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암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템
요약
여기에서는 암-면역 주기를 구성하는 단계를 모니터링하고 특성화하기 위한 간단하고 빠르며 신뢰할 수 있는 다중 파라메트릭 유세포 분석 및 종양 온 칩 지원 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 실제로, 암과 면역 세포 간의 상호 작용에 대한 철저한 이해는 종양을 능가하고 임상 치료를 안내하는 데 중요한 통찰력을 제공합니다.
초록
근본적인 암 연구와 효과적인 반격 요법의 개발은 모두 암과 면역 세포 간의 상호 작용, 이른바 암-면역 주기를 자세히 설명하는 실험적 연구에 의존합니다. mFC(Multiparametric Flow Cytometry) 및 ToC(tumor-on-a-chip microfluidic devices)와 결합된 체외 공동 배양 시스템은 암 면역 주기의 각 단계에 대한 간단하고 빠르며 신뢰할 수 있는 모니터링 및 특성 분석을 가능하게 하며 암 면역 감시와 면역 회피 간의 균형을 유지하는 메커니즘을 식별할 수 있도록 합니다. 암과 면역 세포 간의 역동적인 상호 작용에 대한 철저한 이해는 종양을 능가하는 데 중요한 통찰력을 제공하고 환자의 치료 개인화 및 최적화 속도를 가속화할 것입니다. 특히, 여기에서는 쥐 암 세포주와 마우스 유래 면역 세포에서 암 면역 주기의 각 단계의 동적 복잡성을 밝히고 면역 감시에 중점을 두기 위한 간단한 mFC 및 ToC 지원 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜의 시간 및 비용 관련 기능을 고려할 때 대규모로 확실히 실현 가능합니다. 더욱이, 약간의 변형을 통해 이 프로토콜은 인간 암 세포주와 인간 말초 혈액 유래 면역 세포에 모두 적용할 수 있으며, 면역 반응의 바이오마커를 식별하기 위해 특정 경로의 유전적 및/또는 약리학적 억제와 결합될 수 있습니다.
서문
지난 수십 년 동안 면역 요법은 암 치료를 위한 최첨단 옵션의 최전선에 있었습니다. 항종양 목적으로 면역 체계를 활용하면 역사적으로 예후가 좋지 않은 다양한 혈액 및 고형 악성 종양에 걸쳐 환자에게 혜택을 줄 수 있는 강력한 개념 증명을 제공했습니다. 면역 요법이 다른 방법으로는 치료하기 어려운 암에 대한 기회를 제공함에 따라 놀라울 정도로 빠른 진행 속도를 경험하고 있습니다. 이러한 발전은 적어도 부분적으로는 암세포와 면역세포 사이의 상호 작용에 대한 정교한 이해에 기인할 수 있습니다. 이러한 상호 작용은 면역 체계가 암세포를 파괴하기 위해 점화하는 피드포워드 "엔진", 이른바 암-면역 주기와 유사합니다. 이 항암 면역 반응은 인식, 처리 및 반응의 세 가지 주요 수준에 걸쳐 진행됩니다. 첫째, 인식 단계에서 종양 형성 중에 생성된 종양 항원(Ag)은 종양 미세환경(TME, 1단계)에서 죽어가는 암세포에 의해 방출되고 종양 침투 수지상 세포(DC, 2단계)에 의해 삼켜집니다. 다음으로, 처리 단계에서 DC는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자를 통해 포획된 종양 Ag의 에피토프를 제시하고, 표면에 더 높은 수준의 늑골 분자를 발현하고(3단계), 종양 배출 림프절(dLN)로 이동하여 화물을 미성숙 CD8 T 세포에 교차 제시합니다(CD8N, 4단계). 이러한 모든 단계는....
프로토콜
동물 사용을 요구하는 프로토콜의 모든 단계는 EU 지침 63/2010을 준수하며 기관 동물 실험 위원회와 이탈리아 보건부(승인 번호 858/2015/PR)에서 승인한 실험 프로토콜에 포함되어 있습니다.
1. 암세포의 준비
- 암 세포 배양 루틴(-7일, 소요 시간: 2시간)
- 표준 배양 조건(37°C, 5 % CO2 ).
참고: 선택한 세포주에 따라 배양 조건을 조정하십시오. 해동의 경우 세포는 최적의 배양 조건에 적응하고 정상적인 세포 주기를 재확립하기 위해 ~1주일의 회복 시간이 필요합니다. - 세포 배양 성장을 최적화하기 위해 1 x 106 cells/mL 밀도의 75cm2 플라스크에 세포를 플레이트하고 12-15mL의 완전 성장 배지에 넣습니다.
참고: 시드된 세포의 수는 일반적으로 특정 세포 크기와 배가되는 시간에 따라 세포주마다 다를 수 있습니다. 세포 합류는 세포의 상태에 큰 영향을 미칩니다. 세포가 적거나 너무 밀집되어 있으면 대사 교란이 발생하여 증식 정지, 클론 선택 또는 세포 스트레스를 촉진할 수 있습니다. MCA205 세포의 경우 1:10-1:20 분할 비율로 일주일에 두 번 pa....
- 표준 배양 조건(37°C, 5 % CO2 ).
대표적 결과
mFC는 cross-presentation21,22에 특화되고 그림 2A와 같이 gated된 널리 알려진 phagocyte subset인 CD11c+ DC가 이전에 PKH67 형광 세포 링커로 표지된 UV 방사선 조사된 MCA205 암세포의 자가사멸체를 집어삼킬 수 있는 능력을 평가했습니다. 예상대로 CD11c+ DC는 4°C가 아닌 37°C에서 시험관 내에서 세포사멸 MCA205 세포를 효율적?.......
토론
항암 면역 반응을 모니터링하는 것은 TME에서 작용하고 패권을 위한 끊임없는 싸움을 지원하는 복잡한 분자 및 세포 상호 작용을 규명하고 이해하는 데 가장 중요합니다23. 여기에서는 암-면역 주기를 구성하는 단계의 모니터링 및 특성화를 위한 간단한 mFC 및 ToC 지원 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 쥐 세포주와 마우스 유래 면역 세포를 기반으로 하는 이 프로토콜은 약간?.......
공개
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 말
A.S.는 AIRC(IG #28807) 및 PRIN(#P2022YE2MX)에서 지원됩니다. M.M.은 AIRC-FIRC 펠로우십(#25558)의 지원을 받습니다. ADN은 혁신 생태계 로마 테크노폴(Innovation Ecosystem Rome Technopole)의 지원을 받ECS00000024 EU-Next Generation EU, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5의 자금 지원을 받습니다.
....자료
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorf | 30120086 | |
| 100 kV e-beam litography | Vistec | ||
| 100 mm Petri dishes | Greiner Bio One | 664160 | |
| 12-well plates | Euroclone | ET3012 | |
| 15 and 50 mL tubes | Corning | 352096; 352070 | |
| 40 μm cell strainer | Corning | CLS431750 | |
| 5 mL polystyrene tubes | Greiner Bio-One | 120180 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| 75 cm2 cell culture treated flask | Euroclone | ET7076 | |
| Adsorbent wipes | |||
| Allumin foil | |||
| anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-319 | |
| anti-mouse CD25 (7D4) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-118-678 | |
| anti-mouse CD3 (17A2) Antibody | BioLegend | 100206 | |
| Aptes | Sigma Aldrich | 440140 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
| BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological, Salem | A1312 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418) | eBioscience | 12-0114-81 | |
| CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5) | eBioscience | 17-1371-82 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (17A2) | eBioscience | 25-0032-82 | |
| CD44 Monoclonal Antibody (IM7) | eBioscience | 11-0441-82 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | MCD4528 | |
| CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3) | eBioscience | 48-0691-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 11-0081-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7) | eBioscience | 53-0951-82 | |
| Cell counting slides | Kova International | 87144E | |
| Chromium quartz masks | MB W&A, Germany | ||
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10635 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | EuroClone | ECB4053L | |
| EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| Fetal bovine serum (FBS) | EuroClone | ECS0180L | |
| Flowjo v10.0.7 | Flowjo, LLC | ||
| Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB) | eBioscience | 12-8898-82 | |
| H2O2 | Sigma Aldrich | ||
| H2SO4 | Sigma Aldrich | ||
| hotplate | |||
| Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2) | Thermo Scientific | ||
| Ice machine | Brema Ice Makers | ||
| IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2) | eBioscience | 11-7311-82 | |
| Illustrator CC 2015 | Adobe Systems Inc. | ||
| ImageJ | National Institute of Health | ||
| Incucyte 2022A Software | Sartorius | ||
| Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells | Sartorius | 4632 | |
| Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System | Sartorius | ||
| JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope | Bulldog Bio | ||
| Laboratory bench | |||
| Laboratory refrigerator (4°C) | |||
| Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Angelantoni | ||
| L-glutamine 200 mM | EuroClone | ECB3004D | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34957 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L10119 | |
| MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201; 130-042-401 | |
| MACS separators | Miltenyi Biotec | 130-042-10; 130-042-302 | |
| MCA205 mouse fibrosarcoma cell line | Sigma-Aldrich | SCC173 | |
| Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine | |||
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002552 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Redmond | ||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-096-543 | |
| Nikon ECLIPSE Ts2 | Nikon Instruments Inc. | ||
| NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT | Nikon Instruments Inc. | ||
| Optical litography | EVG | ||
| Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate | EuroClone | ECB3001D/1 | |
| Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | |
| Pipettes | Eppendorf | ||
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | PKH67GL-1KT | fluorescent cell linker kit |
| plastic coverslip | IBIDI | 10812 | |
| Propidium Iodide | Thermo Scientific | P1304MP | |
| Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab | ||
| Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | EuroClone | ECB9006L | |
| serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489 | |
| SL 16 Centrifuge Series | Thermo Scientific | 75004031 | |
| Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers | |||
| Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | |
| SU-8 3000 series | MicroChem corp, Newton, (MA) | ||
| Suite of dermal biopsy punches | Kai Medical, Tedpella | ||
| Sylgard 184 | Dowsil, Dow Corning | 101697 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597) | eBioscience | 12-5961-82 | |
| Thermostatic bath | |||
| Timer | |||
| TMCS | Sigma Aldrich | 92360 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA w/ Phenol Red | EuroClone | ECM0920 | |
| Vacuum dessicator |
참고문헌
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.
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