Co-Kultur in vitro Systeme zur Reproduktion des Krebs-Immunitäts-Zyklus

Zusammenfassung

Im Folgenden stellen wir ein einfaches, schnelles und zuverlässiges multiparametrisches Durchflusszytometrie- und Tumor-on-a-Chip-gestütztes Protokoll vor, um die Schritte des Krebsimmunitätszyklus zu überwachen und zu charakterisieren. In der Tat liefert ein gründliches Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Krebs und Immunzellen entscheidende Erkenntnisse, um Tumore zu überlisten und die klinische Versorgung zu leiten.

Zusammenfassung

Sowohl die Grundlagenforschung zur Krebsforschung als auch die Entwicklung wirksamer Gegenangriffstherapien stützen sich auf experimentelle Studien, die die Wechselwirkungen zwischen Krebs und Immunzellen, den sogenannten Krebs-Immun-Zyklus, detailliert beschreiben. In-vitro-Co-Kultursysteme in Kombination mit multiparametrischer Durchflusszytometrie (mFC) und mikrofluidischen Tumor-on-a-Chip-Geräten (ToCs) ermöglichen eine einfache, schnelle und zuverlässige Überwachung und Charakterisierung jedes Schritts des Krebsimmunitätszyklus und führen zur Identifizierung der Mechanismen, die für die Verschiebung des Gleichgewichts zwischen Krebsimmunüberwachung und Immunevasion verantwortlich sind. Ein gründliches Verständnis der dynamischen Wechselwirkungen zwischen Krebs und Immunzellen liefert entscheidende Erkenntnisse, um Tumore zu überlisten, und wird das Tempo der therapeutischen Personalisierung und Optimierung bei Patienten beschleunigen. Konkret beschreiben wir hier ein unkompliziertes mFC- und ToC-unterstütztes Protokoll, um die dynamische Komplexität jedes Schritts des Krebsimmunitätszyklus in murinen Krebszelllinien und von Mäusen abgeleiteten Immunzellen zu entschlüsseln und uns auf die Immunüberwachung zu konzentrieren. In Anbetracht der zeit- und kostenbezogenen Eigenschaften dieses Protokolls ist es sicherlich in großem Maßstab machbar. Darüber hinaus kann dieses Protokoll mit geringfügigen Variationen sowohl an menschliche Krebszelllinien als auch an humane Immunzellen aus peripherem Blut angepasst und mit einer genetischen und/oder pharmakologischen Hemmung spezifischer Signalwege kombiniert werden, um Biomarker der Immunantwort zu identifizieren.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten stand die Immuntherapie an vorderster Front bei den modernsten Optionen für die Krebsbehandlung. Die Nutzbarmachung des Immunsystems für Antitumorzwecke hat einen leistungsstarken Proof-of-Concept für den Patientennutzen bei verschiedenen hämatologischen und soliden Malignomen mit historisch schlechten Prognosen geliefert. Da die Immuntherapie eine Chance für sonst schwer zu behandelnde Krebsarten bietet, erlebt sie ein erstaunlich schnelles Tempo. Diese Fortschritte sind zumindest teilweise auf das verfeinerte Verständnis des Zusammenspiels zwischen Krebszellen und Immunzellen zurückzuführen. Dieses Zusammenspiel ähnelt einem Feed-Forward-"Motor", den das Immunsystem zündet, um Krebszellen zu zerstören, den sogenannten Krebs-Immun-Zyklus. Diese Immunantwort gegen Krebs verläuft auf drei Hauptebenen: Erkennung, Verarbeitung und Reaktion. Zunächst werden in der Phase der Erkennung Tumorantigene (Ags), die während der Tumorbildung gebildet werden, von absterbenden Krebszellen in der Tumormikroumgebung freigesetzt (TME, Schritt 1) und von tumorinfiltrierenden dendritischen Zellen (DCs, Schritt 2) verschlungen. Als nächstes präsentieren die DCs in der Phase der Prozessierung die Epitope der eingefangenen Tumor-Ags durch die Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC), exprimieren auf ihrer Oberfläche höhere Mengen an kostimulatorischen Molekülen (Schritt 3) und bewegen sich zu tumordrainierenden Lymphknoten (dLNs), um ihre Fracht naiven CD8-T-Zellen zu präsentieren (CD8_N, Schritt 4). Alle diese Schritte laufen im finalen Reaktionsprozess zusammen, in dessen Verlauf tumor-Ag-spezifische cross-primed CD8_{T-Zellen (CD8 C-P}) aktiviert werden, zu Effektor-CD8 T (CD8_E)-Zellen reifen und eine klonale Expansion durchlaufen (Schritt 5). _CD8-E-Zellen verlassen dann die dLNs und gelangen über das Blut zum TME (Schritt 6), wo sie Krebszellen durch die Interaktion zwischen ihrem T-Zell-Rezeptor (TCR) und ihren verwandten Tumor-Ags spezifisch erkennen und an sie binden, zytotoxische Moleküle [d.h. Interferon (IFN)-γ, Perforine und Granzyme (Grzs)] freisetzen und Krebszellen abtöten (Schritt 7)^{1, 2}. Urheberrecht Die Abtötung von Krebszellen führt zur Freisetzung weiterer Tumor-Ags, um den Krebs-Immunitätszyklus zu befeuern. Tatsächlich zerstört und stößt das Immunsystem in all diesen Schritten Krebszellen viel häufiger ab als angenommen. Bei Krebspatienten funktioniert jedoch mindestens einer dieser Schritte nicht richtig. Wir und andere zeigten, dass Krebszellen versuchen, die Immunantwort zu blockieren, indem sie sich entweder zu aggressiveren und immunprivilegierteren Varianten entwickeln ^3,4,5 oder die Wirksamkeit der T-Zellen behindern ^6,7.

Sowohl die Krebsforschung als auch die Entwicklung von Krebsmedikamenten stützen sich auf experimentelle Modelle, die es erlauben, die Beziehung zwischen Krebs und Immunzellen zu untersuchen, die sogenannte Onkoimmunologie. Hier werden schnelle, zuverlässige, reproduzierbare und kostengünstige In-vitro-Modelle beschrieben, die jeden Schritt des onkoimmunologischen Zyklus umfassend reproduzieren und einen schnellen und klaren Überblick über die phänotypischen und funktionellen Merkmalssätze der Immunüberwachung und schließlich des Immuneditierens bieten.

Die multiparametrische Durchflusszytometrie (mFC) ist eines der erfolgreichsten Einzelzellanalysewerkzeuge in der Krebsgrundlagenforschung, -diagnose und -translationalforschung in klinischen Krebsstudien. Da es ermöglicht, mehr Merkmale in jeder Zelle gleichzeitig zu erfassen, hat sich mFC seinen Platz als Goldstandard-Analyseplattform in der Onkoimmunologie verdient. Es verbindet eine hohe Sensitivität und Spezifität mit der Möglichkeit, mehrere Proteinexpressionsmuster und funktionelle Eigenschaften schnell und reproduzierbar auf Einzelzellebene aus heterogenen und sogar heterotypischen Zellsuspensionen, wie denen aus dem TME ^8,9,10, zu messen. Da sowohl phänotypische als auch funktionelle Expressionsmuster zeitkritisch sind, ist eine sorgfältige Beachtung des Versuchsdesigns, der Auswahl geeigneter Panels, Kontrollen und titrierter Antikörper sowie der angemessenen Probenverarbeitung und des Einsatzes von Instrumenten entscheidend für die Zuverlässigkeit, Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und für die sichere Interpretation der Versuchsergebnisse¹¹.

Tumor-on-a-Chip-Mikrofluidiker (ToCs) modellieren die TME, indem sie in vitro mikroskalige Biomimetiken der Dynamik und des Zusammenspiels von Krebs- und Immunzelldynamiken ermöglichen 12,13,14,15. Insbesondere handelt es sich bei ToCs um mikrofluidische Mehrkanal-Zellkulturbauelemente, die in der Lage sind, verschiedene Zelltypen zu beherbergen, die entweder in zweidimensionalen (2D) oder dreidimensionalen (3D) Kulturumgebungen organisiert sind, und die in der Lage sind, wichtige strukturelle und funktionelle Einheiten wie heterotypische zelluläre Wechselwirkungen und Flüsse chemischer Gradienten, die physiologisch im TME auftreten, mit hoher Genauigkeit zu modellieren und mit hoher Präzision zu kontrollieren^12. 13,14,15. Insbesondere die Chemoattraktion und die Trajektorien des Immunsystems sowie die Interaktion von Immunzellen mit Krebszellen können in Echtzeit überwacht und durch Zeitraffermikroskopie und automatisierte Tracking-Analyse quantifiziert werden 5,12,13,14,15,16. Darüber hinaus bieten ToCs die Möglichkeit, entscheidende Prozesse, die die Entstehung und das Fortschreiten von Krebs sowie das Ansprechen auf die Therapie regulieren, sowohl zu analysieren als auch zu manipulieren¹⁷.

In diesem Artikel werden mFC mit ToCs kombiniert, um alle Ebenen der Immunantwort gegen Krebs zu untersuchen, die die DC-vermittelte Phagozytose von Krebs-Ags (Schritte 1-3), das T-Zell-Cross-Priming (Schritt 4), die Aktivierung und die klonale Expansion durchlaufen (letzteres mittels der 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin- (EdU) und Cu(I)-katalysierten Cycloaddition [click]-Technologie, einer hochempfindlichen und genauen Methodik, Schritt 5), CD8-E-Zell-Homing zur TME (Schritt 6) und schließlich CD8-E-Zell-vermittelte Abtötung von Krebszellen (Schritt 7, Abbildung 1).

Diese Arbeit trägt zu den Bemühungen bei, einfache, schnelle und zuverlässige Standardprotokolle zur Untersuchung des Krebs-Immunitäts-Zyklus zu etablieren. Die Verbesserung und Integration von mFC- und ToC-Modellen in die Krebsforschung, die TME-Dynamik und das Ansprechen auf die Therapie bergen ein großes Potenzial, da diese Modelle neben der experimentellen Kontrolle auch biologische Genauigkeit bieten. Daher hilft dieses Protokoll, den Krebs-Immunitäts-Zyklus schrittweise nachzubilden, indem es es ermöglicht, die Rollen einzelner Zellakteure und ihre wechselseitigen Wechselwirkungen auf der Grundlage der natürlichen und erworbenen Immunüberwachung zu charakterisieren, zu überwachen und rechtzeitig zu manövrieren. Dies wird letztendlich dazu beitragen, Tierversuche zu verfeinern, zu reduzieren und zu ersetzen und gleichzeitig wichtige Erkenntnisse zu liefern, um Tumore zu überlisten und die klinische Versorgung zu leiten. Schließlich werden die Vorteile und Grenzen von mFC und ToC kritisch diskutiert und mit modernsten Technologien (z.B. räumliche High-Plex-Analysen mit Einzelzell- und sogar subzellulärer Auflösung) verglichen, um die onkoimmunologische Forschung und Therapie voranzutreiben.

Protokoll

Alle Schritte des Protokolls, das die Verwendung von Tieren vorschreibt, entsprechen der EU-Richtlinie 63/2010 und sind in einem Versuchsprotokoll enthalten, das vom Ausschuss für institutionelle Tierversuche und dem italienischen Gesundheitsministerium genehmigt wurde (Zulassungsnummer 858/2015/PR).

1. Aufbereitung von Krebszellen

1. Routine der Krebszellkultur (Tag -7; Dauer: 2 h)
   1. Züchten Sie murine MCA205-Fibrosarkomzellen in einem Wachstumsmedium 1640 des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 I.E./mL Penicillin G-Natriumsalz, 100 μg/ml Streptomycinsulfat und 50 μg/ml Hygromycin (vollständiges Wachstumsmedium), in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator unter Standardkulturbedingungen (37 °C, 5 % CO₂).
      HINWEIS: Passen Sie die Kulturbedingungen entsprechend der gewählten Zelllinie an. Im Falle eines Auftauens benötigen die Zellen ~1 Woche Erholungszeit, um sich an optimale Kulturbedingungen anzupassen und normale Zellzyklen wiederherzustellen.
   2. Um das Wachstum der Zellkultur zu optimieren, werden die Plattenzellen in^{75 cm 2} Kolben mit einer Dichte von 1 x 10⁶ Zellen/ml in 12-15 mL vollständiges Wachstumsmedium gegeben.
      HINWEIS: Die Anzahl der ausgesäten Zellen kann zwischen verschiedenen Zelllinien variieren, in der Regel abhängig von der spezifischen Zellgröße und der Verdopplungszeit. Der Zellzusammenfluss beeinflusst den Zustand der Zellen dramatisch. Wenn Zellen entweder klein oder zu konfluent sind, können metabolische Störungen auftreten, die einen proliferativen Stillstand, klonale Selektion oder Zellstress begünstigen. Bei MCA205-Zellen muss die Passage zweimal pro Woche in einem Split-Verhältnis von 1:10 bis 1:20 durchgeführt werden.
   3. Wenn Zellkulturen eine maximale Konfluenz von 75 % bis 80 % erreichen, verwerfen Sie das gesamte Wachstumsmedium aus der Zellmonoschicht, waschen Sie die Zellen mit vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um FBS zu entfernen, und fügen Sie dann 1,5 ml vorgewärmte 0,25 % Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für 1-2 Minuten bei 37 °C hinzu, um die Zellen abzulösen.
      HINWEIS: FBS enthält Proteaseinhibitoren, die die enzymatische Aktivität von Trypsin inaktivieren können, daher ist seine vollständige Entfernung ein entscheidender Schritt. Die Inkubationszeit von Trypsin variiert je nach Zelltyp. Als allgemeine Richtlinie gilt, dass die Langzeitinkubation von Zellen mit hoher Trypsinkonzentration vermieden werden sollte, da dies die Zelloberflächenproteine abstreifen und den Zelltod auslösen kann. Überprüfen Sie in diesem Schritt den Zustand der Zellablösung mit einem Lichtmikroskop.
   4. Sammeln Sie abgelöste Zellen in 10 mL vorgewärmtem Wachstumsmedium, um die enzymatische Aktivität von Trypsin zu inaktivieren, und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 1100 × g bei Raumtemperatur (RT). Zählen Sie die Zellen in einem Zellzählobjektträger mit dem Trypanblau-Farbstoffausschlusstest und säen Sie sie dann nach Verdünnung in geeignete Träger für die Erhaltungskultur (nicht mehr als 8 Passagen nach dem Auftauen) oder für nachgelagerte experimentelle Verfahren aus, wie unten beschrieben.
2. Krebszelltod - Freisetzung von Krebszell-Ags (Tag 0; Dauer: 30 min)
   1. Für nachfolgende funktionelle Experimente × Platte 3 10⁶ MCA205-Zellen in einer 100 mm großen Petrischale, die mit Gewebekulturen behandelt wurde, in 10 ml vollständigem Wachstumsmedium.
      HINWEIS: Für spezifische experimentelle Anwendungen (z. B. Analyse der DC-vermittelten Ag-Aufnahme von Tumoren) wurden Krebszellen vor der Induktion des Zelltods mit einem fluoreszierenden Zelllinker (Table of Materials) gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert.
   2. Die Zellen werden 3 min lang mit ultraviolettem (UV) Licht¹⁸ (ƛ = 254 nm) in einem Abstand von 9 cm bestrahlt und anschließend mindestens 6 h lang bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubiert, um sie absterben zu lassen.
      HINWEIS: Der Zelltod von Krebs kann auch durch eine chemotherapeutische Behandlung (z. B. immunogene oder nicht-immunogene Arzneimittel⁵) induziert werden.

2. Co-Kultur von Krebs- und Immunzellen

1. DC-vermittelte Krebs-Ag-Aufnahme und -Präsentation (Tag 0; Zeit: 1 h Bankzeit, 24 h Inkubationszeit)
   1. Nach 4-6 h sammeln Sie DCs, die in vitro aus Knochenmarkzellen (BM) von immunkompetenten Mäusen differenziert wurden, wie zuvor^{beschrieben 8}, und waschen Sie sie zweimal für 5 min bei 1100 x g bei RT in vollständigem Wachstumsmedium.
      HINWEIS: DCs können alternativ aus Maus-Splenozyten durch Zentrifugation auf einem Histodenz-basierten Gradienten isoliert werden, wie zuvor berichtet¹⁹. Wenn kryokonservierte DCs verwendet werden, sollte es eine gute Praxis sein, das gesamte Wachstumsmedium vorzuwärmen und es mit 1:1000 Benzonase zu ergänzen, um ein Verklumpen der Zellen zu verhindern und so eine gute Erholung nach dem Auftauen zu gewährleisten.
   2. Sammeln Sie UV-bestrahlte Krebszellen aus Schritt 1.2.2 und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 1100 x g bei RT. Zählen Sie BM-abgeleitete "leere" DCs (_{DC N}) wie oben beschrieben (siehe Schritt 1.1.4) und setzen Sie dann die Co-Kultur mit UV-bestrahlten apoptotischen Zellen im Verhältnis 2:1 (5 × 10⁵ apoptotische MCA205-Zellen für 2,5 × 10⁵ DCs, wie zuvor optimiert⁸) in 12-Well-Platten in 1 mL frischem vollständigem Wachstumsmedium für 24 h bei 37°C, 5 % CO₂. Als experimentelle Kontrollen werden die Zellen bei 4 °C inkubiert, ein Zustand, bei dem die Phagozytose behindert wird.
      HINWEIS: Vergrößern Sie nicht die Oberfläche und das Volumen der Co-Kultur, da dies die Wechselwirkungen zwischen apoptotischen Krebszellen und DC behindern und somit eine optimale und effektive Phagozytose behindern könnte. Darüber hinaus müssen Studien zur Optimierung des Verhältnisses von Krebszellen zu DC durchgeführt werden, wenn andere Krebszellmodelle verwendet werden.
2. Evaluation der Krebs-Ag-Aufnahme durch mFC (Tag 1; Dauer: 2 h)
   1. Nach 24 Stunden Inkubation sammeln Sie die Zellen in 15-ml-Röhrchen und waschen sie zweimal für 5 Minuten bei 1100 x g bei RT in 10 ml vollständigem Wachstumsmedium.
      HINWEIS: Um das Hintergrundrauschen von apoptotischen Zellen zu reduzieren, die an der DC-Membran haften und noch nicht vollständig verschlungen sind, werden die Zellpellets 5 Minuten lang bei RT mit 0,1 M EDTA inkubiert. Zellsuspensionen (mit ca. 2 x 10⁶ Zellen) werden dann zweimal mit 10 mL Wachstumsmedium zentrifugiert, wie in Schritt 2.2.1.
   2. Für die Färbung der Zelloberfläche resuspendieren Sie BM-abgeleitete DCs in 20 μl kaltfluoreszenzaktiviertem Zellsortierungspuffer (FACS) (1 % FBS, 0,1 M EDTA in PBS), der 0,5 μg entweder IgG-Isotypkontrolle oder Anti-Maus-Phycoerythrin (PE)-konjugiertes CD11c enthält, in einer mit 96 Well U-förmigen Bodengewebekulturen behandelten Mikroplatte und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln, um das Fluorochromsignal zu erhalten und Photobleiche zu vermeiden.
      HINWEIS: Sobald die Aufnahme des Krebsantigens erfolgt, kann die "vollständige" Aktivierung von DC (DC_PHAGO) auch überprüft werden, indem die Expressionsniveaus von kostimulatorischen Molekülen (d. h. entweder CD80 oder CD86 und MHC-II und des Immun-Checkpoint-Liganden CD274-Antigen [am besten bekannt als PDL1]) überprüft werden. Als allgemeine Regel gilt, dass für eine optimale Leistung des Durchflusszytometers die Antikörperkonzentration sorgfältig titriert werden muss und die Zellzahl zwischen 1 x 10⁵ und 1 x 10⁸ Zellen/Test liegen muss.
   3. Danach waschen Sie die Zellen zweimal in FACS-Puffer und fügen Sie 100 μl einer PBS-Lösung hinzu, die einen vitalitätsfixierbaren Nahinfrarotfarbstoff (IR) in einer Endkonzentration von 1 μM für 30 min bei RT enthält.
      HINWEIS: Alternativ können auch andere vitalitätsfixierbare Farbstoffe (z. B. Violett, Blau, Orange, Limette, Aqua) verwendet werden, die sich nicht mit den verwendeten Fluoreszenzemissionen überlappen.
   4. Waschen Sie die Zellen einmal in PBS und resuspendieren Sie sie in FACS-Puffer, bevor Sie die CD11c- und PKH67-Spiegel durchflusszytometrisch mittels mFC analysieren. Gehen Sie während der mFC-Erfassung und dann bei der Datenanalyse mit der folgenden Gating-Strategie vor:
      1. Identifizieren Sie die interessierenden Zellen anhand ihrer Eigenschaften für die Vorwärtsstreufläche (FSC-A, x-Achse) und die Seitenstreufläche (SSC-A, y-Achse) (Tor 1). Schließen Sie Zelldubletten und -klumpen aus der Analyse aus, indem Sie FSC-A (x-Achse) und Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H, y-Achse, Tor 2) plotten.
      2. Entfernen Sie tote Zellen, indem Sie die Filterfläche des 780/60-nm-Emissionsbandpasses (bp) (x-Achse) und SSC-A (y-Achse, Gate 3) darstellen. Basierend auf Gatter 3 wird schließlich die Zellpositivität für den CD11c-Marker und den PKH67-Fluoreszenzzelllinker in Zwei-Parameter-Dichtediagrammen unter Verwendung eines 575/26 nm bzw. 530/30 nm Emissions-bp-Filters nachgewiesen.
   5. Führen Sie Datenanalysen durch.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, Antikörper zu kombinieren, um eine einfache und effiziente Markierung mit gut getrennten Emissionswellenlängen zu gewährleisten. Dies vereinfacht die Kompensationseinstellung für die verwendeten Fluorophore und ermöglicht eine einfache, schnelle und zuverlässige Quantifizierung der interessierenden Parameter.
3. CD8-T-Zell-Priming und -Aktivierung (Tag 1; Dauer: 1 h Bankzeit, 72-96 h Inkubationszeit)
   1. Reinigen Sie murine Milz-CD8-T-Zellen (CD8_N) wie zuvor beschrieben⁸.
   2. Zählen und resuspendieren Sie die isolierten CD8-T-Zellen in 500 μl frischem vollständigem Wachstumsmedium und kultivieren Sie sie mit BM-abgeleiteten DCs, die zuvor apoptotische MCA205-Zellen im Verhältnis 2,5:1 aufgenommen hatten (2,5 × 10⁵ DCs für 1 × 10⁵ T-Zellen, wie zuvor^{optimiert 8}) für 72 h in 12-Well-Platten in einem Endvolumen von 1,5 mL bei 37 °C, 5 % CO₂.
      HINWEIS: Um die experimentellen Ergebnisse hervorzuheben, wurden verschiedene Zellkulturverhältnisse getestet und das beste ausgewählt.
4. Analyse der CD8-T-Zellproliferation mittels EdU mFC-Assay (Tag 4; Dauer: 15 min Bankzeit, 16-20 h Inkubation)
   1. Das Nukleosidanalogon zu Thymidin EdU in das Co-Kulturmedium in einer Endkonzentration von 10 μM geben und gut mischen.
      HINWEIS: Da die Kulturbedingungen, Variationen des Zelltyps und die Zelldichte den Einbau von EdU in die DNA beeinflussen können, sollten Sie in Pilotversuchen eine Reihe von EdU-Konzentrationen und Inkubationszeiten testen. Längere oder kürzere Inkubationen können niedrigere bzw. höhere Konzentrationen erfordern. Fügen Sie Zellen aus derselben Population hinzu, die nicht mit EdU als negative Färbekontrolle behandelt wurden.
   2. Nach 16-20 h CD8_C-P zurückgewinnen und zweimal für 5 min bei 1100 x g bei RT zentrifugieren.
   3. Färben Sie die Zellen für Oberflächenmarker in 20 μl kaltem FACS-Puffer, ergänzt mit 0,5 μg Anti-Maus-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugiertem CD8a und 0,25 μg Anti-Maus-PE-konjugiertem CD3 oder mit den entsprechenden IgG-Isotyp-Kontrollen in einer 96-Well-U-förmigen Boden-TC-behandelten Mikroplatte und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln.
      HINWEIS: Um Interferenzen zu vermeiden, wird empfohlen, vor der Durchführung der Klickreaktion keine Qdot-Antikörperkonjugate zu verwenden.
   4. Die Zellen werden zweimal in FACS-Puffer gewaschen (wie in Schritt 2.2.3) und die Zellpellets in 100 μl einer PBS-Lösung, die den vitalitätsfixierbaren Aqua-Farbstoff enthält, in einer Endkonzentration von 1 μM für 30 min bei RT resuspendiert.
      1. Übertragen Sie die Zellsuspensionen in Durchflussröhrchen, waschen Sie sie einmal mit 3 ml 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS und fahren Sie mit der Zellfixierung in 100 μl eines Fixiermittels (d. h. 4 % Paraformaldehyd in PBS) für 15 Minuten bei RT fort, geschützt vor Licht.
      2. Unmittelbar danach waschen Sie die Zellen einmal mit 3 mL 1% BSA in PBS, inkubieren Sie sie in 100 μl einer Lösung, die 1x Saponin-basierte Permeabilisierung enthält, und waschen Sie das Reagenz für 15 Minuten bei RT und fahren Sie dann direkt mit der Markierungsreaktion fort.
         HINWEIS: 1x Saponin-basiertes Permeabilisierungs- und Waschreagenz wird hergestellt, indem ein Volumen von 10x Lösung 1:10 mit 1% BSA in PBS verdünnt wird. Dieses Reagenz kann auch mit Zellsuspensionen verwendet werden, die Vollblut oder rote Blutkörperchen enthalten, da es die morphologischen Lichtstreueigenschaften von Leukozyten beibehält, während es rote Blutkörperchen lysiert.
      3. Entsprechend der Anzahl der zu analysierenden Proben ist der Reaktionscocktail durch schonendes und sequentielles Mischen der angegebenen Volumina PBS, Kupferschutzkatalysator, Alexa Fluor (AF) 647-konjugiertes Picolylazid und 1x EdU-Pufferadditiv zu mischen.
         1. Verwenden Sie den Reaktionscocktail innerhalb von 15 Minuten nach der Zubereitung. Geben Sie 500 μl des Reaktionsgemisches in jedes Röhrchen, mischen Sie es gut und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
      4. Waschen Sie die Zellen einmal mit 3 ml 1x Saponin-basiertem Permeabilisierungs- und Waschreagenz und resuspendieren Sie sie in 100 μl derselben Lösung, bevor Sie mit Standard-mFC-Methoden zur Bestimmung des prozentualen Anteils von S-Phase-proliferiertem CD8_C-P in der Zellpopulation mittels mFC fortfahren. Gehen Sie während der mFC-Erfassung und dann bei der Datenanalyse mit der folgenden Gating-Strategie vor:
         1. Identifizieren Sie die interessierenden Zellen anhand ihrer Eigenschaften FSC-A (x-Achse) und SSC-A (y-Achse) (Tor 1). Schließen Sie Zelldubletten und -klumpen aus der Analyse aus, indem Sie FSC-A (x-Achse) und FSC-H (y-Achse, Tor 2) plotten. Entfernen Sie tote Zellen, indem Sie die 525/50 nm Emissions-bp-Filterfläche (x-Achse) und SSC-A (y-Achse, Gate 3) plotten.
         2. Nachweis der Zellpositivität für CD8a und CD3 in Zwei-Parameter-Dichtediagrammen unter Verwendung von 530/30 nm bzw. 575/26 nm Emissions-BP-Filtern (Gate 4). Analysieren Sie schließlich auf der Grundlage von Gate 4 die Zellen auf den Einbau von AF647-EdU als mittlere Fluoreszenzintensität in einem Einzelparameter-Histogramm unter Verwendung eines 660/620 nm bp-Emissionsfilters.
            HINWEIS: Das durch die EdU-Markierung erzeugte Fluoreszenzsignal wird am besten mit einer niedrigen Flussrate während der Erfassung erkannt.
      5. Führen Sie Datenanalysen durch.

3. Re-Stimulation von CD8_C-P mit Krebszellen

1. CD8_C-P erkennt lebende Krebszellen (Tag 4; Dauer: 1 h Bankzeit, 48-72 h Inkubation)
   1. CD8_C-P aus der Co-Kultur zurückgewinnen (siehe Schritt 2.3.2) und 10 min bei 1100 x g bei RT in 10 mL vollständigem Wachstumsmedium zentrifugieren.
      HINWEIS: Überprüfen Sie in diesem Schritt die Differenzierung der CD8-T-Zellen, indem Sie die Expressionsniveaus des Aktivierungsmarkers CD95 überprüfen.
   2. Zellpellets, die etwa 2,5 × 10⁶ Zellen enthalten, werden in 100 μl Mikrokügelchen zur Entfernung abgestorbener Zellen pro 1 x 10⁷ Zellen resuspendiert.
      HINWEIS: Für höhere Zellzahlen skalieren Sie das Reagenz- und Gesamtvolumen entsprechend hoch.
   3. Gut mischen und 15 min bei RT inkubieren.
      HINWEIS: Falls erforderlich, wird das Probenvolumen durch Zugabe von 1x Bindungspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers angepasst, um ein Minimum von 500 μl zu erreichen, das für die magnetische Trennung erforderlich ist.
   4. Fahren Sie unmittelbar danach mit der anschließenden magnetischen Zelltrennung fort. Stellen Sie die Trennsäulen in das Magnetfeld eines geeigneten Separators und spülen Sie diese mit der entsprechenden Menge 1x Bindungspuffer aus. Übertragen Sie Zellsuspensionen in Trennsäulen und sammeln Sie den Durchfluss mit der unmarkierten Lebendzellfraktion.
   5. Waschen Sie die Säulen erneut mit der entsprechenden Menge 1x Bindepuffer. Sammeln Sie unmarkierte Zellen, die passieren, und kombinieren Sie sie mit dem Abwasser aus Schritt 3.1.4.
      HINWEIS: Um die Effizienz der magnetischen Entfernung toter Zellen zu erhöhen, kann die lebende Zellfraktion über ein zweites Trennverfahren, wie in den Schritten 3.1.1 bis 3.1.5 beschrieben, mit einer neuen Säule angereichert werden.
   6. Zentrifugieren Sie angereichertes lebendes CD8 C-P für 5 min bei 1100 x g bei RT in vollständigem Wachstumsmedium vor der Zellzählung und kultivieren Sie sie dann mit frischen MCA205-Zellen im Verhältnis 2:1 (1 x 10⁵ CD8_T-Zellen für 5 x 10⁴ MCA205-Zellen, wie zuvor optimiert⁸) in 12-Well-Platten in einem Endvolumen von 1 mL. Nach der Zellaussaat werden die Co-Kulturplatten entweder in einen befeuchteten Zellkultur-Inkubator oder ein Lebendzellanalysesystem für 72 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ gestellt_, bevor Sie mit den nachgeschalteten Assays fortfahren.
2. CD8-T-Zelltransport zu Krebszellen in mikrofluidischen ToC-Modellen (Tag 5; Dauer: 2 h Bankzeit, 72 h Inkubation)
   1. Ad-hoc hergestellte mikrofluidische ToC-Geräte^13,20 unter einem UV-Schrank für 20 min sterilisieren, zweimal mit PBS waschen und dann mindestens 1 h lang mit vollständigem Wachstumsmedium inkubieren.
      HINWEIS: MCA205-Zellen und CD8_C-P werden in diesem Protokoll nicht gefärbt; Beide können jedoch mit fluoreszierenden Live-kompatiblen Zell-Trackern markiert werden.
   2. 1 × 10⁵ MCA205-Zellen werden vorsichtig in 15 μl vollständigem Wachstumsmedium resuspendiert, wobei auf eine homogene Zellverteilung geachtet wird, und sie langsam in die linken Chipkammern (Tumorkammer) injizieren, wie zuvor beschrieben. Warten Sie 5-10 Minuten, damit die Krebszellen an der Chipbasis haften können.
      1. Überprüfen Sie die korrekte und homogene Verteilung der Krebszellen im Mikrofluidik-Chip unter dem Mikroskop. Experimentelle Ergebnisse können durch das Vorhandensein von Blasen beeinflusst werden.
   3. Resuspendieren Sie 1 x 10⁶ CD8_C-P in 50 μl vollständigem Wachstumsmedium. Pipettieren Sie die Immunzellsuspension vorsichtig in die rechtsseitigen Chipkammern (Immunkammer).
      HINWEIS: Verwenden Sie in diesem Schritt ein Mikroskop, um zu bestätigen, dass die Immunzellen in der Zwischenkammer verteilt sind, wodurch eine "Front" entsteht, die den Ausgangspunkt des Experiments darstellt.
   4. Um Druck- und mikrofluidische Schwankungen zu vermeiden, füllen Sie vorsichtig alle Chip-Reservoirs wie zuvor angegeben¹³ mit bis zu 150 μl vollständigem Wachstumsmedium und legen Sie die zusammengesetzten Chips auf einer ebenen Fläche in einen humifizierten Zellkultur-Inkubator bei 37 °C, 5 % CO₂ für mindestens 1 h, um das System vor Zeitrafferaufnahmen zu stabilisieren.
      HINWEIS: Prüfen Sie sorgfältig mögliche Verdunstungsverluste des Volumens in den beiden Behältern jeder Spänekammer und kompensieren Sie diese durch Zugabe von frischem Medium alle 2 bis 3 Tage. Bei Bedarf können bis zu 100 μl Überstände aus jedem Zellkompartiment aspiriert werden, um ein Zytokin-Profiling durchzuführen.
   5. Verwenden Sie eine Videomikroskopie, die mit einem Inkubationssystem ausgestattet ist, um Hellfeld-Bildserien des Mikrokanal-Arrays zwischen den rechten und linken Geräteregionen, die MCA205 bzw. Immunzellen enthalten, aufzuzeichnen und die Dynamik der Infiltration von Immunzellen und der Interaktion zwischen Immunzellen und Krebszellen zu visualisieren.
      HINWEIS: In der hier verwendeten Versuchsanordnung wurden Zeitrafferaufnahmen der Zellen im Inkubator für 72 Stunden mit einem Mikroskop aufgenommen, das alle 2 Minuten ein Mikrofoto aufnahm. Optimieren Sie die Bildgebungsbedingungen, um eine übermäßige Belichtung zu vermeiden und eine hohe Bildrate zu erzielen, um nachgelagerte Immunzellverfolgungsanalysen einfach durchführen zu können. Am Ende des Zeitraffers ist eine halbautomatische Tracking-Analyse^{durchzuführen 13,20}.
3. Durchflusszytometrische Beurteilung_der CD8-E-Aktivierung und Tumorreaktivität (Tag 7 und 8; Dauer: 2 h)
   1. Nach 48 und 72 Stunden Inkubation (siehe Schritt 3.1.6) CD8_E zurückgewinnen und zweimal für 5 min bei 1100 x g bei RT zentrifugieren.
      HINWEIS: Zur Beurteilung der intrazellulären Spiegel zytotoxischer Moleküle, die von CD8_E (d. h. IFN-γ und Grz-B) produziert werden, wurden Krebs-Immunzell-Cokulturen zuvor mindestens 6 Stunden lang mit 1:1000 Brefeldin A und 1:1500 Monensin inkubiert.
   2. Für die Färbung der Zelloberfläche resuspendieren Sie die Zellen in 20 μl von drei verschiedenen Primärantikörpermischungen, die in kaltem FACS-Puffer hergestellt wurden, wie in der ergänzenden Tabelle 1 angegeben.
      ANMERKUNG: Um die Spezifität der Antikörperbindung sicherzustellen, sind mFC-Experimente in Gegenwart geeigneter IgG-Isotypkontrollen wie in Schritt 2.2.2 durchzuführen.
   3. Inkubieren Sie die Zellen in einer mit 96 Well U-förmigen Bodengewebekulturen behandelten Mikroplatte für 20 Minuten bei 4 °C und unter Lichtschutz. Für Zellpellets aus den Mischungen A und B (Ergänzende Tabelle 1) fahren Sie direkt mit Schritt 3.3.5 fort.
   4. Nach einer schnellen Wäsche 100 μl Fixierungs-/Permeabilisierungslösung zu Zellpellets aus Mischung C geben (Ergänzende Tabelle 1). Nach einer Inkubation von 20 min bei 4° C im Dunkeln werden die Zellen zweimal in 200 μl Kaltpermeabilisierungs-/Waschpuffer gewaschen und in 20 μl Kaltpermeabilisierungs-/Waschpuffer resuspendiert, der 0,25 μg Anti-Maus-FITC-konjugiertes IFN-γ und 0,125 μg Anti-Maus-PE-konjugiertes Grz-B enthält, oder mit den jeweiligen IgG-Isotypen. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 4° C vor Licht geschützt.
   5. Danach werden die Zellen zweimal in FACS-Puffer gewaschen und den Zellpellets 100 μl einer PBS-Lösung, die den vitalitätsfixierbaren Aqua-Farbstoff in einer Endkonzentration von 1 μM enthält, für 30 min bei RT (wie in Schritt 2.2.4) zugegeben.
   6. Waschen Sie die Zellen einmal in PBS und resuspendieren Sie sie in FACS-Puffer, bevor die durchflusszytometrische Analyse der Aktivierung von CD8-T-Zellen gegen Krebszellen mittels eines mFC durchgeführt wird. Gehen Sie während der mFC-Erfassung und dann bei der Datenanalyse mit der folgenden Gating-Strategie vor:
      1. Identifizieren Sie die interessierenden Zellen anhand ihrer Eigenschaften FSC-A (x-Achse) und SSC-A (y-Achse) (Tor 1). Schließen Sie Zelldubletten und -klumpen aus der Analyse aus, indem Sie FSC-A (x-Achse) und FSC-H (y-Achse, Tor 2) plotten. Entfernen Sie tote Zellen, indem Sie die 525/50 nm Emissions-bp-Filterfläche (x-Achse) und SSC-A (y-Achse, Gate 3) plotten.
      2. Nachweis der Zellpositivität für CD8a und CD3 in Zwei-Parameter-Dichtediagrammen unter Verwendung von 660/20 nm und 780/60 nm oder 530/30 nm und 575/26 nm Emissions-BP-Filtern (Gate 4). Analysieren Sie schließlich auf der Grundlage von Gate 4 weitere Zellen in Zwei-Parameter-Dichtediagrammen für CD44 (530/30 nm Emission bp Filter), CD25 (575/26 nm Emission bp Filter) und CD69 (450/50 nm Emission bp Filter) Marker für CD137 Marker (660/20 nm Emission bp Filter) und für IFN-γ (530/30 nm Emission bp Filter) und Grz-B (575/26 nm Emission bp Filter) für Mix A, B bzw. C (Ergänzende Tabelle 1).
         HINWEIS: Die Reaktivität von CD8-E-Zell-Tumoren kann weiter getestet werden, indem die Oberflächenexpression des lysosomal-assoziierten CD107a-Proteins durch einen Ad-hoc-Degranulationsassay untersucht wird.
   7. Führen Sie Datenanalysen durch.
4. CD8 E-Zell-vermittelte Tumorabtötungsuntersuchung mittels Lebendzellanalysesystem und mFC (Tag 8; Dauer: 1 h Bankzeit, 72 h Inkubation)
   1. Für einen tumortötenden Assay mittels eines Lebendzellanalysesystems ist das Co-Kulturmedium (siehe Schritt 3.1.6) mit einem Echtzeit-Farbstoff zur Quantifizierung des Zelltods bei einer Endkonzentration von 250 nM zu ergänzen.
   2. Nachdem Sie die Co-Kulturplatten in das Lebendzellanalysesystem eingesetzt haben, lassen Sie die Platte vor dem Scannen 30 Minuten lang auf 37 °C erwärmen. Führen Sie alle 2 bis 72 Stunden einen Datenscan durch, um Zeitrafferaufnahmen zu sammeln, die von der richtigen Software analysiert werden.
   3. Für einen tumortötenden Assay mit mFC werden die Zellen 72 Stunden später (siehe Schritt 3.1.6) zweimal für 5 Minuten bei 1100 x g bei RT entnommen und zentrifugiert.
   4. Färbezellen für Oberflächenmarker in 20 μl kaltem FACS-Puffer, der 0,125 μg entweder IgG-Isotypkontrolle oder Anti-Maus-Pacific-Blue (PB)-konjugiertes CD45 enthält, in einer 96-Well-U-förmigen Boden-TC-behandelten Mikroplatte und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln. Unmittelbar danach waschen Sie die Zellen zweimal in FACS-Puffer und fügen Sie den Vitalitätsfarbstoff Propidiumiodid (PI) in einer Endkonzentration von 1 μM zu, bevor Sie die durchflusszytometrische Analyse durchführen. Gehen Sie während der mFC-Erfassung und dann bei der Datenanalyse mit der folgenden Gating-Strategie vor:
      1. Identifizieren Sie die interessierenden Zellen anhand ihrer Eigenschaften FSC-A (x-Achse) und SSC-A (y-Achse) (Tor 1). Schließen Sie Zelldubletten und -klumpen aus der Analyse aus, indem Sie FSC-A (x-Achse) und FSC-H (y-Achse, Tor 2) plotten.
      2. Nachweis von Krebszellen auf CD45-Negativität mit einem 450/50-nm-Emissions-BP-Filter (Gate 3). Analysieren Sie schließlich die Zellen auf den PI-Einbau als mittlere Fluoreszenzintensität in einem Einzelparameter-Histogramm mit einem 610/620 nm bp-Emissionsfilter.
         HINWEIS: Der Zelltod von Krebs kann auch durch Durchführung eines Annexin V-PI Apoptose-Assays oder durch Beurteilung der Expressionsniveaus von gespaltener Caspase-3 und -7 analysiert werden.
   5. Führen Sie Datenanalysen durch.
      HINWEIS: Die statistischen Analysen wurden mit der Prism GraphPad Software v.8.4.0 durchgeführt.

