Co-Kultur in vitro Systeme zur Reproduktion des Krebs-Immunitäts-Zyklus

Zusammenfassung

Im Folgenden stellen wir ein einfaches, schnelles und zuverlässiges multiparametrisches Durchflusszytometrie- und Tumor-on-a-Chip-gestütztes Protokoll vor, um die Schritte des Krebsimmunitätszyklus zu überwachen und zu charakterisieren. In der Tat liefert ein gründliches Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Krebs und Immunzellen entscheidende Erkenntnisse, um Tumore zu überlisten und die klinische Versorgung zu leiten.

Zusammenfassung

Sowohl die Grundlagenforschung zur Krebsforschung als auch die Entwicklung wirksamer Gegenangriffstherapien stützen sich auf experimentelle Studien, die die Wechselwirkungen zwischen Krebs und Immunzellen, den sogenannten Krebs-Immun-Zyklus, detailliert beschreiben. In-vitro-Co-Kultursysteme in Kombination mit multiparametrischer Durchflusszytometrie (mFC) und mikrofluidischen Tumor-on-a-Chip-Geräten (ToCs) ermöglichen eine einfache, schnelle und zuverlässige Überwachung und Charakterisierung jedes Schritts des Krebsimmunitätszyklus und führen zur Identifizierung der Mechanismen, die für die Verschiebung des Gleichgewichts zwischen Krebsimmunüberwachung und Immunevasion verantwortlich sind. Ein gründliches Verständnis der dynamischen Wechselwirkungen zwischen Krebs und Immunzellen liefert entscheidende Erkenntnisse, um Tumore zu überlisten, und wird das Tempo der therapeutischen Personalisierung und Optimierung bei Patienten beschleunigen. Konkret beschreiben wir hier ein unkompliziertes mFC- und ToC-unterstütztes Protokoll, um die dynamische Komplexität jedes Schritts des Krebsimmunitätszyklus in murinen Krebszelllinien und von Mäusen abgeleiteten Immunzellen zu entschlüsseln und uns auf die Immunüberwachung zu konzentrieren. In Anbetracht der zeit- und kostenbezogenen Eigenschaften dieses Protokolls ist es sicherlich in großem Maßstab machbar. Darüber hinaus kann dieses Protokoll mit geringfügigen Variationen sowohl an menschliche Krebszelllinien als auch an humane Immunzellen aus peripherem Blut angepasst und mit einer genetischen und/oder pharmakologischen Hemmung spezifischer Signalwege kombiniert werden, um Biomarker der Immunantwort zu identifizieren.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten stand die Immuntherapie an vorderster Front bei den modernsten Optionen für die Krebsbehandlung. Die Nutzbarmachung des Immunsystems für Antitumorzwecke hat einen leistungsstarken Proof-of-Concept für den Patientennutzen bei verschiedenen hämatologischen und soliden Malignomen mit historisch schlechten Prognosen geliefert. Da die Immuntherapie eine Chance für sonst schwer zu behandelnde Krebsarten bietet, erlebt sie ein erstaunlich schnelles Tempo. Diese Fortschritte sind zumindest teilweise auf das verfeinerte Verständnis des Zusammenspiels zwischen Krebszellen und Immunzellen zurückzuführen. Dieses Zusammenspiel ähnelt einem Feed-Forward-"....

Protokoll

Alle Schritte des Protokolls, das die Verwendung von Tieren vorschreibt, entsprechen der EU-Richtlinie 63/2010 und sind in einem Versuchsprotokoll enthalten, das vom Ausschuss für institutionelle Tierversuche und dem italienischen Gesundheitsministerium genehmigt wurde (Zulassungsnummer 858/2015/PR).

1. Aufbereitung von Krebszellen

1. Routine der Krebszellkultur (Tag -7; Dauer: 2 h)
   1. Züchten Sie murine MCA205-Fibrosarkomzellen in einem Wachstumsmedium 1640 des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 I.E./mL Penicillin G-Natriumsalz, 100 μg/m....

Diskussion

Die Überwachung der Immunantwort gegen Krebs ist von größter Bedeutung, um die komplizierten molekularen und zellulären Wechselwirkungen aufzuklären und zu verstehen, die bei der TME wirken und einen ständigen Kampf um die Vorherrschaft unterstützen²³. Im Folgenden stellen wir ein einfaches mFC- und ToC-gestütztes Protokoll zur Überwachung und Charakterisierung der Schritte vor, die den Krebs-Immunitäts-Zyklus ausmachen. Mit geringfügigen Variationen kann dieses Protokoll, das auf murin.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtubes	Eppendorf	30120086
100 kV e-beam litography	Vistec
100 mm Petri dishes	Greiner Bio One	664160
12-well plates	Euroclone	ET3012
15 and 50 mL tubes	Corning	352096; 352070
40 μm cell strainer	Corning	CLS431750
5 mL polystyrene tubes	Greiner Bio-One	120180
70 μm cell strainer	Corning	CLS431751
75 cm2 cell culture treated flask	Euroclone	ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody	Miltenyi Biotec	130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) Antibody	BioLegend	100206
Aptes	Sigma Aldrich	440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug	BD Biosciences	555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)	BD Biosciences	555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD Biosciences	554724
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological, Salem	A1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)	eBioscience	12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)	eBioscience	17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)	eBioscience	25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)	eBioscience	11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	MCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)	eBioscience	48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)	eBioscience	11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)	eBioscience	17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)	eBioscience	53-0951-82
Cell counting slides	Kova International	87144E
Chromium quartz masks	MB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10635
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman Coulter
Dead Cell Removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)	EuroClone	ECB4053L
EDTA	Invitrogen	AM9260G
Fetal bovine serum (FBS)	EuroClone	ECS0180L
Flowjo v10.0.7	Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)	eBioscience	12-8898-82
H2O2	Sigma Aldrich
H2SO4	Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)	Thermo Scientific
Ice machine	Brema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)	eBioscience	11-7311-82
Illustrator CC 2015	Adobe Systems Inc.
ImageJ	National Institute of Health
Incucyte 2022A Software	Sartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells	Sartorius	4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System	Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope	Bulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Angelantoni
L-glutamine 200 mM	EuroClone	ECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L10119
MACS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201; 130-042-401
MACS separators	Miltenyi Biotec	130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell line	Sigma-Aldrich	SCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002552
Microsoft Excel	Microsoft, Redmond
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2	Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT	Nikon Instruments Inc.
Optical litography	EVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate	EuroClone	ECB3001D/1
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201
Pipettes	Eppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits	Sigma-Aldrich	PKH67GL-1KT	fluorescent cell linker  kit
plastic coverslip	IBIDI	10812
Propidium Iodide	Thermo Scientific	P1304MP
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	EuroClone	ECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge Series	Thermo Scientific	75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 series	MicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punches	Kai Medical, Tedpella
Sylgard 184	Dowsil, Dow Corning	101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)	eBioscience	12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS	Sigma Aldrich	92360
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Scientific	15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol Red	EuroClone	ECM0920
Vacuum dessicator