigma Aldrich
H2SO4Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)Thermo Scientific
Ice machineBrema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)eBioscience11-7311-82
Illustrator CC 2015Adobe Systems Inc.
ImageJNational Institute of Health
Incucyte 2022A SoftwareSartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead CellsSartorius4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging MicroscopeBulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)Angelantoni
L-glutamine 200 mMEuroCloneECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitInvitrogenL10119
MACS columnsMiltenyi Biotec130-042-201; 130-042-401 
MACS separatorsMiltenyi Biotec130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell lineSigma-AldrichSCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R MicrocentrifugeThermo Scientific75002552
Microsoft Excel Microsoft, Redmond 
Mouse: C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouseMiltenyi Biotec130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BITNikon Instruments Inc.
Optical litographyEVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfateEuroCloneECB3001D/1
Pipet aidDrummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201
PipettesEppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker KitsSigma-AldrichPKH67GL-1KTfluorescent cell linker  kit
plastic coverslipIBIDI10812
Propidium IodideThermo ScientificP1304MP
Reactive Ion Etching systemOxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)EuroCloneECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)Corning- Millipore-Sigma; St. Louis,
MO		CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge SeriesThermo Scientific75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)EuroClone Spa, Milan, ItalyECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 seriesMicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punchesKai Medical, Tedpella
Sylgard 184Dowsil, Dow Corning101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)eBioscience12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS Sigma Aldrich92360
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol RedEuroCloneECM0920
Vacuum dessicator

Referanslar

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype. Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).
  3. Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure. Cells. 10 (9), 2361 (2021).
  4. Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. The three Es of cancer immunoediting. Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).
  5. Musella, M., et al. Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B. Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).
  6. Anderson, K. G., et al. Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies. J Immunother Cancer. 11 (6), e006533 (2023).
  7. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  8. Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry. Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).
  9. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Front Mol Biosci. 7, 612801 (2020).
  10. Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy. Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).
  11. Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge. Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).
  12. Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. 3D cancer models: One step closer to in vitro human studies. Front Immunol. 14, 1175503 (2023).
  13. De Ninno, A., et al. Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments. JoVE. (170), e61895 (2021).
  14. Mattei, F., et al. Oncoimmunology meets organs-on-chip. Front Mol Biosci. 8, 627454 (2021).
  15. Businaro, L., et al. Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment. Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).
  16. Vacchelli, E., et al. Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1. Science. 350 (6263), 972-978 (2015).
  17. Maulana, T. I., et al. Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy. Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).
  18. Lorenzi, S., et al. Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming. J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).
  19. Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies. Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).
  20. Lucarini, V., et al. Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma. J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).
  21. Gutiérrez-Martínez, E., et al. Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets. Front Immunol. 6, 363 (2015).
  22. Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  23. Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition. Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).
  24. Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI. Front Oncol. 13, 1172314 (2023).
  25. Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
  26. Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research. Clin Transl Med. 12 (1), 696 (2022).
  27. Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics. Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).
  28. Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. Current trends in flow cytometry automated data analysis software. Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).
  29. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Ko k lt rn VitroKanser ba kl k d ng sMultiparametrik Flow Sitometriip zerinde t m rMikroak kan Cihazlarmm ns rveyansmm n EvazyonKanser Ara t rmalarmm n H crelerTerap tik Ki iselle tirme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır