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Resumo

Aqui, detalhamos um protocolo simples, rápido e confiável assistido por citometria de fluxo multiparamétrico e tumor em um chip para monitorar e caracterizar as etapas que constituem o ciclo de imunidade ao câncer. De fato, uma compreensão completa das interações entre câncer e células imunológicas fornece insights críticos para superar os tumores e orientar o atendimento clínico.

Resumo

A pesquisa fundamental do câncer e o desenvolvimento de terapias eficazes de contra-ataque dependem de estudos experimentais que detalham as interações entre o câncer e as células imunológicas, o chamado ciclo de imunidade ao câncer. Os sistemas de cocultura in vitro combinados com citometria de fluxo multiparamétrica (mFC) e dispositivos microfluídicos tumor-on-a-chip (ToCs) permitem o monitoramento e a caracterização simples, rápidos e confiáveis de cada etapa do ciclo de imunidade ao câncer e levam à identificação dos mecanismos responsáveis por inclinar o equilíbrio entre a imunovigilância e a imunoevasão do câncer. Uma compreensão completa das interações dinâmicas entre câncer e células imunes fornece insights críticos para superar os tumores e acelerará o ritmo da personalização e otimização terapêutica nos pacientes. Especificamente, aqui detalhamos um protocolo direto assistido por mFC e ToC para desvendar as complexidades dinâmicas de cada etapa do ciclo de imunidade ao câncer em linhagens de células de câncer murino e células imunes derivadas de camundongos e nos concentramos na imunovigilância. Considerando os recursos relacionados ao tempo e ao custo deste protocolo, ele certamente é viável em larga escala. Além disso, com pequenas variações, este protocolo pode ser adaptado a linhagens de células cancerígenas humanas e células imunes derivadas do sangue periférico humano e combinado com inibição genética e/ou farmacológica de vias específicas para identificar biomarcadores de resposta imune.

Introdução

Nas últimas décadas, a imunoterapia tem estado na vanguarda das opções de ponta para o tratamento do câncer. O aproveitamento do sistema imunológico com fins antitumorais forneceu uma poderosa prova de conceito para o benefício do paciente em diversas malignidades hematológicas e sólidas com prognósticos historicamente ruins. Como a imunoterapia está oferecendo uma oportunidade para cânceres difíceis de tratar, ela está experimentando um ritmo surpreendentemente rápido de progresso. Esse progresso pode ser, pelo menos em parte, atribuído à compreensão refinada da interação entre células cancerígenas e células imunológicas. Essa interação se assemelha a um "motor" de alimentação que o sistema imunológico aciona para destruir as células cancerígenas, o chamado ciclo de imunidade ao câncer. Essa resposta imune anticâncer progride em três níveis principais: reconhecimento, processamento e reação. Em primeiro lugar, na fase de reconhecimento, os antígenos tumorais (Ags) produzidos durante a formação do tumor são liberados por células cancerígenas moribundas no microambiente tumoral (TME, etapa 1) e engolidos por células dendríticas infiltrantes de tumor (DCs, etapa 2). Em seguida, na fase de processamento, as DCs apresentam os epítopos dos Ags tumorais capturados através das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), expressam em sua superfície níveis mais altos de moléculas coestimulatórias (etapa 3) e se movem para os linfonodos drenantes de tumor (dLNs) para apresentar sua carga às células T CD8 virgens (CD8N, etapa 4). Todas essas etapas convergem no processo final de reação durante o qual as células T CD8 (CD8CP) específicas do tumor são ativadas, amadurecem em células T CD8 efetoras (CD8E) e sofrem uma expansão clonal (etapa 5). As célulasCD8 E então deixam os dLNs e se casam através do sangue para o TME (etapa 6), onde reconhecem e se ligam especificamente às células cancerígenas por meio da interação entre seu receptor de células T (TCR) e seu tumor cognato Ags, liberam moléculas citotóxicas [ou seja, interferon (IFN)-γ, perforinas e granzimas (Grzs)] e matam as células cancerígenas (etapa 7)1, 2. A morte de células cancerígenas leva à liberação de mais Ags tumorais para alimentar o ciclo de imunidade ao câncer. Na verdade, por meio de todas essas etapas, o sistema imunológico destrói e rejeita as células cancerígenas com muito mais frequência do que se supunha. No entanto, em pacientes com câncer, pelo menos uma dessas etapas não funciona corretamente. Nós e outros mostramos que as células cancerígenas procuram interromper a resposta imune evoluindo para variantes mais agressivas e imunoprivilegiadas 3,4,5 ou prejudicando a eficácia das células T 6,7.

A pesquisa sobre o câncer e o desenvolvimento de medicamentos contra o câncer dependem de modelos experimentais que permitem o estudo da relação entre câncer e células imunes, a chamada onco-imunologia. Aqui são descritos modelos in vitro rápidos, confiáveis, reprodutíveis e de baixo custo que reproduzem de forma abrangente cada etapa do ciclo de onco-imunologia e oferecem uma visão rápida e clara dos conjuntos de características fenotípicas e funcionais da imunovigilância e, eventualmente, da imunoedição.

A citometria de fluxo multiparamétrica (mFC) é uma das ferramentas analíticas de célula única mais bem-sucedidas na pesquisa fundamental do câncer, diagnóstico e pesquisa translacional em ensaios clínicos de câncer. Como permite capturar simultaneamente mais recursos em cada célula, o mFC conquistou seu lugar como uma plataforma de análise padrão-ouro em onco-imunologia. Combina alta sensibilidade e especificidade com a possibilidade de medir vários padrões de expressão de proteínas e propriedades funcionais de forma rápida e reprodutível em um único nível celular a partir de suspensões celulares heterogêneas e até heterotípicas, como as do TME 8,9,10. Como os padrões de expressão fenotípica e funcional são sensíveis ao tempo, a atenção cuidadosa ao design do experimento, a seleção de painéis, controles e anticorpos titulados adequados e o processamento apropriado da amostra e o uso de instrumentação são críticos para a confiabilidade, comparabilidade e reprodutibilidade dos resultados e para interpretar com confiança o resultado do experimento11.

Dispositivos microfluídicos tumorais em um chip (ToCs) modelam o TME, permitindo a biomimética em microescala in vitro da dinâmica e interações do câncer e das células imunes 12,13,14,15. Especificamente, os ToCs são dispositivos de cultura de células microfluídicas multicanais capazes de hospedar diversos tipos de células organizadas em configurações de cultura bidimensionais (2D) ou tridimensionais (3D) e capazes de modelar com alta fidelidade e controlar com alta precisão, unidades estruturais e funcionais importantes, como interações celulares heterotípicas e fluxos de gradientes químicos que ocorrem fisiologicamente no TME12, 13,14,15. Em particular, a quimioatração e as trajetórias imunológicas, bem como a interação das células imunes com as células cancerígenas, podem ser monitoradas em tempo real e quantificadas por microscopia de lapso de tempo e análise de rastreamento automatizada 5,12,13,14,15,16. Além disso, os ToCs oferecem a possibilidade de analisar e manipular processos cruciais que regulam o início e a progressão do câncer e a resposta à terapia17.

Neste artigo, mFC com ToCs são combinados para estudar todos os níveis da resposta imune anticancerígena passando por fagocitose mediada por DC de Ags de câncer (etapas 1-3), cross-priming de células T (etapa 4), ativação e expansão clonal (esta última por meio da tecnologia de cicloadição catalisada por 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) e(I) [clique], uma metodologia altamente sensível e precisa, etapa 5), homing de célulasE CD8 para o TME (etapa 6) e, finalmente, morte de células cancerígenas mediadas por célulasE CD8 (etapa 7, Figura 1).

Este trabalho contribui para o esforço de estabelecer protocolos padrão simples, rápidos e confiáveis para estudar o ciclo de imunidade ao câncer. A melhoria e integração dos modelos mFC e ToC na pesquisa do câncer, dinâmica TME e resposta à terapia têm grande potencial, pois esses modelos fornecem fidelidade biológica junto com o controle experimental. Portanto, este protocolo ajuda a recriar, de maneira gradual, o ciclo de imunidade ao câncer, tornando possível caracterizar, monitorar e manobrar oportunamente os papéis dos atores celulares individuais e suas interações recíprocas na imunovigilância natural e adquirida. Em última análise, isso ajudará a refinar, reduzir e substituir estudos em animais, ao mesmo tempo em que fornece insights críticos para superar tumores e orientar o atendimento clínico. Finalmente, as vantagens e limitações do mFC e do ToC são discutidas criticamente e comparadas com tecnologias de ponta (por exemplo, análises espaciais de alto plex em uma única célula e até mesmo resolução subcelular) para impulsionar a pesquisa e a terapia da onco-imunologia.

Protocolo

Todas as etapas do protocolo que exigem o uso de animais estão em conformidade com a Diretiva da UE 63/2010 e incluídas em um protocolo experimental aprovado pelo Comitê Institucional de Experimentação Animal e pelo Ministério da Saúde italiano (número de aprovação 858/2015/PR).

