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がん免疫サイクルを再現するためのin vitro共培養システム
要約
ここでは、がん免疫サイクルを構成するステップをモニターし、特性評価するための、シンプルで高速、かつ信頼性の高いマルチパラメトリックフローサイトメトリーおよびTumor-on-a-chip支援プロトコルについて詳しく説明します。実際、がんと免疫細胞の相互作用を完全に理解することで、腫瘍を出し抜き、臨床ケアを導くための重要な洞察が得られます。
要約
がんの基礎研究と効果的な反撃療法の開発は、どちらもがんと免疫細胞との相互作用、いわゆるがん免疫サイクルを詳述した実験的研究に依存しています。マルチパラメトリックフローサイトメトリー(mFC)およびTumor-on-a-chipマイクロ流体デバイス(ToC)と組み合わせた in vitro 共培養システムにより、がん免疫サイクルの各ステップの簡単、迅速、かつ信頼性の高いモニタリングと特性評価が可能になり、がん免疫サーベイランスと免疫回避のバランスを崩すメカニズムの特定につながります。がんと免疫細胞の間のダイナミックな相互作用を完全に理解することで、腫瘍を出し抜くための重要な洞察が得られ、患者の治療の個別化と最適化のペースが加速します。具体的には、ここでは、マウスがん細胞株およびマウス由来免疫細胞におけるがん免疫サイクルの各ステップのダイナミックな複雑さを解明し、免疫サーベイランスに焦点を当てるための、mFCおよびToCを用いた簡単なプロトコールについて詳しく説明します。このプロトコルの時間とコストに関連する特性を考慮すると、大規模に実現可能であることは確かです。さらに、わずかなバリエーションで、このプロトコルは、ヒト癌細胞株およびヒト末梢血由来免疫細胞に適合させることができ、免疫応答のバイオマーカーを特定するために、特定の経路の遺伝的および/または薬理学的阻害と組み合わせることができます。
概要
過去数十年にわたり、免疫療法はがん治療の最先端の選択肢の最前線に立ってきました。免疫系を抗腫瘍目的で利用することで、歴史的に予後が不良な多様な血液学的および固形悪性腫瘍に対する患者の利益のための強力な概念実証が提供されました。免疫療法は、他の方法では治療が困難ながんに機会を提供しているため、驚くほど速いペースで進歩しています。このような進歩は、少なくとも部分的には、がん細胞と免疫細胞の相互作用についての高度な理解に起因する可能性があります。この相互作用は、免疫系ががん細胞を破壊するために発火するフィードフォワードの「エンジン」、いわゆるがん免疫サイクルに似ています。この抗がん免疫応答は、認識、処理、反応の3つの主要なレベルで進行します。まず、認識の段階では、腫瘍形成中に産生された腫瘍抗原(Ag)は、腫瘍微小環境(TME、ステップ1)で死にかけているがん細胞から放出され(TME、ステップ1)、腫瘍浸潤樹状細胞(DC、ステップ2)に飲み込まれます。次に、プロセシングの段階では、DCは、捕捉された腫瘍Agsのエピトープを主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子を介して提示し、その表面で高レベルの共刺激分子を発現し(ステップ3)、腫瘍排出リンパ節(dLN)に移動して、そのカーゴをナイーブCD8T細胞に交差提示します(CD8N、ステップ4)。これらすべてのステップは、腫瘍Ag特異的クロスプライミングCD8 T細胞(CD8C-P)が活性化され、エフェクターCD8 T(CD8E)細....
プロトコル
動物の使用を義務付ける議定書のすべてのステップは、EU指令63/2010に準拠しており、施設動物実験委員会とイタリア保健省によって承認された実験議定書(承認番号858/2015/PR)に含まれています。
1. がん細胞の調製
- がん細胞培養ルーチン (-7日目; 期間: 2 時間)
- ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640増殖培地に10%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、100 IU / mLペニシリンGナトリウム塩、100 μg / mL硫酸ストレプトマイシン、および50 μg / mLハイグロマイシン(完全増殖培地)を添加したマウスMCA205線維肉腫細胞を、加湿細胞培養インキュベーターで標準培養条件(37°C、 5%CO2)。
注:選択した細胞株に応じて培養条件を適応させてください。解凍の場合、細胞が最適な培養条件に適応し、正常な細胞周期を再確立するために、~1週間の回復時間が必要です。 - 細胞培養の増殖を最適化するために、75 cm2 フラスコに細胞を1 x 106細胞/ mLの密度で12〜15 mLの完全増殖培地でプレート化します。
注:播種された細胞の数は、通常、特定の細胞サイズと倍加時間に応じて、異なる細胞株間で異なる場合があります。細胞のコンフル....
- ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640増殖培地に10%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、100 IU / mLペニシリンGナトリウム塩、100 μg / mL硫酸ストレプトマイシン、および50 μg / mLハイグロマイシン(完全増殖培地)を添加したマウスMCA205線維肉腫細胞を、加湿細胞培養インキュベーターで標準培養条件(37°C、 5%CO2)。
代表的な結果
CD11c+ DCsは、交差提示21,22に特化し、図2Aに示すようにゲート化された広く知られている食細胞サブセットであり、以前にPKH67蛍光細胞リンカーで標識されたUV照射MCA205癌細胞からのアポトーシス体を飲み込む能力をmFCによって評価した。予想通り、CD11c+ DCは、37°Cではin vitroでアポトーシスMCA205細胞を効率.......
