Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Совместное культивирование систем in vitro для воспроизведения цикла «рак-иммунитет»
В этой статье
Резюме
В этой статье мы подробно описываем простой, быстрый и надежный протокол многопараметрической проточной цитометрии и терапии опухоли на чипе для мониторинга и определения характеристик этапов, составляющих цикл «рак-иммунитет». Действительно, глубокое понимание взаимодействия между раком и иммунными клетками дает критически важную информацию о том, как перехитрить опухоли и направить клиническую помощь.
Аннотация
Фундаментальные исследования рака и разработка эффективных методов лечения контратаки опираются на экспериментальные исследования, подробно изучающие взаимодействие между раком и иммунными клетками, так называемый цикл «рак-иммунитет». Системы ко-культивирования in vitro в сочетании с мультипараметрической проточной цитометрией (mFC) и микрофлюидными устройствами (ToC) «опухоль на чипе» обеспечивают простой, быстрый и надежный мониторинг и характеристику каждого этапа цикла «рак-иммунитет» и приводят к выявлению механизмов, ответственных за изменение баланса между иммунонадзором за раком и уклонением от иммунитета. Глубокое понимание динамического взаимодействия между раком и иммунными клетками дает критически важную информацию о том, как перехитрить опухоли, и ускорит темпы персонализации и оптимизации терапии у пациентов. В частности, здесь мы подробно описываем простой протокол с поддержкой mFC и ToC, позволяющий разгадать динамические сложности каждого этапа цикла «рак-иммунитет» в клеточных линиях рака мышей и иммунных клетках, полученных от мышей, и сосредоточить внимание на иммунонадзоре. Учитывая временные и финансовые особенности этого протокола, он, безусловно, осуществим в больших масштабах. Более того, с незначительными вариациями, этот протокол может быть как адаптирован к линиям раковых клеток человека и иммунным клеткам периферической крови человека, так и сочетаться с генетическим и/или фармакологическим ингибированием конкретных путей с целью идентификации биомаркеров иммунного ответа.
Введение
В течение последних нескольких десятилетий иммунотерапия была на переднем крае передовых методов лечения рака. Использование иммунной системы в противоопухолевых целях обеспечило мощное доказательство концепции для пользы пациента при различных гематологических и солидных злокачественных новообразованиях с исторически плохими прогнозами. Поскольку иммунотерапия открывает возможности для лечения рака, который в противном случае трудно поддается лечению, она демонстрирует поразительно быстрые темпы прогресса. Такой прогресс можно, по крайней мере частично, объяснить более глубоким пониманием взаимодействия между раковыми клетками и иммунными клетками. Это взаимодействие....
протокол
Все этапы протокола, требующие использования животных, соответствуют Директиве ЕС 63/2010 и включены в экспериментальный протокол, утвержденный Институциональным комитетом по экспериментам на животных и Министерством здравоохранения Италии (номер одобрения 858/2015/PR).
1. Подготовка раковых клеток
- Рутина культивирования раковых клеток (день -7; продолжительность: 2 часа)
- Выращивайте мышиные клетки фибросаркомы MCA205 в питательной среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина G натриевой соли, 100 мкг/мл с....
Результаты
Способность CD11c+ DCs, широко известного субпопуляции фагоцитов, специализированного для перекрестной презентации21,22 и гейтированного, как показано на рисунке 2A, поглощать апоптотические тельца из УФ-облученных раковых клеток MCA205, ко.......
Обсуждение
Мониторинг противоопухолевого иммунного ответа имеет первостепенное значение для выяснения и понимания сложных молекулярных и клеточных взаимодействий, действующих в TME и поддерживающих постоянную борьбу за превосходство23. В этой статье мы подробно описываем простой п?.......
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
A.S. поддерживается AIRC (IG #28807) и PRIN (#P2022YE2MX). М.М. получает стипендию AIRC-FIRC (#25558). A.D.N. поддерживается Инновационной экосистемой Rome Technopole ECS00000024 финансируется ЕС - Next Generation EU, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.