1. Preparação de células cancerígenas

  1. Rotina de cultura de células cancerígenas (dia -7; duração: 2 h)
    1. Cultive células murinas de fibrossarcoma MCA205 em meio de crescimento Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 UI/mL de sal de sódio de penicilina G, 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina e 50 μg/mL de higromicina (meio de crescimento completo), em uma incubadora de cultura de células umidificada em condições de cultura padrão (37 °C, 5% CO2).
      NOTA: Adapte as condições de cultura de acordo com a linhagem celular de escolha. Em caso de descongelamento, as células precisam de ~ 1 semana de tempo de recuperação para se adaptar às condições ideais de cultura e restabelecer os ciclos celulares normais.
    2. Para otimizar o crescimento da cultura celular, coloque as células em placas emfrascos de 75 cm 2 a uma densidade de 1 x 106 células/mL em 12-15 mL de meio de crescimento completo.
      NOTA: O número de células semeadas pode variar em diferentes linhagens celulares, geralmente dependendo do tamanho específico da célula e do tempo de duplicação. A confluência celular influencia drasticamente o estado das células. Se as células forem pouco ou muito confluentes, podem ocorrer perturbações metabólicas que favorecem a parada proliferativa, a seleção clonal ou o estresse celular. Para células MCA205, a passagem precisa ser realizada duas vezes por semana em uma proporção de divisão de 1:10-1:20.
    3. Quando as culturas de células atingirem uma confluência máxima de 75% a 80%, descarte o meio de crescimento completo da monocamada celular, lave as células com solução salina tamponada com fosfato pré-aquecido (PBS) para remover o FBS e, em seguida, adicione 1,5 mL de tripsina / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25% pré-aquecido por 1-2 min a 37 ° C para separar as células.
      NOTA: O FBS contém inibidores de protease que podem inativar a atividade enzimática da tripsina, portanto, sua remoção completa é uma etapa crucial. O tempo de incubação da tripsina difere dependendo do tipo de célula. Como diretriz geral, evite a incubação a longo prazo de células com alta concentração de tripsina, pois pode listrar as proteínas da superfície celular e desencadear a morte celular. Nesta etapa, verifique o estado de descolamento da célula com um microscópio óptico.
    4. Colete células destacadas em 10 mL de meio de crescimento completo pré-aquecido para inativar a atividade enzimática da tripsina e centrifugue-as por 5 min a 1100 × g à temperatura ambiente (RT). Conte as células em uma lâmina de contagem de células usando o teste de exclusão do corante Trypan Blue e, em seguida, semeire-as novamente após a diluição em suportes apropriados para cultura de manutenção (não mais do que 8 passagens de descongelamento) ou para procedimentos experimentais a jusante, conforme detalhado abaixo.
  2. Morte de células cancerígenas - liberação de Ags de células cancerígenas (dia 0; duração: 30 min)
    1. Para experimentos funcionais a jusante, a placa 3 × 106 células MCA205 em uma placa de Petri tratada com cultura de tecidos de 100 mm em 10 mL de meio de crescimento completo.
      NOTA: Para aplicações experimentais específicas (por exemplo, análise da captação de Ag tumoral mediada por DC), antes de induzir a morte celular, as células cancerígenas foram rotuladas usando um ligante de células fluorescentes (Tabela de Materiais), de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Irradiar as células com luz ultravioleta (UV)18 (ƛ = 254 nm) a uma distância de 9 cm durante 3 min e depois incubá-las a 37 °C, 5% CO2 durante pelo menos 6 h para as deixar morrer.
      NOTA: A morte de células cancerígenas também pode ser induzida por tratamento quimioterápico (por exemplo, drogas imunogênicas ou não imunogênicas5).

2. Co-cultura de células cancerígenas e imunes

  1. Captação e apresentação de Ag de câncer mediada por DC (dia 0; Tempo: 1 h de tempo de bancada, 24 h de tempo de incubação)
    1. Após 4-6 h, coletar DCs, in vitro diferenciadas de células da medula óssea (MO) de camundongos imunocompetentes, conforme descrito anteriormente8, e lavá-las duas vezes por 5 min a 1100 x g em RT em meio de crescimento completo.
      NOTA: As DCs podem, alternativamente, ser isoladas de esplenócitos de camundongos por centrifugação em um gradiente baseado em Histodenz, conforme relatado anteriormente19. Como boa prática, se forem usados DCs criopreservados, certifique-se de pré-aquecer o meio de crescimento completo e complementá-lo com benzonase 1:1000 para evitar a aglomeração celular e, assim, garantir uma boa recuperação após o descongelamento.
    2. Colete células cancerígenas irradiadas por UV da etapa 1.2.2 e centrifugue-as por 5 min a 1100 x g em RT. Conte DCs "vazios" derivados de BM (DCN) como acima (consulte a etapa 1.1.4) e, em seguida, defina a co-cultura com células apoptóticas irradiadas por UV em uma proporção de 2:1 (5 × 105 células MCA205 apoptóticas por 2,5 ×10 5 DCs, conforme otimizado anteriormente8) em placas de 12 poços em 1 mL de meio de crescimento completo fresco por 24 h a 37 °C, 5% CO2. Como controles experimentais, incubar células a 4 ° C, uma condição na qual a fagocitose é dificultada.
      NOTA: Não aumente a superfície e o volume da cocultura, pois isso pode dificultar as interações apoptóticas entre células cancerígenas e DC e, assim, impedir a fagocitose ideal e eficaz. Além disso, estudos para otimizar a relação célula cancerígena:DC precisam ser realizados se outros modelos de células cancerígenas forem usados.
  2. Avaliação da captação de Ag do câncer por mFC (dia 1; duração: 2 h)
    1. Após 24 h de incubação, colete as células em tubos de 15 mL e lave-as duas vezes por 5 min a 1100 x g em RT em 10 mL de meio de crescimento completo.
      NOTA: Para reduzir o ruído de fundo das células apoptóticas presas à membrana DC e ainda não completamente engolfadas, os pellets celulares são incubados por 5 min em RT com 0,1 M EDTA. As suspensões celulares (contendo aproximadamente 2 x 106 células) são então centrifugadas duas vezes com 10 ml de meio de crescimento, como no passo 2.2.1.
    2. Para coloração da superfície celular, ressuspenda DCs derivadas de BM em 20 μL de tampão de classificação de células ativadas por fluorescência fria (FACS) (1% FBS, 0,1 M EDTA em PBS) contendo 0,5 μg de controle de isotipo IgG ou CD11c conjugado com ficoeritrina (PE) anti-camundongo em uma microplaca tratada com cultura de tecido inferior em forma de U de 96 poços e incube-os por 20 min a 4 ° C no escuro para preservar o sinal de fluorocromo e evitar o fotobranqueamento.
      NOTA: Uma vez que ocorre a captação do antígeno do câncer, a ativação "completa" do DC (DCPHAGO) também pode ser verificada verificando os níveis de expressão das moléculas coestimulatórias (ou seja, CD80 ou CD86 e MHC-II e do ligante de checkpoint imunológico do antígeno CD274 [mais conhecido como PDL1]). Como regra geral, para um desempenho ideal do citômetro de fluxo, a concentração de anticorpos precisa ser cuidadosamente titulada e o número de células precisa variar de 1 x 105 a 1 x 108 células/teste.
    3. Em seguida, lave as células duas vezes em tampão FACS e adicione 100 μL de uma solução de PBS contendo um corante de infravermelho próximo (IR) fixável por vitalidade a uma concentração final de 1 μM por 30 min em RT.
      NOTA: Como alternativa, outros corantes fixáveis de vitalidade (por exemplo, Violeta, Azul, Laranja, Lima, Aqua) que não se sobreponham às emissões de fluorescência usadas podem ser usados.
    4. Lave as células uma vez em PBS e ressuspenda-as em tampão FACS antes da análise citométrica de fluxo dos níveis de CD11c e PKH67 por meio de mFC. Durante a aquisição do mFC e, em seguida, na análise de dados, prossiga com a seguinte estratégia de gating:
      1. Identifique as células de interesse com base em suas propriedades de área de dispersão direta (FSC-A, eixo x) e área de dispersão lateral (SSC-A, eixo y) (porta 1). Exclua os dupletos e aglomerados de células da análise traçando FSC-A (eixo x) e a altura de dispersão direta (FSC-H, eixo y, porta 2).
      2. Remover as células mortas traçando a área do filtro passa-banda de emissão (pb) de 780/60 nm (eixo x) e SSC-A (eixo y, porta 3). Finalmente, com base na porta 3, detecte a positividade celular para o marcador CD11c e o ligante de células fluorescentes PKH67 em gráficos de densidade de dois parâmetros usando filtros bp de emissão de 575/26 nm e 530/30 nm, respectivamente.
    5. Realize a análise de dados.
      NOTA: Certifique-se de combinar anticorpos para garantir uma rotulagem fácil e eficiente com comprimentos de onda de emissão bem separados. Isso simplifica a configuração de compensação para os fluoróforos usados e permite uma quantificação fácil, rápida e confiável dos parâmetros de interesse.
  3. Priming e ativação de células T CD8 (dia 1; Duração: 1 h de tempo de bancada, 72-96 h de tempo de incubação)
    1. Purificar as células T CD8 esplênicas murinas (CD8N) conforme descrito anteriormente8.
    2. Contar e ressuspender as células T CD8 isoladas em 500 μL de meio de crescimento completo fresco e cultivá-las com DCs derivadas de BM que anteriormente absorveram células MCA205 apoptóticas em uma proporção de 2,5: 1 (2,5 × 105 DCs para células T de 1 × 105 , conforme otimizado anteriormente8) por 72 h em placas de 12 poços em um volume final de 1,5 mL a 37 ° C, 5% CO2.
      NOTA: Para enfatizar os resultados experimentais, diferentes proporções de cultura de células foram testadas e a melhor foi escolhida.
  4. Análise da proliferação de células T CD8 pelo ensaio EdU mFC (dia 4; Duração: 15 min de tempo de bancada, 16-20 h de incubação)
    1. Adicione o análogo de nucleosídeo à timidina EdU ao meio de co-cultura a uma concentração final de 10 μM e misture bem.
      NOTA: Como as condições de cultura, as variações do tipo de célula e a densidade celular podem afetar a incorporação de EdU no DNA, teste uma variedade de concentrações de EdU e tempos de incubação em experimentos piloto. Incubações mais longas ou mais curtas podem exigir concentrações mais baixas ou mais altas, respectivamente. Inclua células da mesma população que não foram tratadas com EdU como um controle de coloração negativo.
    2. Após 16-20 h, recupere e centrifugue CD8C-P duas vezes por 5 min a 1100 x g em RT.
    3. Manchar as células para marcadores de superfície em 20 μL de tampão FACS frio suplementado com 0,5 μg de CD8a conjugado com isotiocianato de fluoresceína anti-camundongo (FITC) e 0,25 μg de CD3 conjugado com PE anti-camundongo ou com os respectivos controles de isotipo IgG em uma microplaca tratada com TC de fundo em forma de U de 96 poços e incubá-los por 20 min a 4 ° C no escuro.
      NOTA: Para evitar qualquer interferência, recomenda-se não usar conjugados de anticorpos Qdot antes de realizar a reação de clique.
    4. Lave as células duas vezes em tampão FACS (como na etapa 2.2.3) e ressuspenda os grânulos celulares em 100 μL de uma solução PBS contendo o corante Aqua fixável de vitalidade a uma concentração final de 1 μM por 30 min em RT.
      1. Transfira as suspensões celulares para tubos de fluxo, lave-as uma vez com 3 mL de albumina de soro bovino a 1% (BSA) em PBS e prossiga com a fixação celular em 100 μL de um fixador (ou seja, paraformaldeído a 4% em PBS) por 15 min em RT, protegido da luz.
      2. Imediatamente após, lave as células uma vez com 3 mL de BSA a 1% em PBS, incube-as em 100 μL de uma solução contendo 1x permeabilização à base de saponina e reagente de lavagem por 15 min em RT e, em seguida, vá diretamente para a reação de marcação.
        NOTA: 1x reagente de permeabilização e lavagem à base de saponina é preparado diluindo um volume de 10x solução 1:10 com 1% de BSA em PBS. Este reagente também pode ser usado com suspensões celulares contendo sangue total ou glóbulos vermelhos, pois preserva as características morfológicas de dispersão de luz dos leucócitos enquanto lisa os glóbulos vermelhos.
      3. De acordo com o número de amostras a serem analisadas, prepare o coquetel de reação misturando suave e sequencialmente os volumes indicados de PBS, catalisador protetor de cobre, picolil azida conjugada com Alexa Fluor (AF) 647 e 1x aditivo tampão EdU.
        1. Use o coquetel de reação dentro de 15 minutos após a preparação. Adicione 500 μL da mistura de reação a cada tubo, misture bem e incube por 30 min em RT no escuro.
      4. Lave as células uma vez com 3 mL de permeabilização 1x à base de saponina e reagente de lavagem e ressuspenda-as em 100 μL da mesma solução antes de prosseguir com os métodos padrão de mFC para determinar a porcentagem de CD8CP de proliferação da fase S na população de células por meio de mFC. Durante a aquisição do mFC e, em seguida, na análise de dados, prossiga com a seguinte estratégia de gating:
        1. Identifique as células de interesse com base em suas propriedades FSC-A (eixo x) e SSC-A (eixo y) (porta 1). Exclua os dupletos e aglomerados de células da análise plotando FSC-A (eixo x) e FSC-H (eixo y, porta 2). Remover as células mortas traçando a área do filtro bp de emissão de 525/50 nm (eixo x) e SSC-A (eixo y, porta 3).
        2. Detectar a positividade celular para CD8a e CD3 em gráficos de densidade de dois parâmetros usando filtros de emissão bp de 530/30 nm e 575/26 nm, respectivamente (porta 4). Finalmente, com base na porta 4, analise ainda mais as células para incorporação de AF647-EdU como intensidade fluorescente média em um histograma de parâmetro único usando um filtro de emissão de 660/620 nm bp.
          NOTA: O sinal fluorescente gerado pela marcação EdU é melhor detectado usando uma baixa taxa de fluxo durante a aquisição.
      5. Realize a análise de dados.

3. Reestimulação de CD8C-P com células cancerígenas

  1. CD8 C-P reconhece células cancerígenas vivas (dia 4; Duração: 1 h de tempo de bancada, 48-72 h de incubação)
    1. Recupere CD8C-P da co-cultura (consulte a etapa 2.3.2) e centrifugue-os por 10 min a 1100 x g em RT em 10 mL de meio de crescimento completo.
      NOTA: Nesta etapa, verifique a diferenciação de células T CD8 verificando os níveis de expressão do marcador de ativação CD95.
    2. Ressuspenda os grânulos celulares, contendo aproximadamente 2,5 × 106 células, em 100 μL de microesferas de remoção de células mortas por 1 x 107 células totais.
      NOTA: Para números de células mais altos, aumente os volumes de reagente e total de acordo.
    3. Misture bem e incube por 15 min em RT.
      NOTA: Se necessário, o volume da amostra é ajustado adicionando 1x tampão de ligação, de acordo com as instruções do fabricante, para atingir um mínimo de 500 μL necessários para a separação magnética.
    4. Imediatamente depois, prossiga com a separação subsequente da célula magnética. Coloque as colunas de separação no campo magnético de um separador adequado e lave-as com a quantidade apropriada de 1x tampão de ligação. Transferir as suspensões de células para colunas de separação e recolher o fluxo que contém a fracção de células vivas não marcadas.
    5. Lave as colunas novamente com a quantidade apropriada de 1x buffer de associação. Colete as células não marcadas que passam e combine-as com o efluente da etapa 3.1.4.
      NOTA: Para aumentar a eficiência da remoção magnética de células mortas, a fração de células vivas pode ser enriquecida em um segundo procedimento de separação, conforme descrito nas etapas 3.1.1-3.1.5, usando uma nova coluna.
    6. Centrifugue CD8C-P vivo enriquecido por 5 min a 1100 x g em RT em meio de crescimento completo antes da contagem de células e, em seguida, cultive-os com células MCA205 frescas na proporção de 2: 1 (1 x 105 células T CD8 para 5 x 104 células MCA205, conforme otimizado anteriormente8) em 12 placas de poço em um volume final de 1 mL. Após a semeadura celular, coloque placas de cocultura em uma incubadora de cultura de células umidificadas ou em um sistema de análise de células vivas por 72 h a 37 ° C, 5% de CO2, antes de prosseguir com os ensaios a jusante.
  2. Tráfego de células T CD8 em direção a células cancerígenas em modelos microfluídicos ToC (dia 5; Duração: 2 h de tempo de bancada, 72 h de incubação)
    1. Esterilize dispositivos microfluídicos ToC fabricados ad hoc 13,20 sob um gabinete UV por 20 min, lave duas vezes com PBS e depois incube com meio de crescimento completo por pelo menos 1 h.
      NOTA: As células MCA205 e CD8CP não são coradas neste protocolo; no entanto, ambos podem ser rotulados com rastreadores de células fluorescentes compatíveis com o vivo.
    2. Ressuspenda suavemente 1 × 105 células MCA205 em 15 μL de meio de crescimento completo, tendo o cuidado de obter uma distribuição celular homogênea, e injete-as lentamente nas câmaras de chip do lado esquerdo (câmara tumoral) conforme descrito anteriormente. Aguarde de 5 a 10 minutos para permitir que as células cancerígenas adiram ao porão do chip.
      1. Verifique a distribuição correta e homogênea das células cancerígenas no chip microfluídico ao microscópio. Os resultados experimentais podem ser afetados pela presença de bolhas.
    3. Ressuspender 1 x 106 CD8C-P em 50 μL de meio de crescimento completo. Pipete suavemente a suspensão de células imunes nas câmaras de chips do lado direito (câmara imunológica).
      NOTA: Nesta etapa, use um microscópio para confirmar se as células imunes estão distribuídas na câmara intermediária, criando uma "frente", que representa o ponto de partida do experimento.
    4. Para evitar flutuações de pressão e microfluídicas, encha cuidadosamente todos os reservatórios de cavacos conforme indicado anteriormente13 com até 150 μL de meio de crescimento completo e coloque os cavacos montados em uma superfície nivelada em uma incubadora de cultura de células humificada a 37 ° C, 5% de CO2 por pelo menos 1 h para estabilizar o sistema antes dos registros de lapso de tempo.
      NOTA: Verifique cuidadosamente as perdas potenciais por evaporação de volumes nos dois reservatórios de cada câmara de cavacos e compense-as adicionando meio fresco a cada 2 a 3 dias. Se necessário, até 100 μL de sobrenadantes podem ser aspirados de cada compartimento celular para realizar o perfil de citocinas.
    5. Use microscopia de vídeo equipada com um sistema de incubação para registrar séries de imagens de campo claro da matriz de microcanais entre as regiões direita e esquerda do dispositivo contendo MCA205 e células imunes, respectivamente, e para visualizar a dinâmica da infiltração de células imunes e interação célula imune-célula cancerígena.
      NOTA: No cenário experimental aqui utilizado, os registros de lapso de tempo das células foram coletados na incubadora por 72 h com um microscópio que adquiriu uma microfotografia a cada 2 min. Otimize as condições de imagem para evitar a exposição excessiva à foto e ter uma alta taxa de quadros de aquisição para realizar facilmente análises de rastreamento de células imunes a jusante. Ao final do lapso de tempo, realize a análise de rastreamento semiautomática 13,20.
  3. Avaliação da citometria de fluxo de ativação e reatividade tumoral de CD8E (dia 7 e 8; Duração: 2 h)
    1. Após 48 e 72 h de incubação (ver passo 3.1.6), recupere CD8E e centrifugue duas vezes durante 5 min a 1100 x g à RT.
      NOTA: Para avaliar os níveis intracelulares de moléculas citotóxicas produzidas por CD8E (ou seja, IFN-γ e Grz-B), as co-culturas de células imunes ao câncer foram previamente incubadas por pelo menos 6 h com 1:1000 brefeldina A e 1:1500 monensina.
    2. Para coloração da superfície celular, ressuspenda as células em 20 μL de três misturas diferentes de anticorpos primários preparados em tampão FACS frio, como na Tabela Suplementar 1.
      NOTA: Para garantir a especificidade da ligação dos anticorpos, realizar experiências de mFC na presença de controlos de isotipo IgG adequados, como indicado no passo 2.2.2.
    3. Incube as células em uma microplaca tratada com cultura de tecidos de fundo em forma de U de 96 poços por 20 min a 4 ° C, protegida da luz. Para pellets de células das misturas A e B (Tabela Suplementar 1), prossiga diretamente para a etapa 3.3.5.
    4. Após uma lavagem rápida, adicione 100 μL de solução de fixação/permeabilização aos pellets de células da mistura C (Tabela Suplementar 1). Após incubação de 20 min a 4° C no escuro, lave as células duas vezes em 200 μL de permeabilização a frio/tampão de lavagem e ressuspenda-as em 20 μL de tampão de permeabilização/lavagem a frio contendo 0,25 μg de IFN-γ conjugado com FITC anti-camundongo e 0,125 μg de Grz-B conjugado com PE anti-camundongo ou com os respectivos isotipos de IgG. Incube as células por 30 min a 4° C, protegidas da luz.
    5. Em seguida, lave as células duas vezes em tampão FACS e adicione às pastilhas 100 μL de uma solução de PBS contendo o corante Aqua fixável por vitalidade a uma concentração final de 1 μM por 30 min em RT (como na etapa 2.2.4).
    6. Lave as células uma vez em PBS e ressuspenda-as em tampão FACS antes da análise citométrica de fluxo da ativação de células T CD8 contra células cancerígenas por meio de um mFC. Durante a aquisição do mFC e, em seguida, na análise de dados, prossiga com a seguinte estratégia de gating:
      1. Identifique as células de interesse com base em suas propriedades FSC-A (eixo x) e SSC-A (eixo y) (porta 1). Exclua os dupletos e aglomerados de células da análise plotando FSC-A (eixo x) e FSC-H (eixo y, porta 2). Remover as células mortas traçando a área do filtro bp de emissão de 525/50 nm (eixo x) e SSC-A (eixo y, porta 3).
      2. Detectar a positividade celular para CD8a e CD3 em gráficos de densidade de dois parâmetros usando filtros de emissão bp de 660/20 nm e 780/60 nm ou 530/30 nm e 575/26 nm (porta 4). Finalmente, com base na porta 4, analise ainda mais as células em gráficos de densidade de dois parâmetros para CD44 (filtro de pb de emissão de 530/30 nm), CD25 (filtro de pb de emissão de 575/26 nm) e CD69 (filtro de pb de emissão de 450/50 nm) para marcadores de CD137 (filtro de pb de emissão de 660/20 nm) e para IFN-γ (filtro de pb de emissão de 530/30 nm) e Grz-B (filtro de pb de emissão de 575/26 nm) para a mistura A, B e C (Tabela Suplementar 1), respectivamente.
        NOTA: A reatividade tumoral das célulasCD8 E pode ser testada avaliando a expressão superficial da proteína associada ao lisossomo CD107a por meio de um ensaio de degranulação ad hoc .
    7. Realize a análise de dados.
  4. Investigação de morte de tumor mediada por células CD8E por sistema de análise de células vivas e mFC (dia 8; Duração: 1 h de tempo de bancada, 72 h de incubação)
    1. Para o ensaio de eliminação de tumores por meio de um sistema de análise de células vivas, complementar o meio de cocultura (ver passo 3.1.6) com um corante de quantificação da morte celular em tempo real a uma concentração final de 250 nM.
    2. Depois de colocar as placas de cocultura no sistema de análise de células vivas, deixe a placa aquecer a 37 °C durante 30 minutos antes da digitalização. Realize a varredura de dados a cada 2 h até 72 h para coletar gravações de lapso de tempo, que serão analisadas por softwares próprios.
    3. Para o ensaio de eliminação de tumor usando mFC, 72 h depois (consulte a etapa 3.1.6), colha e centrifugue as células duas vezes por 5 min a 1100 x g em RT.
    4. Células de coloração para marcadores de superfície em 20 μL de tampão FACS frio contendo 0,125 μg de controle de isotipo IgG ou CD45 conjugado com azul pacífico (PB) anti-camundongo em uma microplaca tratada com TC de fundo em forma de U de 96 poços e incubá-los por 20 min a 4 ° C no escuro. Imediatamente após, lave as células duas vezes em tampão FACS e adicione o corante vitalidade iodeto de propídio (PI) a uma concentração final de 1 μM antes da análise por citometria de fluxo. Durante a aquisição do mFC e, em seguida, na análise de dados, prossiga com a seguinte estratégia de gating:
      1. Identifique as células de interesse com base em suas propriedades FSC-A (eixo x) e SSC-A (eixo y) (porta 1). Exclua os dupletos e aglomerados de células da análise plotando FSC-A (eixo x) e FSC-H (eixo y, porta 2).
      2. Detecte células cancerígenas quanto à negatividade de CD45 usando um filtro bp de emissão de 450/50 nm (porta 3). Finalmente, analise as células quanto à incorporação de PI como intensidade fluorescente média em um histograma de parâmetro único usando um filtro de emissão de 610/620 nm bp.
        NOTA: A morte de células cancerígenas também pode ser analisada realizando o ensaio de apoptose de anexina V-PI ou avaliando os níveis de expressão de Caspase-3 e -7 clivadas.
    5. Realize a análise de dados.
      NOTA: As análises estatísticas foram realizadas usando o software Prism GraphPad v.8.4.0.

Resultados

A capacidade das DCs CD11c +, o subconjunto de fagócitos amplamente conhecido especializado para apresentação cruzada21,22 e fechado conforme mostrado na Figura 2A, de engolir corpos apoptóticos de células cancerígenas MCA205 irradiadas por UV que foram previamente marcadas com o ligante de células fluorescentes PKH67 foi avaliada por mFC. Como esperado, as DCs CD11c + capturaram eficientemente células M...

Discussão

O monitoramento da resposta imune anticancerígena é de extrema importância para elucidar e compreender as intrincadas interações moleculares e celulares que atuam no TME e apoiam uma batalha constante pela supremacia23. Aqui, detalhamos um protocolo simples assistido por mFC e ToC para o monitoramento e caracterização das etapas que constituem o ciclo de imunidade ao câncer. Com pequenas variações, este protocolo, baseado em linhagens celulares murinas e células imunes derivadas de camu...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

A AS é apoiada pelo AIRC (IG # 28807) e pelo PRIN (#P2022YE2MX). MM é apoiado pela bolsa AIRC-FIRC (# 25558). A A.D.N. é apoiada pelo Ecossistema de Inovação Rome Technopole ECS00000024 financiado pela UE - Next Generation EU, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubes Eppendorf30120086
100 kV e-beam litographyVistec
100 mm Petri dishes Greiner Bio One664160
12-well platesEuroclone ET3012
15 and 50 mL tubesCorning 352096; 352070
40 μm cell strainer Corning CLS431750
5 mL polystyrene tubes Greiner Bio-One120180
70 μm cell strainer Corning CLS431751
75 cm2 cell culture treated flaskEuroclone ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) AntibodyMiltenyi Biotec130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody Miltenyi Biotec130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) AntibodyBioLegend100206
AptesSigma Aldrich440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlugBD Biosciences555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)BD Biosciences555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)BD Biosciences554724
Bovine serum albumin (BSA)US Biological, SalemA1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)eBioscience12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)eBioscience17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)eBioscience25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)eBioscience11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)InvitrogenMCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)eBioscience48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)eBioscience53-0951-82
Cell counting slidesKova International87144E
Chromium quartz masksMB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay KitInvitrogenC10635
CytoFLEX Flow CytometerBeckman Coulter
Dead Cell Removal KitMiltenyi Biotec130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)EuroCloneECB4053L
EDTAInvitrogenAM9260G
Fetal bovine serum (FBS)EuroCloneECS0180L
Flowjo v10.0.7Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)eBioscience12-8898-82
H2O2Sigma Aldrich
H2SO4Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)Thermo Scientific
Ice machineBrema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)eBioscience11-7311-82
Illustrator CC 2015Adobe Systems Inc.
ImageJNational Institute of Health
Incucyte 2022A SoftwareSartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead CellsSartorius4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging MicroscopeBulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)Angelantoni
L-glutamine 200 mMEuroCloneECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitInvitrogenL10119
MACS columnsMiltenyi Biotec130-042-201; 130-042-401 
MACS separatorsMiltenyi Biotec130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell lineSigma-AldrichSCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R MicrocentrifugeThermo Scientific75002552
Microsoft Excel Microsoft, Redmond 
Mouse: C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouseMiltenyi Biotec130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BITNikon Instruments Inc.
Optical litographyEVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfateEuroCloneECB3001D/1
Pipet aidDrummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201
PipettesEppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker KitsSigma-AldrichPKH67GL-1KTfluorescent cell linker  kit
plastic coverslipIBIDI10812
Propidium IodideThermo ScientificP1304MP
Reactive Ion Etching systemOxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)EuroCloneECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)Corning- Millipore-Sigma; St. Louis,
MO		CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge SeriesThermo Scientific75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)EuroClone Spa, Milan, ItalyECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 seriesMicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punchesKai Medical, Tedpella
Sylgard 184Dowsil, Dow Corning101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)eBioscience12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS Sigma Aldrich92360
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol RedEuroCloneECM0920
Vacuum dessicator

Referências

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