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摘要

在这里，我们详细介绍了一种简单、快速且可靠的多参数流式细胞术和肿瘤芯片辅助方案，用于监测和表征构成癌症免疫周期的步骤。事实上，对癌症和免疫细胞之间相互作用的透彻理解为智胜肿瘤和指导临床护理提供了关键见解。

摘要

基础癌症研究和有效反击疗法的开发都依赖于详细说明癌症和免疫细胞之间相互作用的实验研究，即所谓的癌症免疫循环。 体外 共培养系统与多参数流式细胞术 （mFC） 和肿瘤芯片微流控装置 （ToC） 相结合，能够简单、快速、可靠地监测和表征癌症免疫周期的每个步骤，并导致确定导致癌症免疫监视和免疫逃避之间平衡的机制。对癌症和免疫细胞之间动态相互作用的透彻理解为智取肿瘤提供了关键见解，并将加快患者治疗个性化和优化的步伐。具体来说，这里我们详细介绍了一个简单的 mFC 和 ToC 辅助方案，用于揭示小鼠癌细胞系和小鼠衍生免疫细胞中癌症免疫周期每个步骤的动态复杂性，并专注于免疫监视。考虑到该协议的时间和成本相关特征，大规模肯定是可行的。此外，尽管有微小的变化，该方案既可以适应人类癌细胞系和人类外周血来源的免疫细胞，也可以与特定途径的遗传和/或药物抑制相结合，以识别免疫反应的生物标志物。

引言

在过去的几十年里，免疫疗法一直处于癌症治疗前沿选择的最前沿。利用免疫系统进行抗肿瘤治疗为历史上预后不佳的各种血液系统和实体恶性肿瘤的患者受益提供了强大的概念验证。由于免疫疗法为原本难以治疗的癌症提供了机会，因此它正在经历惊人的快速发展。这种进步至少部分归因于对癌细胞和免疫细胞之间相互作用的精细理解。这种相互作用类似于免疫系统点燃以摧毁癌细胞的前馈“引擎”，即所谓的癌症免疫循环。这种抗癌免疫反应贯穿三个主要水平：识别、加工和反应。首先，在识别阶段，肿瘤形成过程中产生的肿瘤抗原 （Ag） 由肿瘤微环境中垂死的癌细胞释放（TME，第 1 步），并被肿瘤浸润的树突状细胞吞噬（DC，第 2 步）。接下来，在加工阶段，DC 通过主要组织相容性复合物 （MHC） 分子呈递捕获的肿瘤 Ag 的表位，在其表面表达更高水平的共刺激分子（步骤 3），并移动到肿瘤引流淋巴结 （dLN） 以将其货物交叉呈递给幼稚的 CD8 T 细胞（CD8N，步骤 4）。所有这些步骤在最后的反应过程中汇聚在一起，在此期间，肿瘤抗原特异叉引发的 CD8 T 细胞 （CD8C-P） 被激活，成熟为效应 CD8 T （CD8E） 细胞，并经历克隆扩增（第 5 步）。然后，CD8E 细胞离开 dLN 并通过血液到达 TME（第 6 步），在那里它们通过其 T 细胞受体 （TCR） 与其同源肿瘤 Ag 之间的相互作用特异性识别癌细胞并结合癌细胞，释放细胞毒性分子 [即干扰素 （IFN）-γ、穿孔素和颗粒酶 （Grzs）] 并杀死癌细胞（第 7 步）1，2.癌细胞杀伤导致进一步的肿瘤 Ags 释放，以推动癌症免疫循环。事实上，通过所有这些步骤，免疫系统破坏和排斥癌细胞的频率远比想象的要高。然而，在癌症患者中，这些步骤中至少有一个不能正常工作。我们和其他人表明，癌细胞通过进化成更具侵袭性和免疫特权的变体 3,4,5 或阻碍 T 细胞的有效性 6,7 来阻止免疫反应。

癌症研究和癌症药物开发都依赖于允许研究癌症与免疫细胞之间关系的实验模型，即所谓的肿瘤免疫学。以下是描述的快速、可靠、可重复和低成本的 体外 模型，这些模型全面再现了肿瘤免疫学周期的每个步骤，并提供了免疫监测和最终免疫编辑的表型和功能特征集的快速清晰视图。