ディスカッション
抗がん免疫応答のモニタリングは、TMEで作用し、覇権をめぐる絶え間ない戦いを支える複雑な分子的および細胞的相互作用を解明し理解するために最も重要である23。ここでは、がん免疫サイクルを構成するステップのモニタリングと特性評価のための簡単なmFCおよびToC支援プロトコルについて詳しく説明します。マウス細胞株とマウス由来免疫細胞をベースにしたこのプ?.......
開示事項
著者には、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
A.S. は AIRC (IG #28807) と PRIN (#P2022YE2MX) によってサポートされています。M.M.はAIRC-FIRCフェローシップ(#25558)の支援を受けています。A.D.N.は、イノベーションエコシステムローマテクノポールECS00000024、EU - 次世代EU、PNRRミッション4、コンポーネント2、投資1.5の資金提供を受けています。
....資料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorf | 30120086 | |
| 100 kV e-beam litography | Vistec | ||
| 100 mm Petri dishes | Greiner Bio One | 664160 | |
| 12-well plates | Euroclone | ET3012 | |
| 15 and 50 mL tubes | Corning | 352096; 352070 | |
| 40 μm cell strainer | Corning | CLS431750 | |
| 5 mL polystyrene tubes | Greiner Bio-One | 120180 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| 75 cm2 cell culture treated flask | Euroclone | ET7076 | |
| Adsorbent wipes | |||
| Allumin foil | |||
| anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-319 | |
| anti-mouse CD25 (7D4) Antibody | Miltenyi Biotec | 130-118-678 | |
| anti-mouse CD3 (17A2) Antibody | BioLegend | 100206 | |
| Aptes | Sigma Aldrich | 440140 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
| BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological, Salem | A1312 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418) | eBioscience | 12-0114-81 | |
| CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5) | eBioscience | 17-1371-82 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (17A2) | eBioscience | 25-0032-82 | |
| CD44 Monoclonal Antibody (IM7) | eBioscience | 11-0441-82 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | MCD4528 | |
| CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3) | eBioscience | 48-0691-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 11-0081-82 | |
| CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7) | eBioscience | 53-0951-82 | |
| Cell counting slides | Kova International | 87144E | |
| Chromium quartz masks | MB W&A, Germany | ||
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10635 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | EuroClone | ECB4053L | |
| EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| Fetal bovine serum (FBS) | EuroClone | ECS0180L | |
| Flowjo v10.0.7 | Flowjo, LLC | ||
| Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB) | eBioscience | 12-8898-82 | |
| H2O2 | Sigma Aldrich | ||
| H2SO4 | Sigma Aldrich | ||
| hotplate | |||
| Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2) | Thermo Scientific | ||
| Ice machine | Brema Ice Makers | ||
| IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2) | eBioscience | 11-7311-82 | |
| Illustrator CC 2015 | Adobe Systems Inc. | ||
| ImageJ | National Institute of Health | ||
| Incucyte 2022A Software | Sartorius | ||
| Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells | Sartorius | 4632 | |
| Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System | Sartorius | ||
| JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope | Bulldog Bio | ||
| Laboratory bench | |||
| Laboratory refrigerator (4°C) | |||
| Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Angelantoni | ||
| L-glutamine 200 mM | EuroClone | ECB3004D | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34957 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L10119 | |
| MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201; 130-042-401 | |
| MACS separators | Miltenyi Biotec | 130-042-10; 130-042-302 | |
| MCA205 mouse fibrosarcoma cell line | Sigma-Aldrich | SCC173 | |
| Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine | |||
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002552 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Redmond | ||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-096-543 | |
| Nikon ECLIPSE Ts2 | Nikon Instruments Inc. | ||
| NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT | Nikon Instruments Inc. | ||
| Optical litography | EVG | ||
| Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate | EuroClone | ECB3001D/1 | |
| Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | |
| Pipettes | Eppendorf | ||
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | PKH67GL-1KT | fluorescent cell linker kit |
| plastic coverslip | IBIDI | 10812 | |
| Propidium Iodide | Thermo Scientific | P1304MP | |
| Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab | ||
| Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) | EuroClone | ECB9006L | |
| serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489 | |
| SL 16 Centrifuge Series | Thermo Scientific | 75004031 | |
| Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers | |||
| Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | |
| SU-8 3000 series | MicroChem corp, Newton, (MA) | ||
| Suite of dermal biopsy punches | Kai Medical, Tedpella | ||
| Sylgard 184 | Dowsil, Dow Corning | 101697 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597) | eBioscience | 12-5961-82 | |
| Thermostatic bath | |||
| Timer | |||
| TMCS | Sigma Aldrich | 92360 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA w/ Phenol Red | EuroClone | ECM0920 | |
| Vacuum dessicator |
参考文献
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.
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