암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템

요약

여기에서는 암-면역 주기를 구성하는 단계를 모니터링하고 특성화하기 위한 간단하고 빠르며 신뢰할 수 있는 다중 파라메트릭 유세포 분석 및 종양 온 칩 지원 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 실제로, 암과 면역 세포 간의 상호 작용에 대한 철저한 이해는 종양을 능가하고 임상 치료를 안내하는 데 중요한 통찰력을 제공합니다.

초록

근본적인 암 연구와 효과적인 반격 요법의 개발은 모두 암과 면역 세포 간의 상호 작용, 이른바 암-면역 주기를 자세히 설명하는 실험적 연구에 의존합니다. mFC(Multiparametric Flow Cytometry) 및 ToC(tumor-on-a-chip microfluidic devices)와 결합된 체외 공동 배양 시스템은 암 면역 주기의 각 단계에 대한 간단하고 빠르며 신뢰할 수 있는 모니터링 및 특성 분석을 가능하게 하며 암 면역 감시와 면역 회피 간의 균형을 유지하는 메커니즘을 식별할 수 있도록 합니다. 암과 면역 세포 간의 역동적인 상호 작용에 대한 철저한 이해는 종양을 능가하는 데 중요한 통찰력을 제공하고 환자의 치료 개인화 및 최적화 속도를 가속화할 것입니다. 특히, 여기에서는 쥐 암 세포주와 마우스 유래 면역 세포에서 암 면역 주기의 각 단계의 동적 복잡성을 밝히고 면역 감시에 중점을 두기 위한 간단한 mFC 및 ToC 지원 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜의 시간 및 비용 관련 기능을 고려할 때 대규모로 확실히 실현 가능합니다. 더욱이, 약간의 변형을 통해 이 프로토콜은 인간 암 세포주와 인간 말초 혈액 유래 면역 세포에 모두 적용할 수 있으며, 면역 반응의 바이오마커를 식별하기 위해 특정 경로의 유전적 및/또는 약리학적 억제와 결합될 수 있습니다.

서문

지난 수십 년 동안 면역 요법은 암 치료를 위한 최첨단 옵션의 최전선에 있었습니다. 항종양 목적으로 면역 체계를 활용하면 역사적으로 예후가 좋지 않은 다양한 혈액 및 고형 악성 종양에 걸쳐 환자에게 혜택을 줄 수 있는 강력한 개념 증명을 제공했습니다. 면역 요법이 다른 방법으로는 치료하기 어려운 암에 대한 기회를 제공함에 따라 놀라울 정도로 빠른 진행 속도를 경험하고 있습니다. 이러한 발전은 적어도 부분적으로는 암세포와 면역세포 사이의 상호 작용에 대한 정교한 이해에 기인할 수 있습니다. 이러한 상호 작용은 면역 체계가 암세포를 파괴하기 위해 점화하는 피드포워드 "엔진", 이른바 암-면역 주기와 유사합니다. 이 항암 면역 반응은 인식, 처리 및 반응의 세 가지 주요 수준에 걸쳐 진행됩니다. 첫째, 인식 단계에서 종양 형성 중에 생성된 종양 항원(Ag)은 종양 미세환경(TME, 1단계)에서 죽어가는 암세포에 의해 방출되고 종양 침투 수지상 세포(DC, 2단계)에 의해 삼켜집니다. 다음으로, 처리 단계에서 DC는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자를 통해 포획된 종양 Ag의 에피토프를 제시하고, 표면에 더 높은 수준의 늑골 분자를 발현하고(3단계), 종양 배출 림프절(dLN)로 이동하여 화물을 미성숙 CD8 T 세포에 교차 제시합니다(CD8_N, 4단계). 이러한 모든 단계는 종양 Ag 특이적 교차 프라임 CD8 T 세포(CD8_C-P)가 활성화되고 effector CD8 T(CD8_E) 세포로 성숙한 후 클론 확장(단계 5)을 거치는 최종 반응 과정에서 수렴됩니다. 그런 다음 CD8_E 세포는 dLN과 혈액을 통해 TME로 이동하며(6단계) T 세포 수용체(TCR)와 동족 종양 Ags 사이의 상호 작용을 통해 암세포를 특이적으로 인식하고 결합하고, 세포독성 분자[즉, 인터페론(IFN)-γ, 퍼포린 및 그랜자임(Grzs)]을 방출하고, 암세포를 죽이고(단계 7)^{1, 2}. 암세포 사멸은 암-면역 주기에 연료를 공급하기 위해 추가 종양 Ags의 방출로 이어집니다. 사실, 이 모든 단계를 통해 면역 체계는 예상보다 훨씬 더 자주 암세포를 파괴하고 거부합니다. 그러나 암 환자의 경우 이러한 단계 중 적어도 하나가 제대로 작동하지 않습니다. 우리와 다른 연구자들은 암세포가 더 공격적이고 면역 특권을 가진 변이체로 진화하거나 ^3,4,5 또는 T-세포 효과를 방해함으로써 면역 반응을 지연시키려고 한다는 것을 보여주었다 ^6,7.

