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Co-culture de systèmes in vitro pour reproduire le cycle cancer-immunité
Dans cet article
Résumé
Ici, nous détaillons un protocole simple, rapide et fiable assisté par cytométrie en flux multiparamétrique et tumeur sur puce pour surveiller et caractériser les étapes constituant le cycle cancer-immunité. En effet, une compréhension approfondie des interactions entre le cancer et les cellules immunitaires fournit des informations essentielles pour déjouer les tumeurs et guider les soins cliniques.
Résumé
La recherche fondamentale sur le cancer et le développement de thérapies efficaces contre les attaques reposent toutes deux sur des études expérimentales détaillant les interactions entre le cancer et les cellules immunitaires, ce que l’on appelle le cycle cancer-immunité. Des systèmes de co-culture in vitro combinés à la cytométrie en flux multiparamétrique (mFC) et aux dispositifs microfluidiques (ToC) de tumeur sur puce permettent une surveillance et une caractérisation simples, rapides et fiables de chaque étape du cycle cancer-immunité et permettent d’identifier les mécanismes responsables de faire pencher la balance entre l’immunosurveillance du cancer et l’immunoévasion. Une compréhension approfondie des interactions dynamiques entre le cancer et les cellules immunitaires fournit des informations essentielles pour déjouer les tumeurs et accélérera le rythme de la personnalisation et de l’optimisation thérapeutiques chez les patients. Plus précisément, nous détaillons ici un protocole simple assisté par mFC et ToC pour démêler les complexités dynamiques de chaque étape du cycle cancer-immunité dans les lignées cellulaires cancéreuses murines et les cellules immunitaires dérivées de souris, et nous nous concentrons sur l’immunosurveillance. Compte tenu des caractéristiques liées au temps et à l’argent de ce protocole, il est certainement réalisable à grande échelle. De plus, avec des variations mineures, ce protocole peut être à la fois adapté aux lignées cellulaires cancéreuses humaines et aux cellules immunitaires dérivées du sang périphérique humain et combiné à une inhibition génétique et/ou pharmacologique de voies spécifiques afin d’identifier des biomarqueurs de la réponse immunitaire.
Introduction
Au cours des dernières décennies, l’immunothérapie a été à l’avant-garde des options de pointe pour le traitement du cancer. L’exploitation du système immunitaire à des fins antitumorales a fourni une puissante preuve de concept au profit des patients pour diverses hémopathies malignes et solides avec des pronostics historiquement mauvais. Comme l’immunothérapie offre une opportunité pour des cancers autrement difficiles à traiter, elle connaît un rythme de progrès étonnamment rapide. De tels progrès peuvent être, au moins en partie, attribués à la compréhension affinée de l’interaction entre les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires. Cette interaction res....
Protocole
Toutes les étapes du protocole nécessitant l’utilisation d’animaux sont conformes à la directive européenne 63/2010 et incluses dans un protocole expérimental approuvé par le Comité institutionnel d’expérimentation animale et le ministère italien de la Santé (numéro d’approbation 858/2015/PR).
1. Préparation des cellules cancéreuses
- Routine de culture de cellules cancéreuses (jour -7 ; durée : 2 h)
- Cultivez des cellules murines de fibrosarcome MCA205 dans un milieu de croissance 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 UI/mL ....
Résultats Représentatifs
La capacité des CD CD11c+, le sous-ensemble de phagocytes largement connu spécialisé pour la présentation croisée21,22 et déclenché, comme le montre la figure 2A, à engloutir les corps apoptotiques à partir de cellules cancéreuses MCA205 irradiées par UV qui étaient précédemment marquées avec le lieur de cellules fluorescentes PKH67 a été évaluée par mFC. Comme prévu, les CD CD11c+ ont captur.......
Discussion
Le suivi de la réponse immunitaire anticancéreuse est de la plus haute importance pour élucider et comprendre les interactions moléculaires et cellulaires complexes qui agissent dans le TME et soutiennent une lutte constante pour la suprématie23. Nous détaillons ici un protocole simple assisté par mFC et ToC pour le suivi et la caractérisation des étapes constituant le cycle cancer-immunité. Avec des variations mineures, ce protocole, basé sur des lignées cellulaires murines et des cel.......
