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体外共培养系统以重现癌症免疫循环
摘要
在这里，我们详细介绍了一种简单、快速且可靠的多参数流式细胞术和肿瘤芯片辅助方案，用于监测和表征构成癌症免疫周期的步骤。事实上，对癌症和免疫细胞之间相互作用的透彻理解为智胜肿瘤和指导临床护理提供了关键见解。
摘要
基础癌症研究和有效反击疗法的开发都依赖于详细说明癌症和免疫细胞之间相互作用的实验研究，即所谓的癌症免疫循环。 体外 共培养系统与多参数流式细胞术 （mFC） 和肿瘤芯片微流控装置 （ToC） 相结合，能够简单、快速、可靠地监测和表征癌症免疫周期的每个步骤，并导致确定导致癌症免疫监视和免疫逃避之间平衡的机制。对癌症和免疫细胞之间动态相互作用的透彻理解为智取肿瘤提供了关键见解，并将加快患者治疗个性化和优化的步伐。具体来说，这里我们详细介绍了一个简单的 mFC 和 ToC 辅助方案，用于揭示小鼠癌细胞系和小鼠衍生免疫细胞中癌症免疫周期每个步骤的动态复杂性，并专注于免疫监视。考虑到该协议的时间和成本相关特征，大规模肯定是可行的。此外，尽管有微小的变化，该方案既可以适应人类癌细胞系和人类外周血来源的免疫细胞，也可以与特定途径的遗传和/或药物抑制相结合，以识别免疫反应的生物标志物。
引言
在过去的几十年里，免疫疗法一直处于癌症治疗前沿选择的最前沿。利用免疫系统进行抗肿瘤治疗为历史上预后不佳的各种血液系统和实体恶性肿瘤的患者受益提供了强大的概念验证。由于免疫疗法为原本难以治疗的癌症提供了机会，因此它正在经历惊人的快速发展。这种进步至少部分归因于对癌细胞和免疫细胞之间相互作用的精细理解。这种相互作用类似于免疫系统点燃以摧毁癌细胞的前馈“引擎”，即所谓的癌症免疫循环。这种抗癌免疫反应贯穿三个主要水平：识别、加工和反应。首先，在识别阶段，肿瘤形成过程中产生的肿瘤抗原 （Ag） 由肿瘤微环境中垂死的癌细胞释放（TME，第 1 步），并被肿瘤浸润的树突状细胞吞噬（DC，第 2 步）。接下来，在加工阶段，DC 通过主要组织相容性复合物 （MHC） 分子呈递捕获的肿瘤 Ag 的表位，在其表面表达更高水平的共刺激分子（步骤 3），并移动到肿瘤引流淋巴结 （dLN） 以将其货物交叉呈递给幼稚的 CD8 T 细胞（CD8N，步骤 4）。所有这些步骤在最后的反应过程中汇聚在一起，在此期间，肿瘤抗原特异叉引发的 CD8 T 细胞 （CD8C-P） 被激活，成熟为效应 CD8 T （CD8E） 细胞，并经历克隆扩增（第 5 步）。然后，CD8E 细胞离开 dLN 并通过血液到达 TME（第 6 步），在那里它们通过其 T 细胞受体 （TCR） 与其同源肿瘤 Ag 之间的相互作用特异性识别癌细胞并结合癌细胞，释放细胞毒性分子 [即干扰素 （....
研究方案
要求使用动物的方案的所有步骤均符合欧盟指令 63/2010，并包含在机构动物实验委员会和意大利卫生部批准的实验方案（批准号 858/2015/PR）中。
1. 癌细胞的制备
- 癌细胞培养程序（第 -7 天;持续时间：2 小时）
- 在补充有 10% （v/v） 胎牛血清 （FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU/mL 青霉素 G 钠盐、100 μg/mL 硫酸链霉素和 50 μg/mL 潮霉素（完全生长培养基）的加湿细胞培养箱中，在标准培养条件（37°C， 5% CO2）。
注：根据所选的细胞系调整培养条件。在解冻的情况下，细胞需要 ~1 周的恢复时间来适应最佳培养条件并重新建立正常的细胞周期。 - 为了优化细胞培养生长，将细胞以 1 x 10 6 个细胞/mL 的密度接种在 12-15 mL 完全生长培养基中，以 1 x 106 个细胞/mL 的密度接种。
注：不同细胞系的接种细胞数量可能不同，通常取决于特定的细胞大小和倍增时间。细胞汇合会显著影响细胞的状态。如果细胞汇合度少或太汇合，就会发生代谢扰动，并有利于增殖停滞、克隆选择或细胞应激。对于 MCA205 细胞，需要以 1：10-1：20 的分流比每周进行两次传代。 - 当细胞培养物达到 75%-80% 的最大汇合度时，从细胞单层中丢弃完整....