암 연구와 항암제 개발은 모두 암과 면역 세포 간의 관계를 연구할 수 있는 실험 모델, 이른바 종양 면역학(onco-immunology)에 의존합니다. 여기에는 종양 면역학 주기의 각 단계를 종합적으로 재현하는 빠르고 신뢰할 수 있으며 재현 가능하고 저렴한 in vitro 모델에 대해 설명하고 있으며, 면역 감시 및 궁극적으로 면역 편집의 표현형 및 기능적 특징 세트에 대한 빠르고 명확한 관점을 제공합니다.

다매개변수 유세포 분석(mFC)은 암 임상 시험의 기초 암 연구, 진단 및 중개 연구에서 가장 성공적인 단일 세포 분석 도구 중 하나입니다. 각 세포에서 더 많은 특징을 동시에 캡처할 수 있기 때문에 mFC는 종양 면역학에서 최고의 표준 분석 플랫폼으로 자리매김했습니다. TME^8,9,10과 같은 이종 및 이형 세포 현탁액의 단일 세포 수준에서 여러 단백질 발현 패턴 및 기능적 특성을 빠르고 재현성 있게 측정할 수 있는 가능성과 높은 감도 및 특이성을 결합합니다. 표현형 및 기능적 발현 패턴은 모두 시간에 민감하기 때문에 실험 설계, 적합한 패널, 대조군 및 적정 항체의 선택, 적절한 시료 처리 및 기기 사용에 세심한 주의를 기울이는 것이 결과의 신뢰성, 비교 가능성 및 재현성을 위해 그리고 실험 결과를 자신 있게 해석하는 데 매우 중요하다¹¹.

Tumor-on-a-chip 미세유체 장치(ToC)는 암 및 면역 세포 역학의 시험관 내 마이크로 스케일 생체 모방을 허용하여 TME를 모델링하고 12,13,14,15를 상호 작용합니다. 구체적으로, ToC는 2차원(2D) 또는 3차원(3D) 배양 설정으로 구성된 다양한 세포 유형을 호스팅할 수 있는 다채널 미세유체 세포 배양 장치로서, 높은 충실도로 모델링할 수 있으며, TME⁽¹²)에서 생리학적으로 발생하는 이형 세포 상호 작용 및 화학적 구배의 흐름과 같은 주요 구조 및 기능 단위를 높은 정밀도로 제어할 수 있습니다^. 13,14,15. 특히, 면역 화학인력 및 궤적뿐만 아니라 면역 세포와 암세포의 상호 작용을 실시간으로 모니터링하고 타임 랩스 현미경 및 자동 추적 분석을 통해 정량화할 수 있습니다 5,12,13,14,15,16. 또한, ToC는 암의 발병과 진행 및 치료에 대한 반응을 조절하는 중요한 과정을 분석하고 조작할 수 있는 가능성을 제공한다¹⁷.

이 기사에서는 mFC와 ToC를 결합하여 암 Ags의 DC 매개 식세포작용(단계 1-3), T 세포 교차 프라이밍(단계 4), 활성화 및 클론 확장(마지막은 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU) 및 Cu(I) 촉매 사이클로첨가 [클릭] 기술을 통해 항암 면역 반응의 모든 수준을 연구합니다. 5단계), CD8_E 세포가 TME로 귀환(6단계), 마지막으로 CD8_E-세포 매개 암세포 사멸(단계 7, 그림 1).

이 연구는 암-면역 주기를 연구하기 위한 간단하고 빠르며 신뢰할 수 있는 표준 프로토콜을 수립하기 위한 노력에 기여합니다. 암 연구, TME 역학 및 치료에 대한 mFC 및 ToC 모델의 개선 및 통합은 이러한 모델이 실험 제어와 함께 생물학적 충실도를 제공하기 때문에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 자연 및 후천적 면역 감시에 대한 개별 세포 플레이어의 역할과 상호 상호 작용을 특성화, 모니터링 및 적시에 조작할 수 있도록 함으로써 암-면역 주기를 단계적으로 재현하는 데 도움이 됩니다. 이는 궁극적으로 동물 연구를 개선, 축소 및 대체하는 데 도움이 되는 동시에 종양을 능가하고 임상 치료를 안내하는 데 중요한 통찰력을 제공할 것입니다. 마지막으로, mFC 및 ToC의 장점과 한계에 대해 비판적으로 논의하고 최첨단 기술(예: 단일 세포 및 세포 내 분해능에서의 고플렉스 공간 분석)과 비교하여 종양 면역학 연구 및 치료를 발전시킵니다.

프로토콜

동물 사용을 요구하는 프로토콜의 모든 단계는 EU 지침 63/2010을 준수하며 기관 동물 실험 위원회와 이탈리아 보건부(승인 번호 858/2015/PR)에서 승인한 실험 프로토콜에 포함되어 있습니다.

1. 암세포의 준비

1. 암 세포 배양 루틴(-7일, 소요 시간: 2시간)
   1. 표준 배양 조건(37°C, 5 % CO₂ ).
      참고: 선택한 세포주에 따라 배양 조건을 조정하십시오. 해동의 경우 세포는 최적의 배양 조건에 적응하고 정상적인 세포 주기를 재확립하기 위해 ~1주일의 회복 시간이 필요합니다.
   2. 세포 배양 성장을 최적화하기 위해 1 x 10⁶ cells/mL 밀도의 75cm² 플라스크에 세포를 플레이트하고 12-15mL의 완전 성장 배지에 넣습니다.
      참고: 시드된 세포의 수는 일반적으로 특정 세포 크기와 배가되는 시간에 따라 세포주마다 다를 수 있습니다. 세포 합류는 세포의 상태에 큰 영향을 미칩니다. 세포가 적거나 너무 밀집되어 있으면 대사 교란이 발생하여 증식 정지, 클론 선택 또는 세포 스트레스를 촉진할 수 있습니다. MCA205 세포의 경우 1:10-1:20 분할 비율로 일주일에 두 번 passaging을 수행해야 합니다.
   3. 세포 배양이 최대 75%-80% 밀도에 도달하면 세포 단층에서 전체 성장 배지를 버리고 미리 예열된 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척하여 FBS를 제거한 다음 예열된 0,25% 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 1.5mL를 37°C에서 1-2분 동안 첨가하여 세포를 분리합니다.
      참고: FBS에는 트립신 효소 활성을 비활성화할 수 있는 프로테아제 억제제가 포함되어 있으므로 완전히 제거하는 것이 중요한 단계입니다. 트립신 배양 시간은 세포 유형에 따라 다릅니다. 일반적으로 트립신 농도가 높은 세포의 장기 배양은 세포 표면 단백질을 줄무늬로 만들고 세포 사멸을 유발할 수 있으므로 피하십시오. 이 단계에서 광학 현미경으로 세포 박리 상태를 확인합니다.
   4. 10mL의 사전 예열된 완전 성장 배지에서 분리된 세포를 수집하여 트립신 효소 활성을 비활성화하고 실온(RT)에서 1100× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. Trypan Blue 염료 배제 테스트를 사용하여 세포 계수 슬라이드에서 세포를 계수한 다음 아래에 설명된 대로 유지 배양(해동 후 8개 이하) 또는 다운스트림 실험 절차를 위한 적절한 지지체로 희석 시 다시 파종합니다.
2. 암세포 사멸 - 암세포 Ags 방출(0일차, 소요시간: 30분)
   1. 다운스트림 기능 실험의 경우 100mm 조직 배양 처리된 페트리 접시에 10mL의 완전한 성장 배지에 담긴 플레이트 3 × 10⁶ 개의 MCA205 세포.
      참고: 특정 실험 응용 분야(예: DC 매개 종양 Ag 흡수 분석)를 위해 세포 사멸을 유도하기 전에 제조업체의 지침에 따라 형광 세포 링커(Table of Materials)를 사용하여 암세포를 라벨링했습니다.
   2. 세포에 자외선(UV) 광선¹⁸(ƛ = 254nm)을 9cm 거리에서 3분 동안 조사한 다음 37°C, 5%_CO2 에서 6시간 이상 배양하여 죽입니다.
      주의: 암세포 사멸은 화학요법 치료(예: 면역원^{성 또는 비}면역원성 약물5)에 의해서도 유발될 수 있다.

2. 암세포와 면역세포의 동반 배양

1. DC 매개 암 Ag 흡수 및 발표(0일; 타이밍 : 벤치 시간 1 시간, 배양 시간 24 시간)
   1. 4-6시간 후, 앞서 설명한 바와 같이 면역력이 있는 마우스의 골수(BM) 세포에서 분화된 시험관 내 DC를 수집한다⁸, 그리고 완전한 성장 배지에서 RT에서 1100 x g 에서 5분 동안 2회 세척한다.
      참고: DC는 이전에 보고된 바와 같이 Histodenz 기반 그래디언트에서 원심분리를 통해 마우스 비장 세포에서 대안적으로 분리할 수 있습니다¹⁹. 좋은 방법으로, 동결 보존된 DC를 사용하는 경우 전체 성장 배지를 예열하고 1:1000 벤조나제로 보충하여 세포 응집을 방지하여 해동 시 양호한 회수를 보장합니다.
   2. 1.2.2단계에서 UV 방사선 조사된 암세포를 수집하고 RT에서 1100 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 위와 같이 BM 유래 "빈" DC(DC_N)를 계산한 다음(1.1.4단계 참조) UV 방사선 조사 자가사멸 세포와 2:1 비율로 설정합니다(2.5 × 10⁵ DC에 대해 5 ×^{10 5} 세포사멸 MCA205 세포, 이전에 최적화된^{대로 8}) 12웰 플레이트에서 37°에서 24시간 동안 신선한 완전 성장 배지 1mL의 1mL에 있습니다.C, 5 % CO₂. 실험적 대조군으로, 식세포작용(phagocytosis)이 방해받는 조건인 4°C에서 세포를 배양합니다.
      참고: co-culture surface and volume을 증가시키면 apoptotic cancer cell-DC 상호작용을 방해하여 최적의 효과적인 phagocytosis를 방해할 수 있으므로 증가시키지 마십시오. 또한, 다른 암세포 모델을 사용하는 경우 암세포:DC 비율을 최적화하기 위한 연구를 수행해야 합니다.
2. mFC에 의한 암 Ag 흡수 평가(1일차, 소요 시간: 2시간)
   1. 24시간 배양 후 15mL 튜브에 세포를 수집하고 10mL의 완전 성장 배지에서 RT에서 1100 x g 으로 5분 동안 두 번 세척합니다.
      참고: DC 멤브레인에 달라붙어 아직 완전히 침식되지 않은 자가사멸 세포의 배경 소음을 줄이기 위해 세포 펠릿을 0.1M EDTA로 RT에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포 현탁액(약 2 x 10⁶ 개 세포 포함)을 2.2.1단계와 같이 10mL의 성장 배지로 두 번 원심분리합니다.
   2. 세포 표면 염색의 경우, 0.5μg의 IgG 동형 대조군 또는 항 마우스 피코에리트린(PE) 접합 CD11c를 함유한 20μL의 저온 형광 활성 세포 분류(FACS) 완충액(1% FBS, PBS의 경우 0.1M EDTA)에 BM 유래 DC를 재현탁하고 형광 색소 신호를 보존하고 광퇴색을 방지하기 위해 어두운 곳에서 4°C에서 20분 동안 배양합니다.
      참고: 암 항원 흡수가 발생하면 "전체" DC(DC_PHAGO) 활성화는 늑골 분자(즉, CD80 또는 CD86 및 MHC-II 및 면역 관문 리간드 CD274 항원[PDL1으로 가장 잘 알려져 있음])의 발현 수준을 확인하여 확인할 수도 있습니다. 일반적으로 최적의 유세포 분석기 성능을 위해서는 항체 농도를 신중하게 적정해야 하며 세포 수 범위는 1 x 10⁵ 에서 1 x 10⁸ cells/test여야 합니다.
   3. 그 후, FACS 완충액에서 세포를 두 번 세척하고 RT에서 30분 동안 1μM의 최종 농도로 활력 고정 가능한 근적외선(IR) 염료가 포함된 PBS 용액 100μL를 추가합니다.
      알림: 대안으로 사용된 형광 방출과 겹치지 않는 다른 활력 고정 가능한 염료(예: Violet, Blue, Orange, Lime, Aqua)를 사용할 수 있습니다.
   4. mFC를 통해 CD11c 및 PKH67 수준의 유세포 분석을 수행하기 전에 PBS에서 세포를 한 번 세척하고 FACS 완충액에 재현탁시킵니다. mFC 수집 중에, 그리고 데이터 분석에서, 다음 게이팅 전략을 진행합니다.
      1. 전방 산란 영역(FSC-A, x축) 및 측면 산란 영역(SSC-A, y축) 속성(게이트 1)을 기반으로 관심 세포를 식별합니다. FSC-A(x축) 및 전방 산란 높이(FSC-H, y축, 게이트 2)를 플로팅하여 분석에서 셀 이중선 및 덩어리를 제외합니다.
      2. 780/60nm 방출 대역통과(bp) 필터 영역(x축) 및 SSC-A(y축, 게이트 3)를 플로팅하여 데드 셀을 제거합니다. 마지막으로, 게이트 3을 기반으로 각각 575/26 nm 및 530/30 nm 방출 bp 필터를 사용하여 2-파라미터 밀도 플롯에서 CD11c 마커 및 PKH67 형광 세포 링커에 대한 세포 양성을 검출합니다.
   5. 데이터 분석을 수행합니다.
      참고: 잘 분리된 방출 파장으로 쉽고 효율적인 라벨링을 보장하기 위해 항체를 결합해야 합니다. 이는 사용된 형광단에 대한 보상 설정을 단순화하고 관심 파라미터를 쉽고 빠르며 신뢰할 수 있는 정량화할 수 있도록 합니다.
3. CD8 T 세포 프라이밍 및 활성화(1일차; 소요 시간: 벤치 시간 1시간, 배양 시간 72-96시간)
   1. 앞서 설명한 바와 같이 쥐 비장 CD8 T 세포(CD8_N)를 정제한다⁸.
   2. 500 μL의 신선한 완전 성장 배지에서 분리된 CD8 T 세포를 계수 및 재현탁시키고 이전에 자가사멸 MCA205 세포를 차지했던 BM 유래 DC로 2.5:1 비율(1 ×× 10⁵ T 세포의 경우 2.5 10⁵ DC, 이전에 최적화된⁸과 같이 8)으로 37°C에서 1.5mL의 최종 부피로 12웰 플레이트에서 72시간 동안 배양합니다. 5 % 일산화탄소₂.
      참고: 실험 결과를 강조하기 위해 다양한 세포 배양 비율이 테스트되었으며 가장 좋은 비율이 선택되었습니다.
4. EdU mFC assay에 의한 CD8 T 세포 증식 분석(4일차; 소요 시간: 벤치 시간 15분, 배양 16-20시간)
   1. 뉴클레오시드 유사체-티미딘 EdU를 최종 농도 10μM의 공동 배양 배지에 추가하고 잘 혼합합니다.
      참고: 배양 조건, 세포 유형 변화 및 세포 밀도가 EdU가 DNA에 통합되는 데 영향을 미칠 수 있으므로 파일럿 실험에서 다양한 EdU 농도 및 배양 시간을 테스트하십시오. 더 길거나 더 짧은 배양은 각각 더 낮거나 더 높은 농도를 필요로 할 수 있습니다. EdU로 음성 염색 대조군으로 처리되지 않은 동일한 집단의 세포를 포함합니다.
   2. 16-20시간 후 RT에서 1100 x g에서 5분 동안 CD8_CP를 회수하고 원심분리합니다.
   3. 0.5μg의 항-마우스 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 접합 CD8a 및 0.25 μg의 항-마우스 PE-접합 CD3가 보충된 20μL의 차가운 FACS 완충액에서 표면 마커를 위한 세포를 염색하거나 96웰 U자형 바닥 TC 처리된 마이크로플레이트에서 각각의 IgG 동형 대조군을 사용하여 어두운 곳에서 4°C에서 20분 동안 배양합니다.
      참고: 간섭을 피하기 위해 클릭 반응을 수행하기 전에 Qdot 항체 conjugate를 사용하지 않는 것이 좋습니다.
   4. FACS 완충액에서 세포를 두 번 세척하고(2.2.3단계와 같이) RT에서 30분 동안 1μM의 최종 농도에서 활력 고정 가능한 Aqua 염료를 포함하는 PBS 용액 100μL에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
      1. 세포 현탁액을 플로우 튜브로 옮기고, PBS의 1% 소 혈청 알부민(BSA) 3mL로 한 번 세척하고, 빛으로부터 보호되는 RT에서 15분 동안 100μL의 고정제(즉, PBS의 4% 파라포름알데히드)에 세포 고정을 진행합니다.
      2. 그 직후, PBS에서 3mL의 1% BSA로 세포를 한 번 세척하고 1x 사포닌 기반 투과화가 포함된 용액 100μL에 배양하고 시약을 RT에서 15분 동안 세척한 다음 직접 라벨링 반응을 진행합니다.
         참고: 1x 사포닌 기반 투과화 및 세척 시약은 PBS에서 10x 용액을 1% BSA로 1:10 부피를 희석하여 제조합니다. 이 시약은 적혈구를 용해하면서 백혈구의 형태학적 광 산란 특성을 보존하기 때문에 전혈구 또는 적혈구를 포함하는 세포 현탁액과 함께 사용할 수도 있습니다.
      3. 분석할 샘플의 수에 따라 표시된 부피의 PBS, 구리 보호제 촉매, Alexa Fluor(AF) 647-conjugated picolyl azide 및 1x EdU 완충 첨가제를 부드럽고 순차적으로 혼합하여 반응 칵테일을 준비합니다.
         1. 준비 후 15분 이내에 반응 칵테일을 사용하십시오. 반응 혼합물 500μL를 각 튜브에 첨가하고 잘 섞은 다음 어두운 곳에서 RT에서 30분 동안 배양합니다.
      4. 3mL의 1x 사포닌 기반 투과화 및 세척 시약으로 세포를 한 번 세척하고 동일한 용액 100μL에 재현탁시킨 후 mFC를 통해 세포 집단에서 C8 C-P를 증식하는 S상 CD8_C-P 의 비율을 결정하기 위한 표준 mFC 방법을 진행합니다. mFC 수집 중에, 그리고 데이터 분석 중에는, 다음 게이팅 전략을 진행하십시오.
         1. FSC-A(x축) 및 SSC-A(y축) 특성(게이트 1)을 기반으로 관심 세포를 식별합니다. FSC-A(x축) 및 FSC-H(y축, 게이트 2)를 플로팅하여 분석에서 세포 이중선 및 덩어리를 제외합니다. 525/50nm 방출 bp 필터 영역(x축) 및 SSC-A(y축, 게이트 3)를 플로팅하여 데드 셀을 제거합니다.
         2. 각각 530/30 nm 및 575/26 nm 방출 bp 필터를 사용하여 2-파라미터 밀도 플롯에서 CD8a 및 CD3에 대한 세포 양성을 검출합니다(게이트 4). 마지막으로 게이트 4를 기반으로 660/620 nm bp 방출 필터를 사용하여 단일 매개변수 히스토그램에서 AF647-EdU 통합에 대한 세포를 평균 형광 강도로 추가로 분석합니다.
            참고: EdU 라벨링에 의해 생성된 형광 신호는 획득 중 낮은 유속을 사용하여 가장 잘 감지됩니다.
      5. 데이터 분석을 수행합니다.