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
A.S. est soutenu par AIRC (IG #28807) et par PRIN (#P2022YE2MX). M.M. est soutenu par la bourse AIRC-FIRC (#25558). A.D.N. est soutenu par l’écosystème d’innovation Rome Technopole ECS00000024 financé par l’UE - Next Generation EU, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.
....matériels
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorf | 30120086 | |
| 100 kV e-beam litography | Vistec | ||
| 100 mm Petri dishes | Greiner Bio One | 664160 | |
| 12-well plates | Euroclone | ET3012 | |
| 15 and 50 mL tubes | Corning | 352096; 352070 | |
| 40 μm cell strainer | Corning | CLS431750 | |
| 5 mL polystyrene tubes | Greiner Bio-One | 120180 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| 75 cm2 cell culture treated flask | Euroclone | ET7076 | |
| Adsorbent wipes | |||
| Allumin foil | |||
| anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-319 | |
| anti-mouse CD25 (7D4) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-118-678 | |
| anti-mouse CD3 (17A2) Antibody | BioLegend | 100206 | |
| Aptes | Sigma Aldrich | 440140 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
| BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological, Salem | A1312 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418) | eBioscience | 12-0114-81 | |
| CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5) | eBioscience | 17-1371-82 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (17A2) | eBioscience | 25-0032-82 | |
| CD44 Monoclonal Antibody (IM7) | eBioscience | 11-0441-82 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | MCD4528 | |
| CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3) | eBioscience | 48-0691-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 11-0081-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7) | eBioscience | 53-0951-82 | |
| Cell counting slides | Kova International | 87144E | |
| Chromium quartz masks | MB W&A, Germany | ||
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10635 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | EuroClone | ECB4053L | |
| EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| Fetal bovine serum (FBS) | EuroClone | ECS0180L | |
| Flowjo v10.0.7 | Flowjo, LLC | ||
| Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB) | eBioscience | 12-8898-82 | |
| H2O2 | Sigma Aldrich | ||
| H2SO4 | Sigma Aldrich | ||
| hotplate | |||
| Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2) | Thermo Scientific | ||
| Ice machine | Brema Ice Makers | ||
| IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2) | eBioscience | 11-7311-82 | |
| Illustrator CC 2015 | Adobe Systems Inc. | ||
| ImageJ | National Institute of Health | ||
| Incucyte 2022A Software | Sartorius | ||
| Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells | Sartorius | 4632 | |
| Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System | Sartorius | ||
| JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope | Bulldog Bio | ||
| Laboratory bench | |||
| Laboratory refrigerator (4°C) | |||
| Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Angelantoni | ||
| L-glutamine 200 mM | EuroClone | ECB3004D | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34957 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L10119 | |
| MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201; 130-042-401 | |
| MACS separators | Miltenyi Biotec | 130-042-10; 130-042-302 | |
| MCA205 mouse fibrosarcoma cell line | Sigma-Aldrich | SCC173 | |
| Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine | |||
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002552 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Redmond | ||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-096-543 | |
| Nikon ECLIPSE Ts2 | Nikon Instruments Inc. | ||
| NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT | Nikon Instruments Inc. | ||
| Optical litography | EVG | ||
| Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate | EuroClone | ECB3001D/1 | |
| Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | |
| Pipettes | Eppendorf | ||
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | PKH67GL-1KT | fluorescent cell linker kit |
| plastic coverslip | IBIDI | 10812 | |
| Propidium Iodide | Thermo Scientific | P1304MP | |
| Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab | ||
| Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | EuroClone | ECB9006L | |
| serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489 | |
| SL 16 Centrifuge Series | Thermo Scientific | 75004031 | |
| Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers | |||
| Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | |
| SU-8 3000 series | MicroChem corp, Newton, (MA) | ||
| Suite of dermal biopsy punches | Kai Medical, Tedpella | ||
| Sylgard 184 | Dowsil, Dow Corning | 101697 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597) | eBioscience | 12-5961-82 | |
| Thermostatic bath | |||
| Timer | |||
| TMCS | Sigma Aldrich | 92360 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA w/ Phenol Red | EuroClone | ECM0920 | |
| Vacuum dessicator |
Références
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.
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