多参数流式细胞术 （mFC） 是癌症临床试验中基础癌症研究、诊断和转化研究中最成功的单细胞分析工具之一。由于它允许同时捕获每个细胞中的更多特征，因此 mFC 已成为肿瘤免疫学的金标准分析平台。它结合了高灵敏度和特异性，并且可以在单个细胞水平上快速、可重复地测量异质甚至异型细胞悬液中的多种蛋白质表达模式和功能特性，如来自 TME的细胞 8,9,10。由于表型和功能表达模式都对时间敏感，因此仔细注意实验设计、选择合适的检测组合、对照和滴定抗体，以及适当的样品处理和仪器使用，对于结果的可靠性、可比性和可重复性以及自信地解释实验结果至关重要11。

肿瘤芯片微流控器件 （ToC） 通过允许癌症和免疫细胞动力学的体外微尺度仿生学和相互作用来模拟 TME 12,13,14,15。具体来说，ToC 是多通道微流控细胞培养装置，能够承载在二维 （2D） 或三维 （3D） 培养环境中组织的不同细胞类型，并且能够高保真建模并高精度控制关键结构和功能单元，例如异型细胞相互作用和生理上发生的化学梯度流TME 12， 13,14,15。特别是，免疫化疗吸引和轨迹以及免疫细胞与癌细胞的相互作用，可以通过延时显微镜和自动跟踪分析进行实时监测和量化 5,12,13,14,15,16。此外，ToC 提供了分析和操纵调节癌症发生和进展以及对治疗反应的关键过程的可能性17。

在本文中，将 mFC 与 ToC 相结合，以研究通过 DC 介导的癌症吞噬作用（步骤 1-3）、T 细胞交叉引发（步骤 4）、激活和克隆扩增（最后通过 5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶 （EdU） 和 Cu（I） 催化的环加成反应 [click] 技术，一种高度敏感和准确的方法， 第 5 步），CD8E 细胞归巢到 TME（第 6 步），最后 CD8E 细胞介导的癌细胞杀伤（第 7 步， 图 1）。

这项工作有助于建立简单、快速和可靠的标准方案来研究癌症免疫周期。mFC 和 ToC 模型的改进和整合到癌症研究、TME 动力学和对治疗的反应中具有巨大的潜力，因为这些模型提供了生物保真度以及实验控制。因此，该协议通过表征、监测和及时操纵单个细胞参与者的作用及其在自然和获得性免疫监视下的相互相互作用，有助于逐步重建癌症免疫循环。这最终将有助于改进、减少和取代动物研究，同时为智取肿瘤和指导临床护理提供关键见解。最后，批判性地讨论了 mFC 和 ToC 的优势和局限性，并与最先进的技术（例如，单细胞甚至亚细胞分辨率的重空间分析）进行了比较，以推动肿瘤免疫学研究和治疗向前发展。

研究方案

要求使用动物的方案的所有步骤均符合欧盟指令 63/2010，并包含在机构动物实验委员会和意大利卫生部批准的实验方案（批准号 858/2015/PR）中。

1. 癌细胞的制备

  1. 癌细胞培养程序（第 -7 天;持续时间：2 小时）
    1. 在补充有 10% （v/v） 胎牛血清 （FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU/mL 青霉素 G 钠盐、100 μg/mL 硫酸链霉素和 50 μg/mL 潮霉素（完全生长培养基）的加湿细胞培养箱中，在标准培养条件（37°C， 5% CO2）。
      注：根据所选的细胞系调整培养条件。在解冻的情况下，细胞需要 ~1 周的恢复时间来适应最佳培养条件并重新建立正常的细胞周期。
    2. 为了优化细胞培养生长，将细胞以 1 x 10 6 个细胞/mL 的密度接种在 12-15 mL 完全生长培养基中，以 1 x 106 个细胞/mL 的密度接种。
      注：不同细胞系的接种细胞数量可能不同，通常取决于特定的细胞大小和倍增时间。细胞汇合会显著影响细胞的状态。如果细胞汇合度少或太汇合，就会发生代谢扰动，并有利于增殖停滞、克隆选择或细胞应激。对于 MCA205 细胞，需要以 1：10-1：20 的分流比每周进行两次传代。
    3. 当细胞培养物达到 75%-80% 的最大汇合度时，从细胞单层中丢弃完整的生长培养基，用预热的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞以去除 FBS，然后加入 1.5 mL 预热的 0.25% 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸 （EDTA） 在 37 °C 下 1-2 分钟以分离细胞。
      注：FBS 含有蛋白酶抑制剂，可能会使胰蛋白酶酶活性失活，因此将其完全去除是关键步骤。胰蛋白酶孵育时间因细胞类型而异。作为一般准则，避免长期孵育胰蛋白酶浓度高的细胞，因为它可能会使细胞表面蛋白条纹化并引发细胞死亡。在此步骤中，用光学显微镜检查细胞分离状态。
    4. 将分离的细胞收集在 10 mL 预热的完全生长培养基中以灭活胰蛋白酶酶活性，并在室温 （RT） 下以 1100 × g 离心 5 分钟。使用台盼蓝染料排除试验对细胞计数玻片中的细胞进行计数，然后在稀释后将其重新接种到适当的支持物中，用于维持培养（解冻后不超过 8 次传代）或用于下游实验程序，如下所述。
  2. 癌细胞死亡 - 癌细胞 Ags 的释放（第 0 天;持续时间：30 分钟）
    1. 对于下游功能实验，在 10 mL 完全生长培养基中，将 3 ×6 个 MCA205 细胞接种在 100 mm 组织培养处理的培养皿中。
      注：对于特定的实验应用（例如，DC 介导的肿瘤 Ag 摄取分析），在诱导细胞死亡之前，已按照制造商的说明使用荧光细胞接头（材料表）标记癌细胞。
    2. 用紫外线 （UV）光 18 （ƛ = 254 nm） 在 9 cm 距离处照射细胞 3 分钟，然后在 37 °C、5% CO2 下孵育至少 6 小时，让它们死亡。
      注意：化疗（例如，免疫原性或非免疫原性药物5）也可诱导癌细胞死亡。