Ergebnisse

Die Fähigkeit von CD11c⁺ DCs, der weithin bekannten Phagozyten-Untergruppe, die auf die Kreuzpräsentation^21,22 spezialisiert ist und wie in Abbildung 2A gezeigt gated, apoptotische Körper von UV-bestrahlten MCA205-Krebszellen zu verschlingen, die zuvor mit dem PKH67-Fluoreszenzzelllinker markiert waren, wurde mittels mFC untersucht. Wie erwartet, fingen ^CD11c+ DCs apoptotische MCA205-Zellen in vitro ...

Diskussion

Die Überwachung der Immunantwort gegen Krebs ist von größter Bedeutung, um die komplizierten molekularen und zellulären Wechselwirkungen aufzuklären und zu verstehen, die bei der TME wirken und einen ständigen Kampf um die Vorherrschaft unterstützen²³. Im Folgenden stellen wir ein einfaches mFC- und ToC-gestütztes Protokoll zur Überwachung und Charakterisierung der Schritte vor, die den Krebs-Immunitäts-Zyklus ausmachen. Mit geringfügigen Variationen kann dieses Protokoll, das auf murin...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtubes	Eppendorf	30120086
100 kV e-beam litography	Vistec
100 mm Petri dishes	Greiner Bio One	664160
12-well plates	Euroclone	ET3012
15 and 50 mL tubes	Corning	352096; 352070
40 μm cell strainer	Corning	CLS431750
5 mL polystyrene tubes	Greiner Bio-One	120180
70 μm cell strainer	Corning	CLS431751
75 cm2 cell culture treated flask	Euroclone	ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody	Miltenyi Biotec	130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) Antibody	BioLegend	100206
Aptes	Sigma Aldrich	440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug	BD Biosciences	555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)	BD Biosciences	555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD Biosciences	554724
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological, Salem	A1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)	eBioscience	12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)	eBioscience	17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)	eBioscience	25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)	eBioscience	11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	MCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)	eBioscience	48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)	eBioscience	11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)	eBioscience	17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)	eBioscience	53-0951-82
Cell counting slides	Kova International	87144E
Chromium quartz masks	MB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10635
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman Coulter
Dead Cell Removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)	EuroClone	ECB4053L
EDTA	Invitrogen	AM9260G
Fetal bovine serum (FBS)	EuroClone	ECS0180L
Flowjo v10.0.7	Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)	eBioscience	12-8898-82
H2O2	Sigma Aldrich
H2SO4	Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)	Thermo Scientific
Ice machine	Brema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)	eBioscience	11-7311-82
Illustrator CC 2015	Adobe Systems Inc.
ImageJ	National Institute of Health
Incucyte 2022A Software	Sartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells	Sartorius	4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System	Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope	Bulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Angelantoni
L-glutamine 200 mM	EuroClone	ECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L10119
MACS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201; 130-042-401
MACS separators	Miltenyi Biotec	130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell line	Sigma-Aldrich	SCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002552
Microsoft Excel	Microsoft, Redmond
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2	Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT	Nikon Instruments Inc.
Optical litography	EVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate	EuroClone	ECB3001D/1
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201
Pipettes	Eppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits	Sigma-Aldrich	PKH67GL-1KT	fluorescent cell linker  kit
plastic coverslip	IBIDI	10812
Propidium Iodide	Thermo Scientific	P1304MP
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	EuroClone	ECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge Series	Thermo Scientific	75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 series	MicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punches	Kai Medical, Tedpella
Sylgard 184	Dowsil, Dow Corning	101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)	eBioscience	12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS	Sigma Aldrich	92360
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Scientific	15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol Red	EuroClone	ECM0920
Vacuum dessicator