3. 암세포에 대한 CD8_C-P 의 재자극

1. CD8_C-P는 살아있는 암세포를 인식합니다(day 4; 소요 시간: 벤치 시간 1시간, 배양 48-72시간)
   1. 공동 배양에서 CD8_C-P를 회수하고(2.3.2단계 참조) 10mL의 완전 성장 배지에서 RT의 1100 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
      참고: 이 단계에서는 활성화 마커 CD95의 발현 수준을 확인하여 CD8 T 세포 분화를 확인합니다.
   2. 약 2.5 × 10⁶ 세포를 포함하는 세포 펠릿을 1 x 10⁷ 총 세포당 100 μL의 죽은 세포 제거 마이크로비드에 재현탁시킵니다.
      참고: 세포 수를 늘리려면 그에 따라 시약과 총 부피를 확장하십시오.
   3. 잘 섞고 RT에서 15분 동안 배양합니다.
      참고: 필요한 경우 자기 분리에 필요한 최소 500μL를 달성하기 위해 제조업체의 지침에 따라 1x 결합 버퍼를 추가하여 샘플 부피를 조정합니다.
   4. 그 직후, 후속 자기 셀 분리를 진행하십시오. 분리 컬럼을 적절한 분리기의 자기장에 놓고 적절한 양의 1x 결합 완충액으로 헹굽니다. 세포 현탁액을 분리 컬럼으로 옮기고 라벨링되지 않은 살아있는 세포 분획이 포함된 플로우스루를 수집합니다.
   5. 적절한 양의 1x 결합 완충액으로 컬럼을 다시 세척합니다. 통과하는 라벨이 지정되지 않은 세포를 수집하여 3.1.4단계의 폐수와 결합합니다.
      참고: 죽은 세포의 자기 제거 효율성을 높이기 위해 새 컬럼을 사용하여 3.1.1-3.1.5 단계에 설명된 대로 두 번째 분리 절차를 통해 살아있는 세포 분획을 강화할 수 있습니다.
   6. 원심분리기는 세포 계수 전에 완전 성장 배지에서 RT에서 1100 x g으로 5분 동안 살아있는 CD8_C-P를 농축한 다음 2:1 비율로 새로운 MCA205 세포(5 x 10⁴ MCA205 세포의 경우 1 x 10⁵ CD8 T 세포, 이전에 최적화된⁸과 같이 8)로 12개의 웰 플레이트에서 배양했습니다. 세포 파종 후 공동 배양 플레이트를 가습 세포 배양 인큐베이터 또는 라이브 셀 분석 시스템에 37°C, 5%_CO2에서 72시간 동안 배치한 후 다운스트림 분석을 _{진행합니다.}
2. ToC 미세유체 모델에서 암세포를 향한 CD8 T 세포 이동(5일차; 소요 시간: 벤치 시간 2시간, 배양 72시간)
   1. UV 캐비닛 아래에서 임시 제작 ToC 미세 유체 장치^13,20을 20분 동안 멸균하고 PBS로 두 번 세척한 다음 최소 1시간 동안 완전한 성장 배지로 배양합니다.
      참고: MCA205 세포 및 CD8_CP 는 이 프로토콜에서 염색되지 않습니다. 그러나 둘 다 형광 Live 호환 세포 추적기로 라벨링할 수 있습니다.
   2. 15 μL의 완전한 성장 배지에 1 × 10⁵ MCA205 세포를 부드럽게 재현탁시키면서 균일한 세포 분포를 얻도록 주의하고 앞에서 설명한 대로 왼쪽 칩 챔버(종양 챔버)에 천천히 주입합니다. 암세포가 칩 바닥에 부착될 때까지 5-10분 동안 기다립니다.
      1. 현미경으로 미세유체 칩에서 암세포의 정확하고 균일한 분포를 확인하십시오. 실험 결과는 기포의 존재에 의해 영향을 받을 수 있습니다.
   3. 50 μL의 완전 성장 배지에 1 x 10⁶ CD8_C-P 를 재현탁시킵니다. 면역 세포 현탁액을 오른쪽 칩 챔버(면역 챔버)로 부드럽게 파이프합니다.
      참고: 이 단계에서 현미경을 사용하여 면역 세포가 중간 챔버에 분포되어 실험의 시작점을 나타내는 "전면"을 생성하는지 확인합니다.
   4. 압력 및 미세유체 변동을 피하기 위해 이전에¹³ 에 표시된 대로 모든 칩 저장소를 최대 150μL의 완전 성장 배지로 조심스럽게 채우고 조립된 칩을 37°C, 5% CO₂ 의 가정식 세포 배양 인큐베이터의 평평한 표면에 최소 1시간 동안 배치하여 타임랩스 기록 전에 시스템을 안정화합니다.
      참고: 각 칩 챔버의 두 저장소에서 부피의 잠재적인 증발 손실을 주의 깊게 확인하고 2-3일마다 새 매체를 추가하여 보상하십시오. 필요한 경우 각 세포 구획에서 최대 100μL의 상층액을 흡인하여 사이토카인 프로파일링을 수행할 수 있습니다.
   5. 배양 시스템이 장착된 비디오 현미경 설정을 사용하여 MCA205 및 면역 세포가 각각 포함된 오른쪽 및 왼쪽 장치 영역 사이의 마이크로채널 어레이의 명시야 이미지 시리즈를 기록하고 면역 세포 침투 및 면역 세포-암세포 상호 작용의 역학을 시각화합니다.
      참고: 여기에 사용된 실험 설정에서 세포의 타임랩스 기록은 2분마다 하나의 현미경을 획득하는 현미경을 사용하여 인큐베이터에서 72시간 동안 수집되었습니다. 이미징 조건을 최적화하여 과도한 사진 노출을 피하고 높은 획득 프레임 속도를 유지하여 다운스트림 면역 세포 추적 분석을 쉽게 수행할 수 있습니다. 타임랩스가 끝나면 반자동 추적 분석^13,20을 수행합니다.
3. CD8_E 활성화 및 종양 반응성 유세포 평가(7일 및 8일; 소요시간: 2시간)
   1. 48시간 및 72시간 배양 후(단계 3.1.6 참조) CD8_E 를 회수하고 RT에서 1100 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 두 번 회수합니다.
      참고: CD8_E (즉, IFN-γ 및 Grz-B)에 의해 생성된 세포독성 분자의 세포 내 수준을 평가하기 위해 암-면역 세포 공동 배양은 이전에 1:1000 brefeldin A 및 1:1500 monensin으로 최소 6시간 동안 배양되었습니다.
   2. 세포 표면 염색의 경우, 보충 표 1과 같이 차가운 FACS 완충액에서 준비된 3가지 다른 1차 항체 혼합물의 20μL에 세포를 재현탁시킵니다.
      참고: 항체 결합의 특이성을 보장하려면 2.2.2단계와 같이 적절한 IgG 동형 대조군이 있는 상태에서 mFC 실험을 수행하십시오.
   3. 빛으로부터 보호되는 96웰 U자형 바닥 조직 배양 처리된 마이크로플레이트에서 4°C에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 혼합물 A 및 B(보충 표 1)의 세포 펠릿의 경우 3.3.5단계로 바로 진행합니다.
   4. 빠른 세척 후 혼합물 C의 세포 펠릿에 100μL의 고정/투과화 용액을 추가합니다(보충 표 1). 어두운 곳에서 4°C에서 20분 동안 배양한 후 200μL의 저온 투과화/세척 완충액으로 세포를 두 번 세척하고 0.25μg의 항마우스 FITC 복합 IFN-γ 및 0.125μg의 항마우스 PE 접합 Grz-B 또는 각각의 IgG 이소형을 포함하는 20μL의 냉투과화/세척 완충액에 재현탁시킵니다. 빛으로부터 보호된 4°C에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
   5. 그 후, FACS 완충액에서 세포를 두 번 세척하고 RT에서 30분 동안 1μM의 최종 농도로 활력 고정 가능한 Aqua 염료를 포함하는 PBS 용액 100μL를 세포 펠릿에 추가합니다(단계 2.2.4에서와 같이).
   6. mFC를 통해 암세포에 대한 CD8 T 세포 활성화의 유세포 분석을 수행하기 전에 PBS에서 세포를 한 번 세척하고 FACS 완충액에 재현탁시킵니다. mFC 수집 중에, 그리고 데이터 분석 중에는, 다음 게이팅 전략을 진행하십시오.
      1. FSC-A(x축) 및 SSC-A(y축) 특성(게이트 1)을 기반으로 관심 세포를 식별합니다. FSC-A(x축) 및 FSC-H(y축, 게이트 2)를 플로팅하여 분석에서 세포 이중선 및 덩어리를 제외합니다. 525/50nm 방출 bp 필터 영역(x축) 및 SSC-A(y축, 게이트 3)를 플로팅하여 데드 셀을 제거합니다.
      2. 660/20 nm 및 780/60 nm 또는 530/30 nm 및 575/26 nm 방출 bp 필터(게이트 4)를 사용하여 2-파라미터 밀도 플롯에서 CD8a 및 CD3에 대한 세포 양성을 검출합니다. 마지막으로, 게이트 4를 기반으로 CD137 마커(660/20nm 방출 bp 필터)에 대한 CD44(530/30nm 방출 bp 필터), CD25(575/26nm 방출 bp 필터) 마커, 혼합 A에 대한 IFN-γ(530/30nm 방출 bp 필터) 및 Grz-B(575/26nm 방출 bp 필터)에 대한 2-파라미터 밀도 플롯에서 세포를 추가로 분석합니다. B, 및 C(보충 표 1)에 각각 표시된다.
         참고: CD8_E 세포 종양 반응성은 ad hoc degranulation assay를 통해 CD107a 리소좀 관련 단백질의 표면 발현을 평가하여 추가로 테스트할 수 있습니다.
   7. 데이터 분석을 수행합니다.
4. 생세포 분석 시스템 및 mFC를 이용한 CD8_E 세포 매개 종양 사멸 조사(8일차; 소요 시간: 벤치 시간 1시간, 배양 72시간)
   1. 살아있는 세포 분석 시스템을 통한 종양 사멸 분석의 경우 최종 농도 250nM의 실시간 세포 사멸 정량 염료로 공동 배양 배지(3.1.6단계 참조)를 보충합니다.
   2. 공동 배양 플레이트를 살아있는 세포 분석 시스템에 배치한 후 스캔하기 전에 플레이트를 37°C에서 30분 동안 예열합니다. 적절한 소프트웨어로 분석될 타임랩스 녹음을 수집하기 위해 2시간마다 최대 72시간마다 데이터 스캔을 수행합니다.
   3. mFC를 사용한 종양 사멸 분석의 경우 72시간 후(3.1.6단계 참조) RT에서 1100 x g 에서 5분 동안 세포를 두 번 채취하고 원심분리합니다.
   4. 96웰 U자형 바닥 TC 처리된 마이크로플레이트에 0.125μg의 IgG 동형 대조군 또는 항마우스 퍼시픽 블루(PB) 접합 CD45를 포함하는 20μL의 차가운 FACS 완충액에 있는 표면 마커용 염색 세포를 어두운 곳에서 4°C에서 20분 동안 배양합니다. 그 직후, FACS 완충액에서 세포를 두 번 세척하고 유세포 분석 전에 최종 농도 1μM에서 활력 염료인 프로피듐 요오드화물(PI)을 추가합니다. mFC 수집 중에, 그리고 데이터 분석 중에는, 다음 게이팅 전략을 진행하십시오.
      1. FSC-A(x축) 및 SSC-A(y축) 특성(게이트 1)을 기반으로 관심 세포를 식별합니다. FSC-A(x축) 및 FSC-H(y축, 게이트 2)를 플로팅하여 분석에서 세포 이중선 및 덩어리를 제외합니다.
      2. 450/50nm 방출 bp 필터(게이트 3)를 사용하여 CD45 음성에 대한 암세포를 검출합니다. 마지막으로, 610/620 nm bp 방출 필터를 사용하여 단일 파라미터 히스토그램에서 평균 형광 강도로 PI 통합을 위한 세포를 분석합니다.
         참고: 암세포 사멸은 Annexin V-PI apoptosis assay를 수행하거나 절단된 Caspase-3 및 -7의 발현 수준을 평가하여 분석할 수도 있습니다.
   5. 데이터 분석을 수행합니다.
      참고: 통계 분석은 Prism GraphPad 소프트웨어 v.8.4.0을 사용하여 수행되었습니다.

결과

mFC는 cross-presentation^21,22에 특화되고 그림 2A와 같이 gated된 널리 알려진 phagocyte subset인 CD11c⁺ DC가 이전에 PKH67 형광 세포 링커로 표지된 UV 방사선 조사된 MCA205 암세포의 자가사멸체를 집어삼킬 수 있는 능력을 평가했습니다. 예상대로 CD11c⁺ DC는 4°C가 아닌 37°C에서 시험관 내에서 세포사멸 MCA205 세포를 효율적?...

토론

항암 면역 반응을 모니터링하는 것은 TME에서 작용하고 패권을 위한 끊임없는 싸움을 지원하는 복잡한 분자 및 세포 상호 작용을 규명하고 이해하는 데 가장 중요합니다²³. 여기에서는 암-면역 주기를 구성하는 단계의 모니터링 및 특성화를 위한 간단한 mFC 및 ToC 지원 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 쥐 세포주와 마우스 유래 면역 세포를 기반으로 하는 이 프로토콜은 약간?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtubes	Eppendorf	30120086
100 kV e-beam litography	Vistec
100 mm Petri dishes	Greiner Bio One	664160
12-well plates	Euroclone	ET3012
15 and 50 mL tubes	Corning	352096; 352070
40 μm cell strainer	Corning	CLS431750
5 mL polystyrene tubes	Greiner Bio-One	120180
70 μm cell strainer	Corning	CLS431751
75 cm2 cell culture treated flask	Euroclone	ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody	Miltenyi Biotec	130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) Antibody	BioLegend	100206
Aptes	Sigma Aldrich	440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug	BD Biosciences	555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)	BD Biosciences	555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD Biosciences	554724
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological, Salem	A1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)	eBioscience	12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)	eBioscience	17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)	eBioscience	25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)	eBioscience	11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	MCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)	eBioscience	48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)	eBioscience	11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)	eBioscience	17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)	eBioscience	53-0951-82
Cell counting slides	Kova International	87144E
Chromium quartz masks	MB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10635
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman Coulter
Dead Cell Removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)	EuroClone	ECB4053L
EDTA	Invitrogen	AM9260G
Fetal bovine serum (FBS)	EuroClone	ECS0180L
Flowjo v10.0.7	Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)	eBioscience	12-8898-82
H2O2	Sigma Aldrich
H2SO4	Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)	Thermo Scientific
Ice machine	Brema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)	eBioscience	11-7311-82
Illustrator CC 2015	Adobe Systems Inc.
ImageJ	National Institute of Health
Incucyte 2022A Software	Sartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells	Sartorius	4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System	Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope	Bulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Angelantoni
L-glutamine 200 mM	EuroClone	ECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L10119
MACS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201; 130-042-401
MACS separators	Miltenyi Biotec	130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell line	Sigma-Aldrich	SCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002552
Microsoft Excel	Microsoft, Redmond
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2	Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT	Nikon Instruments Inc.
Optical litography	EVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate	EuroClone	ECB3001D/1
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201
Pipettes	Eppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits	Sigma-Aldrich	PKH67GL-1KT	fluorescent cell linker  kit
plastic coverslip	IBIDI	10812
Propidium Iodide	Thermo Scientific	P1304MP
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	EuroClone	ECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge Series	Thermo Scientific	75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 series	MicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punches	Kai Medical, Tedpella
Sylgard 184	Dowsil, Dow Corning	101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)	eBioscience	12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS	Sigma Aldrich	92360
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Scientific	15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol Red	EuroClone	ECM0920
Vacuum dessicator