2. 癌细胞和免疫细胞的共培养

  1. DC 介导的癌症 Ag 摄取和呈递（第 0 天;时间：1 小时台式时间，24 小时孵育时间）
    1. 4-6 小时后，如前所述8 收集从免疫功能正常小鼠的骨髓 （BM） 细胞体外分化的 DC，并在完全生长培养基中以 1100 x g 的 RT 洗涤两次，每次 5 分钟。
      注：如之前报道的，可以通过在基于 Histodenz 的梯度上离心从小鼠脾细胞中分离DC：19。作为一种很好的做法，如果使用冻存的 DC，请确保预热完整的生长培养基并补充 1：1000 的苯并酶，以防止细胞结块，从而确保在解冻时具有良好的回收率。
    2. 从步骤 1.2.2 中收集紫外线照射的癌细胞，并在室温下以 1100 x g 离心它们 5 分钟。如上所述计数 BM 衍生的“空”DC（DC N）（参见步骤 1.1.4），然后将与紫外线照射的凋亡细胞以 2：1 的比例（5 × 1010 5 个凋亡 MCA205 细胞，用于 2.5 × 105 个 DC，如前所述8）在 12 孔板中，在 1 mL 新鲜完全生长培养基中，在 37° 下放置 24 小时C，5% CO2。作为实验对照，在 4 °C 下孵育细胞，在这种情况下吞噬作用受到阻碍。
      注意：不要增加共培养表面和体积，因为这可能会阻碍凋亡癌细胞-DC 相互作用，从而阻碍最佳和有效的吞噬作用。此外，如果使用其他癌细胞模型，则需要进行优化癌细胞：DC 比率的研究。
  2. 通过 mFC 评估癌症抗原摄取（第 1 天;持续时间：2 小时）
    1. 孵育 24 小时后，将细胞收集在 15 mL 试管中，并在 10 mL 完全生长培养基中以 1100 x g 的 RT 在 10 mL 完全生长培养基中以 1100 x g 的速度洗涤两次，每次 5 分钟。
      注意：为了降低粘附在 DC 膜上且尚未完全吞噬的凋亡细胞的背景噪音，将细胞沉淀在 RT 和 0.1 M EDTA 中孵育 5 分钟。然后，如步骤 2.2.1 所示，将细胞悬液（包含约 2 x 106 个细胞）与 10 mL 生长培养基离心两次。
    2. 对于细胞表面染色，将 BM 衍生的 DC 重悬于 20 μL 冷荧光激活细胞分选 （FACS） 缓冲液（1% FBS，0.1 M EDTA 的 PBS 溶液）中，该缓冲液含有 0.5 μg IgG 同种型对照或抗小鼠藻红蛋白 （PE） 偶联的 CD11c，在 96 孔 U 形底部组织培养物处理的微孔板中，并在 4 °C 下在黑暗中孵育 20 分钟，以保留荧光染料信号并避免光漂白。
      注意：一旦发生癌症抗原摄取，也可以通过检查共刺激分子（即 CD80 或 CD86 和 MHC-II 以及免疫检查点配体 CD274 抗原 [最广为人知的是 PDL1]）的表达水平来验证“完全”DC （DCPHAGO） 激活。作为一般规则，为了获得最佳的流式细胞仪性能，需要仔细滴定抗体浓度，细胞数量需要在 1 x 105 至 1 x 108 个细胞/测试之间。
    3. 此后，在 FACS 缓冲液中洗涤细胞两次，并在室温下加入 100 μL 含有终浓度为 1 μM 的活力可固定近红外 （IR） 染料的 PBS 溶液 30 分钟。
      注：作为替代方案，可以使用其他与用过的荧光发射不重叠的活力可固定染料（例如，紫色、蓝色、橙色、青柠色、浅绿色）。
    4. 在 PBS 中洗涤细胞一次，并在通过 mFC 对 CD11c 和 PKH67 水平进行流式细胞术分析之前，将其重悬于 FACS 缓冲液中。在 mFC 采集期间，然后在数据分析期间，继续执行以下门控策略：
      1. 根据其前向散射区域（FSC-A，x 轴）和侧向散射区域（SSC-A，y 轴）属性（门 1）识别感兴趣的细胞。通过绘制 FSC-A （x 轴） 和前向散射高度 （FSC-H，y 轴，门 2） 从分析中排除细胞双峰和团块。
      2. 通过绘制 780/60 nm 发射带通 （bp） 滤光片面积（x 轴）和 SSC-A（y 轴，门 3）去除死细胞。最后，基于门 3，分别使用 575/26 nm 和 530/30 nm 发射 bp 滤光片在双参数密度图中检测 CD11c 标志物和 PKH67 荧光细胞接头的细胞阳性。
    5. 执行数据分析。
      注：请务必混合抗体，以保证使用分离良好的发射波长进行简单有效的标记。这简化了所用荧光基团的补偿设置，并允许简单、快速和可靠地定量目标参数。
  3. CD8 T 细胞启动和激活（第 1 天;持续时间：1 小时台式时间，72-96 小时孵育时间）
    1. 如前所述纯化小鼠脾 CD8 T 细胞 （CD8N）8。
    2. 在 500 μL 新鲜完全生长培养基中计数并重悬分离的 CD8 T 细胞，并与先前以 2.5：1 的比例（1 × 10 个5 T 细胞的 2.5 ×10 个 5 个 DC 培养，如前所述8）在 12 孔板中培养 72 小时，最终体积为 1.5 mL，37 °C， 5%二氧化碳。
      注：为了强调实验结果，已经测试了不同的细胞培养比例，并选择了最佳比例。
  4. 通过 EdU mFC 测定进行 CD8 T 细胞增殖分析（第 4 天;持续时间：15 分钟的工作台时间，16-20 小时的孵育）
    1. 将胸苷 EdU 的核苷类似物以 10 μM 的终浓度添加到共培养基中并充分混合。
      注：由于培养条件、细胞类型变化和细胞密度可能会影响 EdU 掺入 DNA 中，因此请在中试实验中测试一系列 EdU 浓度和孵育时间。较长或较短的孵育可能分别需要较低或较高的浓度。包括来自同一群体但未用 EdU 处理的细胞作为阴性染色对照。
    2. 16-20 小时后，恢复并在室温下以 1100 x g 的速度离心 CD8C-P 两次，持续 5 分钟。
    3. 在 20 μL 补充有 0.5 μg 抗小鼠异硫氰酸荧光素 （FITC） 缀合的 CD8a 和 0.25 μg 抗小鼠 PE 缀合的 CD3 的冷 FACS 缓冲液中对细胞表面标志物进行染色，或在 96 孔 U 形底部 TC 处理的微孔板中用相应的 IgG 同种型对照染色，并在 4 °C 下在黑暗中孵育 20 分钟。
      注：为避免任何干扰，建议在进行点击反应之前不要使用 Qdot 抗体偶联物。
    4. 在 FACS 缓冲液中洗涤细胞两次（如步骤 2.2.3 所示），并在室温下将细胞沉淀重悬于 100 μL 含有终浓度为 1 μM 的活力可固定 Aqua 染料的 PBS 溶液中 30 分钟。
      1. 将细胞悬液转移到流管中，用 3 mL 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 的 PBS 溶液洗涤一次，然后在室温下用 100 μL 固定剂（即 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液）进行细胞固定 15 分钟，避光。
      2. 紧接着，用 3 mL 的 1% BSA 的 PBS 溶液洗涤细胞一次，将它们在 100 μL 含有 1x 皂苷基透化和洗涤试剂的溶液中在 RT 下孵育 15 分钟，然后直接进行标记反应。
        注：通过用 1% BSA 的 PBS 溶液以 1：10 的比例稀释体积的 10x 溶液来制备 1x 皂苷基透化和洗涤试剂。该试剂也可用于含有全血或红细胞的细胞悬液，因为它在裂解红细胞的同时保留了白细胞的形态光散射特性。
      3. 根据要分析的样品数量，通过轻轻地按顺序混合指定体积的 PBS、铜保护剂催化剂、Alexa Fluor （AF） 647 偶联吡啶甲基叠氮化物和 1x EdU 缓冲液添加剂来制备反应混合物。
        1. 在制备后 15 分钟内使用反应混合物。向每个试管中加入 500 μL 反应混合物，充分混合，并在室温下避光孵育 30 分钟。
      4. 用 3 mL 基于 1x 皂苷的透化和洗涤试剂洗涤细胞一次，然后将它们重悬于 100 μL 相同溶液中，然后继续进行标准 mFC 方法，通过 mFC 测定细胞群中 S 期增殖 CD8CP 的百分比。在 mFC 采集期间，然后在数据分析期间，继续执行以下门控策略：
        1. 根据其 FSC-A（x 轴）和 SSC-A（y 轴）属性（门 1）识别感兴趣的细胞。通过绘制 FSC-A （x 轴） 和 FSC-H （y 轴，门 2） 从分析中排除细胞双峰和团块。通过绘制 525/50 nm 发射 bp 滤光片面积（x 轴）和 SSC-A（y 轴，门 3）去除死细胞。
        2. 分别使用 530/30 nm 和 575/26 nm 发射 bp 滤光片（门 4）在双参数密度图中检测 CD8a 和 CD3 的细胞阳性。最后，基于门 4，使用 660/620 nm bp 发射滤光片进一步分析细胞中 AF647-EdU 掺入作为单参数直方图中的平均荧光强度。
          注：在采集过程中，最好使用低流速检测 EdU 标记产生的荧光信号。
      5. 执行数据分析。

3. 癌细胞对 CD8C-P 的再刺激

  1. CD8C-P 识别活癌细胞（第 4 天;持续时间：1 小时台式时间，孵育 48-72 小时）
    1. 从共培养中回收 CD8C-P （参见步骤 2.3.2），并在 10 mL 完全生长培养基中以 RT 下以 1100 x g 的速度离心 10 分钟。
      注：在此步骤中，通过检查激活标志物 CD95 的表达水平来验证 CD8 T 细胞分化。
    2. 将细胞沉淀重悬于每 1 x 107 个细胞中含有约 2.5 × 106 个细胞的死细胞去除微珠中。
      注：对于更高的细胞数量，请相应地按比例增加试剂和总体积。
    3. 充分混合并在 RT 下孵育 15 分钟。
      注：如有必要， 根据 制造商的说明，通过添加 1x 结合缓冲液来调整样品体积，以达到磁性分离所需的最低 500 μL。
    4. 紧接着，进行后续的磁性细胞分离。将分离柱置于合适分离器的磁场中，并用适量的 1x 结合缓冲液冲洗。将细胞悬液转移到分离柱中，并收集含有未标记活细胞组分的流出液。
    5. 用适量的 1x 结合缓冲液再次洗涤色谱柱。收集通过的未标记细胞，并将它们与步骤 3.1.4 中的流出物混合。
      注：为了提高死细胞的磁性去除效率，可以使用新色谱柱在步骤 3.1.1-3.1.5 中所述的第二次分离程序中富集活细胞组分。
    6. 在细胞计数前，在完全生长培养基中以 1100 x g 的速率在 RT 下将富集的活 CD8C-P 离心 5 分钟，然后以 2：1 的比例与新鲜的 MCA205 细胞（1 x 10个 CD8 T 细胞用于 5 x 104 个 MCA205 细胞，如前所述8）在 12 个孔板中培养它们，最终体积为 1 mL。细胞接种后，将共培养板放入加湿的细胞培养箱或活细胞分析系统中，在 37 °C、5% CO2 下放置 72 小时，然后进行下游测定。
  2. 在 ToC 微流控模型中，CD8 T 细胞向癌细胞运输（第 5 天;持续时间：2 小时台式时间，孵育 72 小时）
    1. 在 UV 柜下对临时制造的 ToC 微流体装置13,20 消毒 20 分钟，用 PBS 洗涤两次，然后与完全生长培养基孵育至少 1 小时。
      注意：MCA205 细胞和 CD8CP 在本方案中未染色;然而，两者都可以用荧光活兼容的细胞示踪剂进行标记。
    2. 在 15 μL 完全生长培养基中轻轻重悬 1 ×10 个 5 个 MCA205 细胞，小心获得均匀的细胞分布，然后如前所述将它们缓慢注射到左侧芯片室（肿瘤室）中。等待 5-10 分钟，让癌细胞粘附在芯片基底上。
      1. 在显微镜下检查微流控芯片中癌细胞的正确和均匀分布。气泡的存在会影响实验结果。
    3. 将 1 x 106 CD8C-P 重悬于 50 μL 完全生长培养基中。轻轻地将免疫细胞悬液移入右侧芯片室（免疫室）。
      注：在此步骤中，使用显微镜确认免疫细胞分布到中间室中，形成一个“前部”，代表实验的起点。
    4. 为避免压力和微流体波动，如前所述13 小心地用高达 150 μL 的完全生长培养基填充所有芯片储液器，并将组装好的芯片放在 37 °C、5% CO2 的湿化细胞培养箱中的水平表面上至少 1 小时，以在延时记录之前稳定系统。
      注：仔细检查每个芯片室的两个储液槽中体积的潜在蒸发损失，并通过每 2 至 3 天添加新鲜培养基来补偿它们。如有必要，可以从每个细胞区室中吸出多达 100 μL 的上清液以进行细胞因子分析。
    5. 使用配备有孵育系统的视频显微镜装置，分别记录包含 MCA205 和免疫细胞的左右设备区域之间的微通道阵列的明场图像序列，并可视化免疫细胞浸润和免疫细胞-癌细胞相互作用的动力学。
      注意：在此处使用的实验设置中，用显微镜收集细胞的延时记录 72 小时，显微镜每 2 分钟获取一张显微照片。优化成像条件以避免过度的光曝光并获得高采集帧速率，以便轻松执行下游免疫细胞示踪分析。在延时结束时，执行半自动跟踪分析13,20。
  3. CD8E 活化和肿瘤反应性流式细胞术评估（第 7 天和第 8 天;持续时间： 2 小时）
    1. 孵育 48 和 72 小时后（参见步骤 3.1.6），回收 CD8E 并在室温下以 1100 x g 离心两次，每次 5 分钟。
      注：为了评估 CD8E （即 IFN-γ 和 Grz-B）产生的细胞毒性分子的细胞内水平，癌症免疫细胞共培养物已预先与 1：1000 布雷菲德菌素 A 和 1：1500 莫能菌素孵育至少 6 小时。
    2. 对于细胞表面染色，将细胞重悬于 20 μL 在冷 FACS 缓冲液中制备的三种不同的一抗混合物中，如 补充表 1 所示。
      注：为确保抗体结合的特异性，请在适当的 IgG 同种型对照存在下进行 mFC 实验，如步骤 2.2.2 所示。
    3. 将细胞在 96 孔 U 形底部组织培养物处理的微孔板中于 4 °C 避光孵育 20 分钟。对于来自混合物 A 和 B 的细胞沉淀（补充表 1），直接进行步骤 3.3.5。
    4. 快速洗涤后，向混合物 C 中的细胞沉淀中加入 100 μL 固定/透化溶液（补充表 1）。在 4°C 下避光孵育 20 分钟后，在 200 μL 冷透化/洗涤缓冲液中洗涤细胞两次，然后将它们重悬于 20 μL 冷透化/洗涤缓冲液中，其中含有 0.25 μg 抗小鼠 FITC 偶联的 IFN-γ 和 0.125 μg 抗小鼠 PE 偶联的 Grz-B 或相应的 IgG 同种型。将细胞在 4°C 下避光孵育 30 分钟。
    5. 此后，在 FACS 缓冲液中洗涤细胞两次，并向细胞沉淀中加入 100 μL 含有终浓度为 1 μM 的活力可固定 Aqua 染料的 PBS 溶液，在 RT 下持续 30 分钟（如步骤 2.2.4 所示）。
    6. 在 PBS 中洗涤细胞一次，并在通过 mFC 对 CD8 T 细胞活化进行流式细胞术分析之前，将其重悬于 FACS 缓冲液中。在 mFC 采集期间，然后在数据分析期间，继续执行以下门控策略：
      1. 根据其 FSC-A（x 轴）和 SSC-A（y 轴）属性（门 1）识别感兴趣的细胞。通过绘制 FSC-A （x 轴） 和 FSC-H （y 轴，门 2） 从分析中排除细胞双峰和团块。通过绘制 525/50 nm 发射 bp 滤光片面积（x 轴）和 SSC-A（y 轴，门 3）去除死细胞。
      2. 使用 660/20 nm 和 780/60 nm 或 530/30 nm 和 575/26 nm 发射 bp 滤光片（门 4）在双参数密度图中检测 CD8a 和 CD3 的细胞阳性。最后，基于门 4，进一步分析双参数密度图中的 CD44（530/30 nm 发射 bp 滤光片）、CD25（575/26 nm 发射 bp 滤光片）和 CD69（450/50 nm 发射 bp 滤光片）标记的细胞，用于 CD137 标记物（660/20 nm 发射 bp 滤光片），以及混合物 A 的 IFN-γ（530/30 nm 发射 bp 滤光片）和 Grz-B（575/26 nm 发射 bp 滤光片）， B 和 C（补充表 1）。
        注：CD8E 细胞肿瘤反应性可以通过 通过临时 脱颗粒测定评估 CD107a 溶酶体相关蛋白的表面表达来进一步测试。
    7. 执行数据分析。
  4. 通过活细胞分析系统和 mFC 进行 CD8E 细胞介导的肿瘤杀伤研究（第 8 天;持续时间：1 小时台式时间，孵育 72 小时）
    1. 对于通过活细胞分析系统进行的肿瘤杀伤测定，用终浓度为 250 nM 的实时细胞死亡定量染料补充共培养基（参见步骤 3.1.6）。
    2. 将共培养板放入活细胞分析系统中后，在扫描前让板升温至 37 °C 30 分钟。每 2 小时到 72 小时执行一次数据扫描以收集延时录像，这些录像将由适当的软件进行分析。
    3. 对于使用 mFC 的肿瘤杀伤测定，72 小时后（参见步骤 3.1.6），收获细胞并在室温下以 1100 x g 离心两次 5 分钟。
    4. 在 96 孔 U 形底部 TC 处理的微孔板中，在 20 μL 含有 0.125 μg IgG 同种型对照或抗小鼠太平洋蓝 （PB） 偶联的 CD45 的冷 FACS 缓冲液中对细胞表面标志物进行染色，并在 4 °C 下在黑暗中孵育 20 分钟。紧接着，在 FACS 缓冲液中洗涤细胞两次，并在流式细胞术分析前加入终浓度为 1 μM 的活力染料碘化丙啶 （PI）。在 mFC 采集期间，然后在数据分析期间，继续执行以下门控策略：
      1. 根据其 FSC-A（x 轴）和 SSC-A（y 轴）属性（门 1）识别感兴趣的细胞。通过绘制 FSC-A （x 轴） 和 FSC-H （y 轴，门 2） 从分析中排除细胞双峰和团块。
      2. 使用 450/50 nm 发射 bp 滤光片（门 3）检测癌细胞的 CD45 阴性性。最后，使用 610/620 nm bp 发射滤光片分析细胞中的 PI 掺入作为单参数直方图中的平均荧光强度。
        注：癌细胞死亡也可以通过进行 Annexin V-PI 细胞凋亡测定或评估裂解的 Caspase-3 和 -7 的表达水平来分析。
    5. 执行数据分析。
      注意：使用 Prism GraphPad 软件 v.8.4.0 进行统计分析。

结果

CD11c+ DC 是广为人知的吞噬细胞亚群，专门用于交叉呈递 21,22 并如图 2A 所示进行门控，以吞噬紫外线照射的 MCA205 癌细胞的凋亡体的能力，这些癌细胞先前用 PKH67 荧光细胞接头标记通过 mFC 进行评估。正如预期的那样，CD11c + DC 在 37 °C 而不是 4 °C 下在体外有效捕获凋亡 MCA205 细胞（图 2B

讨论

监测抗癌免疫反应对于阐明和理解在 TME 中起作用并支持持续争夺霸权的复杂分子和细胞相互作用至关重要23。在这里，我们详细介绍了一个简单的 mFC 和 ToC 辅助方案，用于监测和表征构成癌症免疫循环的步骤。该方案基于小鼠细胞系和小鼠来源的免疫细胞，具有微小的变化，可以适应人类永生化甚至原发性癌症系和人类外周血衍生的免疫细胞。此外，结合特定途径的遗传或药?...

披露声明

作者没有需要披露的利益冲突。

致谢

A.S. 由 AIRC （IG #28807） 和 PRIN （#P2022YE2MX） 提供支持。M.M. 得到了 AIRC-FIRC 奖学金 （#25558） 的支持。ADN 得到了由欧盟资助的创新生态系统罗马科技城ECS00000024的支持 - 下一代欧盟，PNRR 任务 4 第 2 部分投资 1.5。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubes Eppendorf30120086
100 kV e-beam litographyVistec
100 mm Petri dishes Greiner Bio One664160
12-well platesEuroclone ET3012
15 and 50 mL tubesCorning 352096; 352070
40 μm cell strainer Corning CLS431750
5 mL polystyrene tubes Greiner Bio-One120180
70 μm cell strainer Corning CLS431751
75 cm2 cell culture treated flaskEuroclone ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) AntibodyMiltenyi Biotec130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody Miltenyi Biotec130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) AntibodyBioLegend100206
AptesSigma Aldrich440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlugBD Biosciences555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)BD Biosciences555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)BD Biosciences554724
Bovine serum albumin (BSA)US Biological, SalemA1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)eBioscience12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)eBioscience17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)eBioscience25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)eBioscience11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)InvitrogenMCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)eBioscience48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)eBioscience53-0951-82
Cell counting slidesKova International87144E
Chromium quartz masksMB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay KitInvitrogenC10635
CytoFLEX Flow CytometerBeckman Coulter
Dead Cell Removal KitMiltenyi Biotec130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)EuroCloneECB4053L
EDTAInvitrogenAM9260G
Fetal bovine serum (FBS)EuroCloneECS0180L
Flowjo v10.0.7Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)eBioscience12-8898-82
H2O2Sigma Aldrich
H2SO4Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)Thermo Scientific
Ice machineBrema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)eBioscience11-7311-82
Illustrator CC 2015Adobe Systems Inc.
ImageJNational Institute of Health
Incucyte 2022A SoftwareSartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead CellsSartorius4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging MicroscopeBulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)Angelantoni
L-glutamine 200 mMEuroCloneECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitInvitrogenL10119
MACS columnsMiltenyi Biotec130-042-201; 130-042-401 
MACS separatorsMiltenyi Biotec130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell lineSigma-AldrichSCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R MicrocentrifugeThermo Scientific75002552
Microsoft Excel Microsoft, Redmond 
Mouse: C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouseMiltenyi Biotec130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BITNikon Instruments Inc.
Optical litographyEVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfateEuroCloneECB3001D/1
Pipet aidDrummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201
PipettesEppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker KitsSigma-AldrichPKH67GL-1KTfluorescent cell linker  kit
plastic coverslipIBIDI10812
Propidium IodideThermo ScientificP1304MP
Reactive Ion Etching systemOxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)EuroCloneECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)Corning- Millipore-Sigma; St. Louis,
MO		CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge SeriesThermo Scientific75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)EuroClone Spa, Milan, ItalyECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 seriesMicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punchesKai Medical, Tedpella
Sylgard 184Dowsil, Dow Corning101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)eBioscience12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS Sigma Aldrich92360
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol RedEuroCloneECM0920
Vacuum dessicator

参考文献

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype. Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).
  3. Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure. Cells. 10 (9), 2361 (2021).
  4. Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. The three Es of cancer immunoediting. Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).
  5. Musella, M., et al. Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B. Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).
  6. Anderson, K. G., et al. Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies. J Immunother Cancer. 11 (6), e006533 (2023).
  7. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  8. Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry. Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).
  9. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Front Mol Biosci. 7, 612801 (2020).
  10. Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy. Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).
  11. Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge. Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).
  12. Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. 3D cancer models: One step closer to in vitro human studies. Front Immunol. 14, 1175503 (2023).
  13. De Ninno, A., et al. Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments. JoVE. (170), e61895 (2021).
  14. Mattei, F., et al. Oncoimmunology meets organs-on-chip. Front Mol Biosci. 8, 627454 (2021).
  15. Businaro, L., et al. Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment. Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).
  16. Vacchelli, E., et al. Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1. Science. 350 (6263), 972-978 (2015).
  17. Maulana, T. I., et al. Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy. Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).
  18. Lorenzi, S., et al. Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming. J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).
  19. Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies. Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).
  20. Lucarini, V., et al. Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma. J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).
  21. Gutiérrez-Martínez, E., et al. Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets. Front Immunol. 6, 363 (2015).
  22. Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  23. Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition. Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).
  24. Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI. Front Oncol. 13, 1172314 (2023).
  25. Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
  26. Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research. Clin Transl Med. 12 (1), 696 (2022).
  27. Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics. Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).
  28. Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. Current trends in flow cytometry automated data analysis software. Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).
  29. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).

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