АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье мы подробно описываем простой, быстрый и надежный протокол многопараметрической проточной цитометрии и терапии опухоли на чипе для мониторинга и определения характеристик этапов, составляющих цикл «рак-иммунитет». Действительно, глубокое понимание взаимодействия между раком и иммунными клетками дает критически важную информацию о том, как перехитрить опухоли и направить клиническую помощь.

Аннотация

Фундаментальные исследования рака и разработка эффективных методов лечения контратаки опираются на экспериментальные исследования, подробно изучающие взаимодействие между раком и иммунными клетками, так называемый цикл «рак-иммунитет». Системы ко-культивирования in vitro в сочетании с мультипараметрической проточной цитометрией (mFC) и микрофлюидными устройствами (ToC) «опухоль на чипе» обеспечивают простой, быстрый и надежный мониторинг и характеристику каждого этапа цикла «рак-иммунитет» и приводят к выявлению механизмов, ответственных за изменение баланса между иммунонадзором за раком и уклонением от иммунитета. Глубокое понимание динамического взаимодействия между раком и иммунными клетками дает критически важную информацию о том, как перехитрить опухоли, и ускорит темпы персонализации и оптимизации терапии у пациентов. В частности, здесь мы подробно описываем простой протокол с поддержкой mFC и ToC, позволяющий разгадать динамические сложности каждого этапа цикла «рак-иммунитет» в клеточных линиях рака мышей и иммунных клетках, полученных от мышей, и сосредоточить внимание на иммунонадзоре. Учитывая временные и финансовые особенности этого протокола, он, безусловно, осуществим в больших масштабах. Более того, с незначительными вариациями, этот протокол может быть как адаптирован к линиям раковых клеток человека и иммунным клеткам периферической крови человека, так и сочетаться с генетическим и/или фармакологическим ингибированием конкретных путей с целью идентификации биомаркеров иммунного ответа.

Введение

В течение последних нескольких десятилетий иммунотерапия была на переднем крае передовых методов лечения рака. Использование иммунной системы в противоопухолевых целях обеспечило мощное доказательство концепции для пользы пациента при различных гематологических и солидных злокачественных новообразованиях с исторически плохими прогнозами. Поскольку иммунотерапия открывает возможности для лечения рака, который в противном случае трудно поддается лечению, она демонстрирует поразительно быстрые темпы прогресса. Такой прогресс можно, по крайней мере частично, объяснить более глубоким пониманием взаимодействия между раковыми клетками и иммунными клетками. Это взаимодействие напоминает «двигатель» с прямой связью, который иммунная система запускает для уничтожения раковых клеток, так называемый цикл «рак-иммунитет». Этот противоопухолевый иммунный ответ протекает на трех основных уровнях: распознавании, обработке и реакции. Во-первых, в фазе распознавания опухолевые антигены (Ag), образующиеся во время образования опухоли, высвобождаются умирающими раковыми клетками в опухолевом микроокружении (TME, шаг 1) и поглощаются инфильтрирующими опухоль дендритными клетками (DCs, шаг 2). Затем, на этапе процессинга, ДК представляют эпитопы захваченных опухолевых Ag через молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC), экспрессируют на их поверхности более высокие уровни костимулирующих молекул (шаг 3) и перемещаются в дренирующие опухоль лимфатические узлы (dLN) для перекрестного представления своего груза наивным CD8 Т-клеткам (CD8N, шаг 4). Все эти этапы сходятся в заключительном процессе реакции, в ходе которого опухолевые Ag-специфичные перекрестно-праймированные CD8 Т-клетки (CD8C-P) активируются, созревают в эффекторные CD8 Т-клетки (CD8E) и подвергаются клональной экспансии (стадия 5). Затем CD8Е-клетки покидают dLNs и через кровь попадают в TME (шаг 6), где они специфически распознают и связываются с раковыми клетками посредством взаимодействия между их рецептором Т-клеток (TCR) и родственными им опухолевыми Ags, высвобождают цитотоксические молекулы [т.е. интерферон (ИФН)-γ, перфорины и гранзимы (Grzs)] и убивают раковые клетки (шаг 7)1. 2. Уничтожение раковых клеток приводит к высвобождению опухолевых Ags для подпитки цикла «рак-иммунитет». На самом деле, на всех этих этапах иммунная система уничтожает и отторгает раковые клетки гораздо чаще, чем предполагалось. Однако у онкологических больных хотя бы один из этих этапов не работает должным образом. Мы и другие показали, что раковые клетки стремятся затормозить иммунный ответ, либо эволюционируя в более агрессивные и иммунно-привилегированные варианты 3,4,5, либо препятствуя эффективности Т-клеток 6,7.

Исследования рака и разработка лекарств от рака опираются на экспериментальные модели, которые позволяют изучать взаимосвязь между раком и иммунными клетками, так называемую онкоиммунологию. Здесь описаны быстрые, надежные, воспроизводимые и недорогие модели in vitro , которые всесторонне воспроизводят каждый этап онкоиммунологического цикла и предлагают быстрое и четкое представление о наборах фенотипических и функциональных особенностей иммунонадзора и, в конечном итоге, иммуноредактирования.

Мультипараметрическая проточная цитометрия (мФК) является одним из наиболее успешных аналитических инструментов для одиночных клеток в фундаментальных исследованиях рака, диагностике и трансляционных исследованиях в клинических испытаниях рака. Поскольку mFC позволяет одновременно захватывать больше особенностей в каждой клетке, он заслужил свое место в качестве золотого стандарта аналитической платформы в онкоиммунологии. Он сочетает в себе высокую чувствительность и специфичность с возможностью быстро и воспроизводимо измерять множественные паттерны экспрессии белков и функциональные свойства на уровне одной клетки из гетерогенных и даже гетеротипических клеточных суспензий, таких как TME 8,9,10. Поскольку как фенотипические, так и функциональные паттерны экспрессии чувствительны ко времени, тщательное внимание к планированию эксперимента, выбору подходящих панелей, контрольных элементов и титрованных антител, а также к надлежащей обработке образцов и использованию инструментов имеет решающее значение для надежности, сопоставимости и воспроизводимости результатов, а также для уверенной интерпретациирезультата эксперимента.

Микрофлюидные устройства (ToC) «опухоль на чипе» моделируют TME, позволяя in vitro микромасштабную биомиметику динамики рака и иммунных клеток и взаимодействуют 12,13,14,15. В частности, ToC представляют собой многоканальные микрофлюидные устройства для культивирования клеток, способные размещать различные типы клеток, организованные либо в двумерных (2D), либо в трехмерных (3D) условиях культивирования, и способные моделировать с высокой точностью и с высокой точностью контролировать ключевые структурные и функциональные единицы, такие как гетеротипические клеточные взаимодействия и потоки химических градиентов, которые физиологически происходят в TME12. 13,14,15. В частности, иммунная химиоаттракция и траектории, а также взаимодействие иммунных клеток с раковыми клетками могут контролироваться в режиме реального времени и количественно оцениваться с помощью покадровой микроскопии и автоматизированного анализа слежения 5,12,13,14,15,16. Кроме того, Оглавление дает возможность как анализировать, так и манипулировать важнейшими процессами, регулирующими возникновение и прогрессирование рака, а также реакцию на терапию17.

В данной статье mFC с ToC объединены для изучения всех уровней противоопухолевого иммунного ответа, проходящего через DC-опосредованный фагоцитоз раковых Ags (этапы 1-3), кросс-прайминг Т-клеток (этап 4), активацию и клональную экспансию (последнее с помощью технологии 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) и катализируемого Cu(I)-циклоприсоединения [click], высокочувствительной и точной методологии, шаг 5), самонаведение CD8Е-клеток на ТМЭ (шаг 6) и, наконец, CD8 Е-опосредованное уничтожение раковых клеток (шаг 7, рис. 1).

Эта работа вносит свой вклад в усилия по созданию простых, быстрых и надежных стандартных протоколов для изучения цикла «рак-иммунитет». Улучшение и интеграция моделей mFC и ToC в исследования рака, динамики ТМЭ и ответа на терапию имеют большой потенциал, поскольку эти модели обеспечивают биологическую достоверность наряду с экспериментальным контролем. Таким образом, этот протокол помогает поэтапно воссоздать цикл «рак-иммунитет», позволяя характеризовать, контролировать и своевременно манипулировать ролями отдельных клеточных игроков и их взаимными взаимодействиями при естественном и приобретенном иммунонадзоре. В конечном итоге это поможет улучшить, сократить и заменить исследования на животных, обеспечивая при этом критически важную информацию для перехитрения опухолей и руководства клинической помощью. Наконец, преимущества и ограничения mFC и ToC критически обсуждаются и сравниваются с современными технологиями (например, пространственным анализом с высоким плексом при одноклеточном и даже субклеточном разрешении) для продвижения вперед онкоиммунологических исследований и терапии.

протокол

Все этапы протокола, требующие использования животных, соответствуют Директиве ЕС 63/2010 и включены в экспериментальный протокол, утвержденный Институциональным комитетом по экспериментам на животных и Министерством здравоохранения Италии (номер одобрения 858/2015/PR).

1. Подготовка раковых клеток

  1. Рутина культивирования раковых клеток (день -7; продолжительность: 2 часа)
    1. Выращивайте мышиные клетки фибросаркомы MCA205 в питательной среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина G натриевой соли, 100 мкг/мл сульфата стрептомицина и 50 мкг/мл гигромицина (полная питательная среда), в увлажненном инкубаторе для клеточных культур в стандартных условиях культивирования (37 °C, 5% CO2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптируйте условия культивирования в соответствии с выбранной линией клеток. В случае размораживания клеткам требуется ~1 неделя времени на восстановление, чтобы адаптироваться к оптимальным условиям культивирования и восстановить нормальные клеточные циклы.
    2. Для оптимизации роста клеточной культуры пластинчатые клетки в 75см 2 колбы с плотностью 1 х 106 клеток/мл в 12-15 мл полной питательной среды.
      Примечание: Количество засеянных клеток может варьироваться в разных клеточных линиях, обычно в зависимости от конкретного размера клетки и времени удвоения. Слияние клеток кардинально влияет на состояние клеток. Если клетки мало или слишком сливаются, могут произойти метаболические нарушения, способствующие остановке пролиферации, клональному отбору или клеточному стрессу. Для клеток MCA205 пассирование необходимо проводить два раза в неделю в соотношении 1:10-1:20.
    3. Когда клеточные культуры достигнут максимальной конфлюенции 75%-80%, отбросьте всю питательную среду из монослоя клетки, промойте клетки предварительно подогретым фосфатно-солевым буфером (PBS) для удаления FBS, а затем добавьте 1,5 мл предварительно подогретой 0,25% трипсина/этилендиамитетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 1-2 минут при 37 °C для отделения клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FBS содержит ингибиторы протеазы, которые могут инактивировать ферментативную активность трипсина, поэтому его полное удаление является решающим шагом. Время инкубации трипсина различается в зависимости от типа клеток. В качестве общей рекомендации, избегайте длительной инкубации клеток с высокой концентрацией трипсина, так как это может повредить белки клеточной поверхности и спровоцировать гибель клеток. На этом этапе проверьте состояние отслойки клеток с помощью светового микроскопа.
    4. Оторванные клетки соберите в 10 мл предварительно подогретой полной питательной среды для инактивации ферментативной активности трипсина и центрифугируйте их в течение 5 мин при 1100 × г при комнатной температуре (ОТ). Подсчитайте клетки на предметном стекле с помощью теста на исключение красителя Trypan Blue, а затем повторно засейте их после разведения в соответствующие подложки для поддерживающей культуры (не более чем за 8 проходов от размораживания) или для последующих экспериментальных процедур, как описано ниже.
  2. Гибель раковых клеток - высвобождение Ags раковых клеток (день 0; продолжительность: 30 мин)
    1. Для последующих функциональных экспериментов планшет 3 × 106 клеток MCA205 в чашке Петри, обработанной культурой тканей толщиной 100 мм, в 10 мл полной питательной среды.
      Примечание: Для конкретных экспериментальных применений (например, анализ поглощения Ag DC-опосредованной опухолью) перед индуцированием гибели клеток раковые клетки были помечены с помощью флуоресцентного клеточного линкера (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Облучайте клетки ультрафиолетовым (УФ) светом18 (ƛ = 254 нм) на расстоянии 9 см в течение 3 минут, а затем инкубируйте их при 37 °C, 5%CO2 в течение не менее 6 часов, чтобы они погибли.
      Примечание: Гибель раковых клеток также может быть вызвана химиотерапевтическим лечением (например, иммуногенными или неиммуногенными препаратами).

2. Кокультура раковых и иммунных клеток

  1. DC-опосредованный рак Ag поглощение и проявление (день 0; Время: 1 ч времени на стенде, 24 ч на инкубации)
    1. Через 4-6 ч соберут ДК, дифференцированные in vitro из клеток костного мозга (КМ) иммунокомпетентных мышей, как описано ранее8, и промоют их дважды в течение 5 мин при 1100 х г при ЛТ в полной питательной среде.
      Примечание: ДК могут быть альтернативно выделены из спленоцитов мыши путем центрифугирования на основе градиента на основе Histodenz, как сообщалось ранее19. В качестве хорошей практики, если используются криоконсервированные ДК, обязательно предварительно нагрейте всю питательную среду и добавьте в нее бензоназу 1:1000, чтобы предотвратить слипание клеток и, таким образом, обеспечить хорошее восстановление после размораживания.
    2. Соберите раковые клетки, облученные ультрафиолетом, начиная с шага 1.2.2 и центрифугируйте их в течение 5 мин при 1100 x g при ЛТ. Подсчитайте полученные из BM «пустые» ДК (DC N), как указано выше (см. шаг 1.1.4), а затем установите кокультуру с УФ-облученными апоптотическими апоптотическими клетками в соотношении 2:1 (5 × 105 апоптотических клеток MCA205 для 2,5 ×10 5 DCs, как было предварительно оптимизировано8) в 12-луночных планшетах в 1 мл свежей полной питательной среды в течение 24 ч при 37°С, 5%СО2. В качестве экспериментального контроля инкубируйте клетки при температуре 4 °C, при которой фагоцитоз затруднен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не увеличивайте поверхность и объем ко-культивирования, так как это может препятствовать взаимодействию апоптотических раковых клеток с DC и, таким образом, препятствовать оптимальному и эффективному фагоцитозу. Кроме того, исследования по оптимизации соотношения раковых клеток:DC должны быть проведены, если используются другие модели раковых клеток.
  2. Оценка поглощения Ag раком с помощью mFC (день 1; продолжительность: 2 часа)
    1. Через 24 ч инкубации соберите клетки в пробирки объемом 15 мл и промойте их дважды в течение 5 мин при 1100 х г при ОТ в 10 мл полной питательной среды.
      Примечание: Для снижения фонового шума апоптотических клеток, прилипших к мембране DC и еще не полностью поглощенных, клеточные гранулы инкубируют в течение 5 мин при RT с 0,1 М ЭДТА. Клеточные суспензии (содержащие приблизительно 2 x10-6 клеток) затем дважды центрифугируют с 10 мл питательной среды, как показано на стадии 2.2.1.
    2. Для окрашивания клеточной поверхности ресуспендируйте ДК, полученные из BM, в 20 мкл холодно-флуоресцентно-активируемого буфера для сортировки клеток (FACS) (1% FBS, 0,1 М ЭДТА в PBS), содержащем 0,5 мкг либо контрольного изотипа IgG, либо конъюгированного против мышиного фикоэритрина (ПЭ) CD11c в 96-луночном U-образном микропланшете, обработанном культурой нижней ткани, и инкубируют их в течение 20 мин при 4 °C в темноте для сохранения сигнала флуорохрома и предотвращения фотообесцвечивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как только происходит поглощение ракового антигена, «полная» активация DC (DCPHAGO) также может быть проверена путем проверки уровней экспрессии костимулирующих молекул (т.е. CD80 или CD86 и MHC-II, а также лиганда контрольных точек иммунного ответа антигена CD274 [наиболее известного как PDL1]). Как правило, для оптимальной работы проточного цитометра необходимо тщательно титровать концентрацию антител, а количество клеток должно находиться в диапазоне от 1 x 105 до 1 x 108 клеток/тест.
    3. После этого дважды промойте ячейки в буфере FACS и добавьте 100 мкл раствора PBS, содержащего корректируемый жизнеспособность красителя, близкого к инфракрасному (ИК), в конечной концентрации 1 мкМ в течение 30 мин при ОТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать другие красители, зависящие от жизнеспособности (например, фиолетовый, синий, оранжевый, лайм, аква), не перекрывающиеся с используемыми флуоресцентными излучениями.
    4. Промойте клетки один раз в PBS и ресуспендируйте их в буфере FACS перед проточным цитометрическим анализом уровней CD11c и PKH67 с помощью mFC. При сборе mFC, а затем при анализе данных следует использовать следующую стратегию стробирования:
      1. Определите интересующие вас ячейки на основе их свойств прямой области рассеяния (FSC-A, ось x) и боковой области рассеяния (SSC-A, ось y) (вентиль 1). Исключите дублеты и скопления ячеек из анализа, построив график FSC-A (ось x) и высоту прямого рассеяния (FSC-H, ось y, вентиль 2).
      2. Удалите мертвые ячейки, построив диаграмму полосы пропускания излучения (bp) с длиной волны 780/60 нм (ось x) и SSC-A (ось y, строб 3). Наконец, на основе затвора 3 детектируют клеточную позитивность для маркера CD11c и флуоресцентного клеточного линкера PKH67 на двухпараметрических графиках плотности с использованием фильтров 575/26 нм и 530/30 нм соответственно.
    5. Выполняйте анализ данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно комбинируйте антитела, чтобы гарантировать простую и эффективную маркировку с хорошо разделенными длинами волн излучения. Это упрощает настройку компенсации для используемых флуорофоров и позволяет легко, быстро и надежно количественно оценить интересующие параметры.
  3. Праймирование и активация CD8 Т-клеток (день 1; Продолжительность: 1 час на стенде, 72-96 часов на инкубацию)
    1. Очистите CD8 Т-клетки селезенки мыши (CD8N), как описано ранее8.
    2. Подсчитывают и ресуспендируют выделенные CD8 Т-клетки в 500 мкл свежей полной питательной среды и культивируют их с ДК, полученными из БМ, которые ранее поглощали апоптотические клетки MCA205 в соотношении 2,5:1 (2,5 × 105 ДК для 1 × 105 Т-клеток, как было предварительно оптимизировано8) в течение 72 ч в 12-луночных планшетах в конечном объеме 1,5 мл при 37 °С. 5%СО2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подчеркнуть экспериментальные результаты, были протестированы различные соотношения клеточных культур и выбрано наилучшее.
  4. Анализ пролиферации CD8 Т-клеток с помощью анализа EdU mFC (день 4; Продолжительность: 15 минут на стенде, 16-20 часов на инкубации)
    1. Добавьте нуклеозидный аналог тимидина EdU в среду для совместного культивирования в конечной концентрации 10 мкМ и хорошо перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку условия культивирования, вариации типа клеток и плотность клеток могут влиять на включение EdU в ДНК, в пилотных экспериментах протестируйте диапазон концентраций EdU и времени инкубации. Более длительная или короткая инкубация может потребовать более низких или более высоких концентраций соответственно. Включите клетки из той же популяции, которые не были обработаны EdU в качестве отрицательного контроля окрашивания.
    2. Через 16-20 ч извлечь и центрифугировать CD8C-P дважды в течение 5 мин при 1100 x g при РТ.
    3. Окрашивают клетки на поверхностные маркеры в 20 мкл холодного буфера FACS с добавлением 0,5 мкг CD8a, конъюгированного против мышиного флуоресцеина изотиоцианата (FITC), и 0,25 мкг CD3, конъюгированного с мышиным ПЭ, или соответствующими контрольными изотипами IgG в 96-луночном U-образном дне, обработанном TC, и инкубируют их в течение 20 мин при 4 °C в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание каких-либо помех рекомендуется не использовать конъюгаты антител Qdot перед выполнением клик-реакции.
    4. Дважды промойте клетки в буфере FACS (как на шаге 2.2.3) и повторно суспендируйте гранулы клеток в 100 мкл раствора PBS, содержащего корректируемый на жизнеспособность краситель Aqua, в конечной концентрации 1 мкМ в течение 30 мин при ЛТ.
      1. Перенесите клеточные суспензии в проточные трубки, промойте их один раз 3 мл 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS и продолжайте фиксацию клеток в 100 мкл фиксатора (т.е. 4% параформальдегида в PBS) в течение 15 мин в RT, защищенном от света.
      2. Сразу после этого промойте клетки 3 мл 1% BSA в PBS, инкубируйте их в 100 μл раствора, содержащего 1x пермеабилизацию на основе сапонина, и промойте реагентом в течение 15 минут в режиме RT, а затем перейдите непосредственно к реакции мечения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 1x реагент для пермеабилизации и промывки на основе сапонина получают путем разбавления объема 10x раствора 1:10 с 1% BSA в PBS. Этот реагент также можно использовать с клеточными суспензиями, содержащими цельную кровь или эритроциты, поскольку он сохраняет морфологические характеристики рассеяния света лейкоцитов при лизировании эритроцитов.
      3. В зависимости от количества анализируемых образцов приготовьте реакционный коктейль, осторожно и последовательно смешивая указанные объемы PBS, катализатора защиты меди, 647-конъюгированного пиколилазида Alexa Fluor (AF) и 1x буферной добавки EdU.
        1. Используйте коктейль реакции в течение 15 минут после приготовления. Добавьте по 500 μл реакционной смеси в каждую пробирку, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 30 минут при RT в темноте.
      4. Промойте клетки один раз 3 мл реагента для пермеабилизации и промывки на основе сапонина 1x и ресуспендируйте их в 100 мкл того же раствора, прежде чем приступить к стандартным методам mFC для определения процента пролиферирующего CD8C-P в S-фазе в клеточной популяции с помощью mFC. Во время сбора mFC и последующего анализа данных используйте следующую стратегию стробирования:
        1. Определите интересующие ячейки на основе их свойств FSC-A (ось x) и SSC-A (ось y) (вентиль 1). Исключите дублеты и скопления ячеек из анализа, построив графики FSC-A (ось x) и FSC-H (ось y, вентиль 2). Удалите мертвые элементы, нанеся на график площадь фильтра 525/50 нм (ось x) и SSC-A (ось y, затвор 3).
        2. Определение положительной клеточности CD8a и CD3 на двухпараметрических графиках плотности с использованием фильтров 530/30 нм и 575/26 нм соответственно (вентиль 4). Наконец, основываясь на затворе 4, проанализируйте ячейки на предмет включения AF647-EdU в качестве средней интенсивности флуоресценции в гистограмме с одним параметром с использованием эмиссионного фильтра 660/620 нм.н.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный сигнал, генерируемый маркировкой EdU, лучше всего обнаруживается при использовании низкой скорости потока во время сбора данных.
      5. Выполняйте анализ данных.

3. Рестимуляция CD8C-P раковыми клетками

  1. CD8C-P распознает живые раковые клетки (день 4; Продолжительность: 1 час работы стенда, 48-72 часа инкубации)
    1. Извлекают CD8C-P из кокультуры (см. шаг 2.3.2) и центрифугируют их в течение 10 мин при 1100 x g при RT в 10 мл полной питательной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе проверьте дифференцировку CD8 Т-клеток, проверив уровни экспрессии маркера активации CD95.
    2. Ресуспендируйте клеточные гранулы, содержащие примерно 2,5 × 106 клеток, в 100 мкл микрогранул для удаления мертвых клеток на 1 х 107 клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При увеличении количества ячеек соответственно увеличивайте объем реагентов и общий объем.
    3. Хорошо перемешайте и выдерживайте в течение 15 минут при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости объем образца корректируется путем добавления 1x связующего буфера в соответствии с инструкциями производителя, чтобы достичь минимального 500 μL, необходимого для магнитной сепарации.
    4. Сразу после этого приступают к последующему разделению магнитных ячеек. Поместите разделительные колонки в магнитное поле подходящего сепаратора и промойте их соответствующим количеством связующего буфера 1x. Перенесите клеточные суспензии в разделительные колонны и соберите проточный поток, содержащий немаркированную фракцию живых клеток.
    5. Снова промойте колонки соответствующим количеством 1x связывающего буфера. Соберите немаркированные ячейки, которые проходят через них, и объедините их со сточными водами из шага 3.1.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения эффективности магнитного удаления мертвых клеток фракция живых клеток может быть обогащена в ходе второй процедуры разделения, как описано в шагах 3.1.1-3.1.5, с использованием новой колонки.
    6. Центрифуга обогащает живые CD8C-P в течение 5 мин при 1100 x g при ОТ в полной питательной среде перед подсчетом клеток, а затем культивирует их свежими клетками MCA205 в соотношении 2:1 (1 x 105 CD8 Т-клеток для 5 x 104 MCA205 клеток, как было предварительно оптимизировано8) в 12 луночных планшетах в конечном объеме 1 мл. После посева клеток поместите планшеты для совместного культивирования в увлажненный инкубатор для клеточных культур или в систему анализа живых клеток на 72 ч при 37 °C, 5%CO2, прежде чем приступить к последующим анализам.
  2. Транспортировка CD8 Т-клеток к раковым клеткам в микрофлюидных моделях ToC (день 5; Продолжительность: 2 часа на стенде, 72 часа инкубации)
    1. Специальные изготовленные микрофлюидные устройства ToC13,20 стерилизуют под УФ-шкафом в течение 20 минут, дважды промывают PBS, а затем инкубируют с полной питательной средой в течение не менее 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки MCA205 и CD8C-P не окрашиваются в этом протоколе; Тем не менее, оба могут быть помечены флуоресцентными живыми клеточными трекерами.
    2. Осторожно ресуспендируйте 1 × 105 клеток MCA205 в 15 мкл полной питательной среды, стараясь получить однородное распределение клеток, и медленно вводите их в левосторонние камеры чипов (опухолевую камеру), как описано ранее. Подождите 5-10 минут, чтобы раковые клетки прилипли к основанию чипа.
      1. Проверьте правильное и однородное распределение раковых клеток в микрофлюидном чипе под микроскопом. На результаты экспериментов может повлиять наличие пузырьков.
    3. Ресуспендируйте 1 x 106 CD8C-P в 50 мкл полной питательной среды. Аккуратно отпижьте суспензию иммунных клеток в правую камеру чипов (иммунную камеру).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе с помощью микроскопа убедитесь, что иммунные клетки распределены по промежуточной камере, создавая «фронт», который представляет собой отправную точку эксперимента.
    4. Во избежание колебаний давления и микрофлюидных колебаний тщательно заполните все резервуары для чипов, как указано ранее13 , до 150 мкл полной питательной среды и поместите собранные чипы на ровную поверхность в инкубатор для гумифицированных клеточных культур при 37 °С, 5%CO2 в течение не менее 1 ч для стабилизации системы перед покадровой съемкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно проверьте потенциальные потери на испарение объемов в двух резервуарах каждой камеры для стружки и компенсируйте их, добавляя свежую среду каждые 2-3 дня. При необходимости до 100 мкл надосадочной жидкости может быть аспирировано из каждого клеточного компартмента для выполнения цитокинового профилирования.
    5. С помощью видеомикроскопии, оснащенной инкубационной системой, можно записать в светлом поле ряд изображений микроканальной матрицы между правой и левой областями устройства, содержащими MCA205 и иммунные клетки соответственно, а также визуализировать динамику инфильтрации иммунных клеток и взаимодействия иммунных клеток с раковыми клетками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В использованных здесь экспериментальных условиях покадровые записи клеток собирались в инкубаторе в течение 72 ч с помощью микроскопа, который делал одну микрофотографию каждые 2 минуты. Оптимизируйте условия визуализации, чтобы избежать чрезмерной фотоэкспозиции и обеспечить высокую частоту кадров для простого выполнения нисходящего анализа отслеживания иммунных клеток. В конце таймлапса выполнить полуавтоматический трекинговый анализ13,20.
  3. Цитометрическая оценка активации CD8E и потока реактивности опухоли (7 и 8 день; Продолжительность: 2 часа)
    1. Через 48 и 72 ч инкубации (см. шаг 3.1.6) извлекают CD8E и дважды центрифугируют в течение 5 мин при 1100 x g при RT.
      Примечание: Для оценки внутриклеточных уровней цитотоксических молекул, продуцируемых CD8E (т.е. ИФН-γ и Grz-B), кокультуры раковых иммунных клеток предварительно инкубировали в течение не менее 6 ч с 1:1000 брефельдином А и 1:1500 монензином.
    2. Для окрашивания клеточной поверхности ресуспендируют клетки в 20 мкл трех различных первичных смесей антител, приготовленных в холодном буфере FACS, как показано в дополнительной таблице 1.
      Примечание: Чтобы убедиться в специфичности связывания антител, проводите эксперименты с mFC в присутствии соответствующего контроля изотипа IgG, как описано на шаге 2.2.2.
    3. Инкубируйте клетки в 96-луночном U-образном микропланшете, обработанном культурой нижней ткани, в течение 20 мин при 4 °C, защищенном от света. Для гранул ячеек из смесей А и В (дополнительная таблица 1) переходите непосредственно к шагу 3.3.5.
    4. После быстрой промывки добавьте 100 мкл раствора для фиксации/пермеабилизации в клеточные гранулы из смеси С (дополнительная таблица 1). После инкубации в течение 20 мин при 4°С в темноте клетки дважды промывают в 200 мкл холодного буфера для пермеабилизации/промывки и ресуспендируют их в 20 мкл холодного буфера для пермеабилизации/промывки, содержащего 0,25 мкг антимышиного FITC-конъюгированного ИФН-γ и 0,125 мкг антимышиного ПЭ-конъюгированного Grz-B или с соответствующими изотипами IgG. Инкубировать клетки в течение 30 мин при температуре 4°С, защищенном от света месте.
    5. После этого дважды промойте клетки в буфере FACS и добавьте к гранулам клеток 100 μL раствора PBS, содержащего изменяемый на жизнеспособность краситель Aqua в конечной концентрации 1 μM в течение 30 минут при RT (как на шаге 2.2.4).
    6. Промойте клетки один раз в PBS и ресуспендируйте их в буфере FACS перед проточным цитометрическим анализом активации CD8 Т-клеток против раковых клеток с помощью mFC. Во время сбора mFC и последующего анализа данных используйте следующую стратегию стробирования:
      1. Определите интересующие ячейки на основе их свойств FSC-A (ось x) и SSC-A (ось y) (вентиль 1). Исключите дублеты и скопления ячеек из анализа, построив графики FSC-A (ось x) и FSC-H (ось y, вентиль 2). Удалите мертвые элементы, нанеся на график площадь фильтра 525/50 нм (ось x) и SSC-A (ось y, затвор 3).
      2. Определение положительного результата клеток для CD8a и CD3 на двухпараметрических графиках плотности с использованием фильтров 660/20 нм и 780/60 нм или 530/30 нм и 575/26 нм (вентиль 4). Наконец, на основе затвора 4 провести дальнейший анализ ячеек на двухпараметрических графиках плотности для маркеров CD44 (фильтр эмиссии 530/30 нм), CD25 (фильтр эмиссии 575/26 нм) и CD69 (фильтр эмиссии 450/50 нм) для маркера CD137 (фильтр эмиссии 660/20 нм), а также для ИФН-γ (фильтр эмиссии 530/30 нм) и Grz-B (фильтр эмиссии 575/26 нм) для смеси А. В и С (Дополнительная таблица 1) соответственно.
        Реактивность опухоли CD8Е-клеток может быть дополнительно проверена путем оценки поверхностной экспрессии лизосомного ассоциированного белка CD107a с помощью специального анализа дегрануляции.
    7. Выполняйте анализ данных.
  4. Исследование CD8 E-клеточного уничтожения опухоли с помощью системы анализа живых клеток и mFC (день 8; Продолжительность: 1 час на стенде, 72 часа на инкубации)
    1. Для анализа на уничтожение опухолей с помощью системы анализа живых клеток дополните среду для совместного культивирования (см. шаг 3.1.6) красителем для количественного определения гибели клеток в реальном времени в конечной концентрации 250 нМ.
    2. После помещения планшетов для совместного культивирования в систему анализа живых клеток дайте планшету нагреться до 37 °C в течение 30 минут перед сканированием. Выполняйте сканирование данных каждые 2 часа до 72 часов для сбора покадровых записей, которые будут проанализированы соответствующим программным обеспечением.
    3. Для анализа на уничтожение опухолей с использованием mFC через 72 ч (см. шаг 3.1.6) собирают и центрифугируют клетки дважды в течение 5 мин при 1100 x g при РТ.
    4. Окрашивают клетки для поверхностных маркеров в 20 мкл холодного буфера FACS, содержащего 0,125 мкг либо контрольного изотипа IgG, либо CD45, конъюгированного против мышей тихоокеанского синего (PB), в 96-луночном U-образном дне, обработанном TC, и инкубируют их в течение 20 мин при 4 °C в темноте. Сразу после этого дважды промойте клетки в буфере FACS и добавьте краситель vitality пропидия йодид (PI) в конечной концентрации 1 мкМ перед проточным цитометрическим анализом. Во время сбора mFC и последующего анализа данных используйте следующую стратегию стробирования:
      1. Определите интересующие ячейки на основе их свойств FSC-A (ось x) и SSC-A (ось y) (вентиль 1). Исключите дублеты и скопления ячеек из анализа, построив графики FSC-A (ось x) и FSC-H (ось y, вентиль 2).
      2. Выявляйте раковые клетки на CD45-негативность с помощью фильтра 450/50 нм (затвор 3). Наконец, проанализируйте ячейки на предмет включения PI в виде средней интенсивности флуоресценции в гистограмме с одним параметром с использованием эмиссионного фильтра 610/620 нм.о.
        Примечание: Гибель раковых клеток также может быть проанализирована путем проведения анализа апоптоза Аннексина V-PI или оценки уровней экспрессии расщепленных каспаз-3 и -7.
    5. Выполняйте анализ данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Статистический анализ был выполнен с использованием программного обеспечения Prism GraphPad v.8.4.0.

Результаты

Способность CD11c+ DCs, широко известного субпопуляции фагоцитов, специализированного для перекрестной презентации21,22 и гейтированного, как показано на рисунке 2A, поглощать апоптотические тельца из УФ-облученных раковых клеток MCA205, ко...

Обсуждение

Мониторинг противоопухолевого иммунного ответа имеет первостепенное значение для выяснения и понимания сложных молекулярных и клеточных взаимодействий, действующих в TME и поддерживающих постоянную борьбу за превосходство23. В этой статье мы подробно описываем простой п?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

A.S. поддерживается AIRC (IG #28807) и PRIN (#P2022YE2MX). М.М. получает стипендию AIRC-FIRC (#25558). A.D.N. поддерживается Инновационной экосистемой Rome Technopole ECS00000024 финансируется ЕС - Next Generation EU, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubes Eppendorf30120086
100 kV e-beam litographyVistec
100 mm Petri dishes Greiner Bio One664160
12-well platesEuroclone ET3012
15 and 50 mL tubesCorning 352096; 352070
40 μm cell strainer Corning CLS431750
5 mL polystyrene tubes Greiner Bio-One120180
70 μm cell strainer Corning CLS431751
75 cm2 cell culture treated flaskEuroclone ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) AntibodyMiltenyi Biotec130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody Miltenyi Biotec130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) AntibodyBioLegend100206
AptesSigma Aldrich440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlugBD Biosciences555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)BD Biosciences555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)BD Biosciences554724
Bovine serum albumin (BSA)US Biological, SalemA1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)eBioscience12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)eBioscience17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)eBioscience25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)eBioscience11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)InvitrogenMCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)eBioscience48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)eBioscience53-0951-82
Cell counting slidesKova International87144E
Chromium quartz masksMB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay KitInvitrogenC10635
CytoFLEX Flow CytometerBeckman Coulter
Dead Cell Removal KitMiltenyi Biotec130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)EuroCloneECB4053L
EDTAInvitrogenAM9260G
Fetal bovine serum (FBS)EuroCloneECS0180L
Flowjo v10.0.7Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)eBioscience12-8898-82
H2O2Sigma Aldrich
H2SO4Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)Thermo Scientific
Ice machineBrema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)eBioscience11-7311-82
Illustrator CC 2015Adobe Systems Inc.
ImageJNational Institute of Health
Incucyte 2022A SoftwareSartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead CellsSartorius4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging MicroscopeBulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)Angelantoni
L-glutamine 200 mMEuroCloneECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitInvitrogenL10119
MACS columnsMiltenyi Biotec130-042-201; 130-042-401 
MACS separatorsMiltenyi Biotec130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell lineSigma-AldrichSCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R MicrocentrifugeThermo Scientific75002552
Microsoft Excel Microsoft, Redmond 
Mouse: C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouseMiltenyi Biotec130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BITNikon Instruments Inc.
Optical litographyEVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfateEuroCloneECB3001D/1
Pipet aidDrummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201
PipettesEppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker KitsSigma-AldrichPKH67GL-1KTfluorescent cell linker  kit
plastic coverslipIBIDI10812
Propidium IodideThermo ScientificP1304MP
Reactive Ion Etching systemOxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)EuroCloneECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)Corning- Millipore-Sigma; St. Louis,
MO		CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge SeriesThermo Scientific75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)EuroClone Spa, Milan, ItalyECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 seriesMicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punchesKai Medical, Tedpella
Sylgard 184Dowsil, Dow Corning101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)eBioscience12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS Sigma Aldrich92360
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol RedEuroCloneECM0920
Vacuum dessicator

Ссылки

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype. Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).
  3. Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure. Cells. 10 (9), 2361 (2021).
  4. Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. The three Es of cancer immunoediting. Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).
  5. Musella, M., et al. Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B. Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).
  6. Anderson, K. G., et al. Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies. J Immunother Cancer. 11 (6), e006533 (2023).
  7. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  8. Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry. Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).
  9. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Front Mol Biosci. 7, 612801 (2020).
  10. Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy. Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).
  11. Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge. Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).
  12. Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. 3D cancer models: One step closer to in vitro human studies. Front Immunol. 14, 1175503 (2023).
  13. De Ninno, A., et al. Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments. JoVE. (170), e61895 (2021).
  14. Mattei, F., et al. Oncoimmunology meets organs-on-chip. Front Mol Biosci. 8, 627454 (2021).
  15. Businaro, L., et al. Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment. Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).
  16. Vacchelli, E., et al. Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1. Science. 350 (6263), 972-978 (2015).
  17. Maulana, T. I., et al. Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy. Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).
  18. Lorenzi, S., et al. Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming. J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).
  19. Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies. Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).
  20. Lucarini, V., et al. Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma. J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).
  21. Gutiérrez-Martínez, E., et al. Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets. Front Immunol. 6, 363 (2015).
  22. Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  23. Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition. Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).
  24. Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI. Front Oncol. 13, 1172314 (2023).
  25. Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
  26. Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research. Clin Transl Med. 12 (1), 696 (2022).
  27. Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics. Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).
  28. Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. Current trends in flow cytometry automated data analysis software. Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).
  29. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены