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Cocultivo de sistemas in vitro para reproducir el ciclo cáncer-inmunidad
En este artículo
Resumen
Aquí, detallamos un protocolo simple, rápido y confiable de citometría de flujo multiparamétrica y asistida por tumores en un chip para monitorear y caracterizar los pasos que constituyen el ciclo de inmunidad al cáncer. De hecho, una comprensión profunda de las interacciones entre el cáncer y las células inmunitarias proporciona información crítica para burlar a los tumores y guiar la atención clínica.
Resumen
La investigación fundamental sobre el cáncer y el desarrollo de terapias eficaces para contrarrestar el ataque se basan en estudios experimentales que detallan las interacciones entre el cáncer y las células inmunitarias, el llamado ciclo cáncer-inmunidad. Los sistemas de cocultivo in vitro combinados con citometría de flujo multiparamétrica (mFC) y dispositivos microfluídicos de tumor en chip (ToC) permiten una monitorización y caracterización sencillas, rápidas y fiables de cada paso del ciclo de inmunidad al cáncer y conducen a la identificación de los mecanismos responsables de inclinar la balanza entre la inmunovigilancia del cáncer y la inmunoevasión. Una comprensión profunda de las interacciones dinámicas entre el cáncer y las células inmunitarias proporciona información crítica para burlar a los tumores y acelerará el ritmo de la personalización y optimización terapéutica en los pacientes. En concreto, detallamos un protocolo sencillo asistido por mFC y ToC para desentrañar las complejidades dinámicas de cada paso del ciclo de inmunidad al cáncer en líneas celulares de cáncer murino y células inmunitarias derivadas de ratones, y nos centramos en la inmunovigilancia. Teniendo en cuenta las características relacionadas con el tiempo y el costo de este protocolo, sin duda es factible a gran escala. Además, con pequeñas variaciones, este protocolo puede adaptarse tanto a líneas celulares de cáncer humano como a células inmunitarias derivadas de sangre periférica humana y combinarse con la inhibición genética y/o farmacológica de vías específicas para identificar biomarcadores de respuesta inmunitaria.
Introducción
En las últimas décadas, la inmunoterapia ha estado a la vanguardia de las opciones de vanguardia para el tratamiento del cáncer. El aprovechamiento del sistema inmunitario con fines antitumorales ha proporcionado una poderosa prueba de concepto para el beneficio del paciente en diversas neoplasias malignas hematológicas y sólidas con pronósticos históricamente malos. A medida que la inmunoterapia ofrece una oportunidad para cánceres que de otro modo serían difíciles de tratar, está experimentando un progreso asombrosamente rápido. Este progreso puede atribuirse, al menos en parte, a la comprensión refinada de la interacción entre las células cancerosas y las células i....
Protocolo
Todos los pasos del protocolo que requieren el uso de animales cumplen con la Directiva de la UE 63/2010 y están incluidos en un protocolo experimental aprobado por el Comité Institucional de Experimentación Animal y el Ministerio de Salud italiano (número de aprobación 858/2015/PR).
1. Preparación de las células cancerosas
- Rutina de cultivo de células cancerosas (día -7; duración: 2 h)
- Cultive células murinas de fibrosarcoma MCA205 en un medio de crecimiento Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% (v/v), 2 mM de L-glutamina, 100 UI/mL de sal sódica de pe....
Resultados Representativos
Se evaluó la capacidad de las CD CD11c+, el subconjunto de fagocitos ampliamente conocido especializado en la presentación cruzada21,22 y activado como se muestra en la Figura 2A, para engullir cuerpos apoptóticos de células cancerosas MCA205 irradiadas con UV que fueron previamente marcadas con el enlazador de células fluorescentes PKH67 mediante mFC. Como era de esperar, las CD CD11c+ capturaron eficiente.......
Discusión
El seguimiento de la respuesta inmunitaria contra el cáncer es de suma importancia para dilucidar y comprender las intrincadas interacciones moleculares y celulares que actúan en la EMT y respaldan una batalla constante por la supremacía23. A continuación, detallamos un protocolo sencillo asistido por mFC y ToC para el seguimiento y la caracterización de los pasos que constituyen el ciclo cáncer-inmunidad. Con pequeñas variaciones, este protocolo, basado en líneas celulares murinas y célu.......
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
A.S. está soportado por AIRC (IG #28807) y por PRIN (#P2022YE2MX). M.M. cuenta con el apoyo de la beca AIRC-FIRC (#25558). A.D.N. cuenta con el apoyo del Ecosistema de Innovación Rome Technopole ECS00000024 financiado por la UE - Next Generation EU, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.
....Materiales
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorf | 30120086 | |
| 100 kV e-beam litography | Vistec | ||
| 100 mm Petri dishes | Greiner Bio One | 664160 | |
| 12-well plates | Euroclone | ET3012 | |
| 15 and 50 mL tubes | Corning | 352096; 352070 | |
| 40 μm cell strainer | Corning | CLS431750 | |
| 5 mL polystyrene tubes | Greiner Bio-One | 120180 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| 75 cm2 cell culture treated flask | Euroclone | ET7076 | |
| Adsorbent wipes | |||
| Allumin foil | |||
| anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-319 | |
| anti-mouse CD25 (7D4) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-118-678 | |
| anti-mouse CD3 (17A2) Antibody | BioLegend | 100206 | |
| Aptes | Sigma Aldrich | 440140 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
| BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological, Salem | A1312 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418) | eBioscience | 12-0114-81 | |
| CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5) | eBioscience | 17-1371-82 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (17A2) | eBioscience | 25-0032-82 | |
| CD44 Monoclonal Antibody (IM7) | eBioscience | 11-0441-82 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | MCD4528 | |
| CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3) | eBioscience | 48-0691-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 11-0081-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7) | eBioscience | 53-0951-82 | |
| Cell counting slides | Kova International | 87144E | |
| Chromium quartz masks | MB W&A, Germany | ||
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10635 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | EuroClone | ECB4053L | |
| EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| Fetal bovine serum (FBS) | EuroClone | ECS0180L | |
| Flowjo v10.0.7 | Flowjo, LLC | ||
| Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB) | eBioscience | 12-8898-82 | |
| H2O2 | Sigma Aldrich | ||
| H2SO4 | Sigma Aldrich | ||
| hotplate | |||
| Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2) | Thermo Scientific | ||
| Ice machine | Brema Ice Makers | ||
| IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2) | eBioscience | 11-7311-82 | |
| Illustrator CC 2015 | Adobe Systems Inc. | ||
| ImageJ | National Institute of Health | ||
| Incucyte 2022A Software | Sartorius | ||
| Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells | Sartorius | 4632 | |
| Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System | Sartorius | ||
| JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope | Bulldog Bio | ||
| Laboratory bench | |||
| Laboratory refrigerator (4°C) | |||
| Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Angelantoni | ||
| L-glutamine 200 mM | EuroClone | ECB3004D | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34957 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L10119 | |
| MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201; 130-042-401 | |
| MACS separators | Miltenyi Biotec | 130-042-10; 130-042-302 | |
| MCA205 mouse fibrosarcoma cell line | Sigma-Aldrich | SCC173 | |
| Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine | |||
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002552 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Redmond | ||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-096-543 | |
| Nikon ECLIPSE Ts2 | Nikon Instruments Inc. | ||
| NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT | Nikon Instruments Inc. | ||
| Optical litography | EVG | ||
| Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate | EuroClone | ECB3001D/1 | |
| Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | |
| Pipettes | Eppendorf | ||
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | PKH67GL-1KT | fluorescent cell linker kit |
| plastic coverslip | IBIDI | 10812 | |
| Propidium Iodide | Thermo Scientific | P1304MP | |
| Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab | ||
| Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | EuroClone | ECB9006L | |
| serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489 | |
| SL 16 Centrifuge Series | Thermo Scientific | 75004031 | |
| Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers | |||
| Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | |
| SU-8 3000 series | MicroChem corp, Newton, (MA) | ||
| Suite of dermal biopsy punches | Kai Medical, Tedpella | ||
| Sylgard 184 | Dowsil, Dow Corning | 101697 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597) | eBioscience | 12-5961-82 | |
| Thermostatic bath | |||
| Timer | |||
| TMCS | Sigma Aldrich | 92360 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA w/ Phenol Red | EuroClone | ECM0920 | |
| Vacuum dessicator |
Referencias
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.
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