....Материалы
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorf | 30120086 | |
| 100 kV e-beam litography | Vistec | ||
| 100 mm Petri dishes | Greiner Bio One | 664160 | |
| 12-well plates | Euroclone | ET3012 | |
| 15 and 50 mL tubes | Corning | 352096; 352070 | |
| 40 μm cell strainer | Corning | CLS431750 | |
| 5 mL polystyrene tubes | Greiner Bio-One | 120180 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| 75 cm2 cell culture treated flask | Euroclone | ET7076 | |
| Adsorbent wipes | |||
| Allumin foil | |||
| anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-319 | |
| anti-mouse CD25 (7D4) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-118-678 | |
| anti-mouse CD3 (17A2) Antibody | BioLegend | 100206 | |
| Aptes | Sigma Aldrich | 440140 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
| BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological, Salem | A1312 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418) | eBioscience | 12-0114-81 | |
| CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5) | eBioscience | 17-1371-82 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (17A2) | eBioscience | 25-0032-82 | |
| CD44 Monoclonal Antibody (IM7) | eBioscience | 11-0441-82 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | MCD4528 | |
| CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3) | eBioscience | 48-0691-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 11-0081-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7) | eBioscience | 53-0951-82 | |
| Cell counting slides | Kova International | 87144E | |
| Chromium quartz masks | MB W&A, Germany | ||
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10635 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | EuroClone | ECB4053L | |
| EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| Fetal bovine serum (FBS) | EuroClone | ECS0180L | |
| Flowjo v10.0.7 | Flowjo, LLC | ||
| Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB) | eBioscience | 12-8898-82 | |
| H2O2 | Sigma Aldrich | ||
| H2SO4 | Sigma Aldrich | ||
| hotplate | |||
| Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2) | Thermo Scientific | ||
| Ice machine | Brema Ice Makers | ||
| IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2) | eBioscience | 11-7311-82 | |
| Illustrator CC 2015 | Adobe Systems Inc. | ||
| ImageJ | National Institute of Health | ||
| Incucyte 2022A Software | Sartorius | ||
| Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells | Sartorius | 4632 | |
| Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System | Sartorius | ||
| JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope | Bulldog Bio | ||
| Laboratory bench | |||
| Laboratory refrigerator (4°C) | |||
| Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Angelantoni | ||
| L-glutamine 200 mM | EuroClone | ECB3004D | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34957 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L10119 | |
| MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201; 130-042-401 | |
| MACS separators | Miltenyi Biotec | 130-042-10; 130-042-302 | |
| MCA205 mouse fibrosarcoma cell line | Sigma-Aldrich | SCC173 | |
| Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine | |||
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002552 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Redmond | ||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-096-543 | |
| Nikon ECLIPSE Ts2 | Nikon Instruments Inc. | ||
| NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT | Nikon Instruments Inc. | ||
| Optical litography | EVG | ||
| Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate | EuroClone | ECB3001D/1 | |
| Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | |
| Pipettes | Eppendorf | ||
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | PKH67GL-1KT | fluorescent cell linker kit |
| plastic coverslip | IBIDI | 10812 | |
| Propidium Iodide | Thermo Scientific | P1304MP | |
| Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab | ||
| Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | EuroClone | ECB9006L | |
| serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489 | |
| SL 16 Centrifuge Series | Thermo Scientific | 75004031 | |
| Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers | |||
| Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | |
| SU-8 3000 series | MicroChem corp, Newton, (MA) | ||
| Suite of dermal biopsy punches | Kai Medical, Tedpella | ||
| Sylgard 184 | Dowsil, Dow Corning | 101697 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597) | eBioscience | 12-5961-82 | |
| Thermostatic bath | |||
| Timer | |||
| TMCS | Sigma Aldrich | 92360 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA w/ Phenol Red | EuroClone | ECM0920 | |
| Vacuum dessicator |
Ссылки
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.
Перепечатки и разрешения
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены