Entrar
É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.
Sistemas de co-cultura in vitro para reproduzir o ciclo de imunidade ao câncer
Neste Artigo
Resumo
Aqui, detalhamos um protocolo simples, rápido e confiável assistido por citometria de fluxo multiparamétrico e tumor em um chip para monitorar e caracterizar as etapas que constituem o ciclo de imunidade ao câncer. De fato, uma compreensão completa das interações entre câncer e células imunológicas fornece insights críticos para superar os tumores e orientar o atendimento clínico.
Resumo
A pesquisa fundamental do câncer e o desenvolvimento de terapias eficazes de contra-ataque dependem de estudos experimentais que detalham as interações entre o câncer e as células imunológicas, o chamado ciclo de imunidade ao câncer. Os sistemas de cocultura in vitro combinados com citometria de fluxo multiparamétrica (mFC) e dispositivos microfluídicos tumor-on-a-chip (ToCs) permitem o monitoramento e a caracterização simples, rápidos e confiáveis de cada etapa do ciclo de imunidade ao câncer e levam à identificação dos mecanismos responsáveis por inclinar o equilíbrio entre a imunovigilância e a imunoevasão do câncer. Uma compreensão completa das interações dinâmicas entre câncer e células imunes fornece insights críticos para superar os tumores e acelerará o ritmo da personalização e otimização terapêutica nos pacientes. Especificamente, aqui detalhamos um protocolo direto assistido por mFC e ToC para desvendar as complexidades dinâmicas de cada etapa do ciclo de imunidade ao câncer em linhagens de células de câncer murino e células imunes derivadas de camundongos e nos concentramos na imunovigilância. Considerando os recursos relacionados ao tempo e ao custo deste protocolo, ele certamente é viável em larga escala. Além disso, com pequenas variações, este protocolo pode ser adaptado a linhagens de células cancerígenas humanas e células imunes derivadas do sangue periférico humano e combinado com inibição genética e/ou farmacológica de vias específicas para identificar biomarcadores de resposta imune.
Introdução
Nas últimas décadas, a imunoterapia tem estado na vanguarda das opções de ponta para o tratamento do câncer. O aproveitamento do sistema imunológico com fins antitumorais forneceu uma poderosa prova de conceito para o benefício do paciente em diversas malignidades hematológicas e sólidas com prognósticos historicamente ruins. Como a imunoterapia está oferecendo uma oportunidade para cânceres difíceis de tratar, ela está experimentando um ritmo surpreendentemente rápido de progresso. Esse progresso pode ser, pelo menos em parte, atribuído à compreensão refinada da interação entre células cancerígenas e células imunológicas. Essa interação se assemelha a um "motor" de a....
Protocolo
Todas as etapas do protocolo que exigem o uso de animais estão em conformidade com a Diretiva da UE 63/2010 e incluídas em um protocolo experimental aprovado pelo Comitê Institucional de Experimentação Animal e pelo Ministério da Saúde italiano (número de aprovação 858/2015/PR).
1. Preparação de células cancerígenas
- Rotina de cultura de células cancerígenas (dia -7; duração: 2 h)
- Cultive células murinas de fibrossarcoma MCA205 em meio de crescimento Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 UI/mL de sal de sódio de penicilina ....
Resultados Representativos
A capacidade das DCs CD11c +, o subconjunto de fagócitos amplamente conhecido especializado para apresentação cruzada21,22 e fechado conforme mostrado na Figura 2A, de engolir corpos apoptóticos de células cancerígenas MCA205 irradiadas por UV que foram previamente marcadas com o ligante de células fluorescentes PKH67 foi avaliada por mFC. Como esperado, as DCs CD11c + capturaram eficientemente células M.......
Discussão
O monitoramento da resposta imune anticancerígena é de extrema importância para elucidar e compreender as intrincadas interações moleculares e celulares que atuam no TME e apoiam uma batalha constante pela supremacia23. Aqui, detalhamos um protocolo simples assistido por mFC e ToC para o monitoramento e caracterização das etapas que constituem o ciclo de imunidade ao câncer. Com pequenas variações, este protocolo, baseado em linhagens celulares murinas e células imunes derivadas de camu.......
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
A AS é apoiada pelo AIRC (IG # 28807) e pelo PRIN (#P2022YE2MX). MM é apoiado pela bolsa AIRC-FIRC (# 25558). A A.D.N. é apoiada pelo Ecossistema de Inovação Rome Technopole ECS00000024 financiado pela UE - Next Generation EU, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.
....Materiais
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorf | 30120086 | |
| 100 kV e-beam litography | Vistec | ||
| 100 mm Petri dishes | Greiner Bio One | 664160 | |
| 12-well plates | Euroclone | ET3012 | |
| 15 and 50 mL tubes | Corning | 352096; 352070 | |
| 40 μm cell strainer | Corning | CLS431750 | |
| 5 mL polystyrene tubes | Greiner Bio-One | 120180 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| 75 cm2 cell culture treated flask | Euroclone | ET7076 | |
| Adsorbent wipes | |||
| Allumin foil | |||
| anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-319 | |
| anti-mouse CD25 (7D4) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-118-678 | |
| anti-mouse CD3 (17A2) Antibody | BioLegend | 100206 | |
| Aptes | Sigma Aldrich | 440140 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
| BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological, Salem | A1312 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418) | eBioscience | 12-0114-81 | |
| CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5) | eBioscience | 17-1371-82 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (17A2) | eBioscience | 25-0032-82 | |
| CD44 Monoclonal Antibody (IM7) | eBioscience | 11-0441-82 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | MCD4528 | |
| CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3) | eBioscience | 48-0691-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 11-0081-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7) | eBioscience | 53-0951-82 | |
| Cell counting slides | Kova International | 87144E | |
| Chromium quartz masks | MB W&A, Germany | ||
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10635 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | EuroClone | ECB4053L | |
| EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| Fetal bovine serum (FBS) | EuroClone | ECS0180L | |
| Flowjo v10.0.7 | Flowjo, LLC | ||
| Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB) | eBioscience | 12-8898-82 | |
| H2O2 | Sigma Aldrich | ||
| H2SO4 | Sigma Aldrich | ||
| hotplate | |||
| Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2) | Thermo Scientific | ||
| Ice machine | Brema Ice Makers | ||
| IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2) | eBioscience | 11-7311-82 | |
| Illustrator CC 2015 | Adobe Systems Inc. | ||
| ImageJ | National Institute of Health | ||
| Incucyte 2022A Software | Sartorius | ||
| Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells | Sartorius | 4632 | |
| Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System | Sartorius | ||
| JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope | Bulldog Bio | ||
| Laboratory bench | |||
| Laboratory refrigerator (4°C) | |||
| Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Angelantoni | ||
| L-glutamine 200 mM | EuroClone | ECB3004D | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34957 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L10119 | |
| MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201; 130-042-401 | |
| MACS separators | Miltenyi Biotec | 130-042-10; 130-042-302 | |
| MCA205 mouse fibrosarcoma cell line | Sigma-Aldrich | SCC173 | |
| Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine | |||
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002552 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Redmond | ||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-096-543 | |
| Nikon ECLIPSE Ts2 | Nikon Instruments Inc. | ||
| NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT | Nikon Instruments Inc. | ||
| Optical litography | EVG | ||
| Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate | EuroClone | ECB3001D/1 | |
| Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | |
| Pipettes | Eppendorf | ||
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | PKH67GL-1KT | fluorescent cell linker kit |
| plastic coverslip | IBIDI | 10812 | |
| Propidium Iodide | Thermo Scientific | P1304MP | |
| Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab | ||
| Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | EuroClone | ECB9006L | |
| serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489 | |
| SL 16 Centrifuge Series | Thermo Scientific | 75004031 | |
| Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers | |||
| Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | |
| SU-8 3000 series | MicroChem corp, Newton, (MA) | ||
| Suite of dermal biopsy punches | Kai Medical, Tedpella | ||
| Sylgard 184 | Dowsil, Dow Corning | 101697 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597) | eBioscience | 12-5961-82 | |
| Thermostatic bath | |||
| Timer | |||
| TMCS | Sigma Aldrich | 92360 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA w/ Phenol Red | EuroClone | ECM0920 | |
| Vacuum dessicator |
Referências
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.
Reimpressões e Permissões
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE
Solicitar PermissãoThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados
Usamos cookies para melhorar sua experiência em nosso site.
Ao continuar usando nosso site ou clicando em 'continuar', você concorda em aceitar nossos cookies.