- 在补充有 10% （v/v） 胎牛血清 （FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU/mL 青霉素 G 钠盐、100 μg/mL 硫酸链霉素和 50 μg/mL 潮霉素（完全生长培养基）的加湿细胞培养箱中，在标准培养条件（37°C， 5% CO2）。
代表性结果
CD11c+ DC 是广为人知的吞噬细胞亚群，专门用于交叉呈递 21,22 并如图 2A 所示进行门控，以吞噬紫外线照射的 MCA205 癌细胞的凋亡体的能力，这些癌细胞先前用 PKH67 荧光细胞接头标记通过 mFC 进行评估。正如预期的那样，CD11c + DC 在 37 °C 而不是 4 °C 下在体外有效捕获凋亡 MCA205 细胞（图 2B
讨论
监测抗癌免疫反应对于阐明和理解在 TME 中起作用并支持持续争夺霸权的复杂分子和细胞相互作用至关重要23。在这里，我们详细介绍了一个简单的 mFC 和 ToC 辅助方案，用于监测和表征构成癌症免疫循环的步骤。该方案基于小鼠细胞系和小鼠来源的免疫细胞，具有微小的变化，可以适应人类永生化甚至原发性癌症系和人类外周血衍生的免疫细胞。此外，结合特定途径的遗传或药?.......
披露声明
作者没有需要披露的利益冲突。
致谢
A.S. 由 AIRC （IG #28807） 和 PRIN （#P2022YE2MX） 提供支持。M.M. 得到了 AIRC-FIRC 奖学金 （#25558） 的支持。ADN 得到了由欧盟资助的创新生态系统罗马科技城ECS00000024的支持 - 下一代欧盟，PNRR 任务 4 第 2 部分投资 1.5。
....材料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorf | 30120086 | |
| 100 kV e-beam litography | Vistec | ||
| 100 mm Petri dishes | Greiner Bio One | 664160 | |
| 12-well plates | Euroclone | ET3012 | |
| 15 and 50 mL tubes | Corning | 352096; 352070 | |
| 40 μm cell strainer | Corning | CLS431750 | |
| 5 mL polystyrene tubes | Greiner Bio-One | 120180 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| 75 cm2 cell culture treated flask | Euroclone | ET7076 | |
| Adsorbent wipes | |||
| Allumin foil | |||
| anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-319 | |
| anti-mouse CD25 (7D4) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-118-678 | |
| anti-mouse CD3 (17A2) Antibody | BioLegend | 100206 | |
| Aptes | Sigma Aldrich | 440140 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
| BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological, Salem | A1312 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418) | eBioscience | 12-0114-81 | |
| CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5) | eBioscience | 17-1371-82 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (17A2) | eBioscience | 25-0032-82 | |
| CD44 Monoclonal Antibody (IM7) | eBioscience | 11-0441-82 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | MCD4528 | |
| CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3) | eBioscience | 48-0691-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 11-0081-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7) | eBioscience | 53-0951-82 | |
| Cell counting slides | Kova International | 87144E | |
| Chromium quartz masks | MB W&A, Germany | ||
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10635 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | EuroClone | ECB4053L | |
| EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| Fetal bovine serum (FBS) | EuroClone | ECS0180L | |
| Flowjo v10.0.7 | Flowjo, LLC | ||
| Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB) | eBioscience | 12-8898-82 | |
| H2O2 | Sigma Aldrich | ||
| H2SO4 | Sigma Aldrich | ||
| hotplate | |||
| Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2) | Thermo Scientific | ||
| Ice machine | Brema Ice Makers | ||
| IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2) | eBioscience | 11-7311-82 | |
| Illustrator CC 2015 | Adobe Systems Inc. | ||
| ImageJ | National Institute of Health | ||
| Incucyte 2022A Software | Sartorius | ||
| Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells | Sartorius | 4632 | |
| Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System | Sartorius | ||
| JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope | Bulldog Bio | ||
| Laboratory bench | |||
| Laboratory refrigerator (4°C) | |||
| Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Angelantoni | ||
| L-glutamine 200 mM | EuroClone | ECB3004D | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34957 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L10119 | |
| MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201; 130-042-401 | |
| MACS separators | Miltenyi Biotec | 130-042-10; 130-042-302 | |
| MCA205 mouse fibrosarcoma cell line | Sigma-Aldrich | SCC173 | |
| Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine | |||
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002552 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Redmond | ||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-096-543 | |
| Nikon ECLIPSE Ts2 | Nikon Instruments Inc. | ||
| NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT | Nikon Instruments Inc. | ||
| Optical litography | EVG | ||
| Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate | EuroClone | ECB3001D/1 | |
| Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | |
| Pipettes | Eppendorf | ||
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | PKH67GL-1KT | fluorescent cell linker kit |
| plastic coverslip | IBIDI | 10812 | |
| Propidium Iodide | Thermo Scientific | P1304MP | |
| Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab | ||
| Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | EuroClone | ECB9006L | |
| serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489 | |
| SL 16 Centrifuge Series | Thermo Scientific | 75004031 | |
| Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers | |||
| Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | |
| SU-8 3000 series | MicroChem corp, Newton, (MA) | ||
| Suite of dermal biopsy punches | Kai Medical, Tedpella | ||
| Sylgard 184 | Dowsil, Dow Corning | 101697 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597) | eBioscience | 12-5961-82 | |
| Thermostatic bath | |||
| Timer | |||
| TMCS | Sigma Aldrich | 92360 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA w/ Phenol Red | EuroClone | ECM0920 | |
| Vacuum dessicator |
参考文献
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.
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