著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ここでは、がん免疫サイクルを構成するステップをモニターし、特性評価するための、シンプルで高速、かつ信頼性の高いマルチパラメトリックフローサイトメトリーおよびTumor-on-a-chip支援プロトコルについて詳しく説明します。実際、がんと免疫細胞の相互作用を完全に理解することで、腫瘍を出し抜き、臨床ケアを導くための重要な洞察が得られます。

要約

がんの基礎研究と効果的な反撃療法の開発は、どちらもがんと免疫細胞との相互作用、いわゆるがん免疫サイクルを詳述した実験的研究に依存しています。マルチパラメトリックフローサイトメトリー(mFC)およびTumor-on-a-chipマイクロ流体デバイス(ToC)と組み合わせた in vitro 共培養システムにより、がん免疫サイクルの各ステップの簡単、迅速、かつ信頼性の高いモニタリングと特性評価が可能になり、がん免疫サーベイランスと免疫回避のバランスを崩すメカニズムの特定につながります。がんと免疫細胞の間のダイナミックな相互作用を完全に理解することで、腫瘍を出し抜くための重要な洞察が得られ、患者の治療の個別化と最適化のペースが加速します。具体的には、ここでは、マウスがん細胞株およびマウス由来免疫細胞におけるがん免疫サイクルの各ステップのダイナミックな複雑さを解明し、免疫サーベイランスに焦点を当てるための、mFCおよびToCを用いた簡単なプロトコールについて詳しく説明します。このプロトコルの時間とコストに関連する特性を考慮すると、大規模に実現可能であることは確かです。さらに、わずかなバリエーションで、このプロトコルは、ヒト癌細胞株およびヒト末梢血由来免疫細胞に適合させることができ、免疫応答のバイオマーカーを特定するために、特定の経路の遺伝的および/または薬理学的阻害と組み合わせることができます。

概要

過去数十年にわたり、免疫療法はがん治療の最先端の選択肢の最前線に立ってきました。免疫系を抗腫瘍目的で利用することで、歴史的に予後が不良な多様な血液学的および固形悪性腫瘍に対する患者の利益のための強力な概念実証が提供されました。免疫療法は、他の方法では治療が困難ながんに機会を提供しているため、驚くほど速いペースで進歩しています。このような進歩は、少なくとも部分的には、がん細胞と免疫細胞の相互作用についての高度な理解に起因する可能性があります。この相互作用は、免疫系ががん細胞を破壊するために発火するフィードフォワードの「エンジン」、いわゆるがん免疫サイクルに似ています。この抗がん免疫応答は、認識、処理、反応の3つの主要なレベルで進行します。まず、認識の段階では、腫瘍形成中に産生された腫瘍抗原(Ag)は、腫瘍微小環境(TME、ステップ1)で死にかけているがん細胞から放出され(TME、ステップ1)、腫瘍浸潤樹状細胞(DC、ステップ2)に飲み込まれます。次に、プロセシングの段階では、DCは、捕捉された腫瘍Agsのエピトープを主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子を介して提示し、その表面で高レベルの共刺激分子を発現し(ステップ3)、腫瘍排出リンパ節(dLN)に移動して、そのカーゴをナイーブCD8T細胞に交差提示します(CD8N、ステップ4)。これらすべてのステップは、腫瘍Ag特異的クロスプライミングCD8 T細胞(CD8C-P)が活性化され、エフェクターCD8 T(CD8E)細胞に成熟し、クローン増殖を受ける反応の最終プロセスに収束します(ステップ5)。その後、CD8E細胞はdLNを離れ、血液を介してTMEに帰宅し(ステップ6)、そこでT細胞受容体(TCR)と同族の腫瘍Agとの間の相互作用を通じてがん細胞を特異的に認識して結合し、細胞傷害性分子[すなわち、インターフェロン(IFN)-γ、パーフォリン、グランザイム(Grzs)]を放出し、がん細胞を殺します(ステップ7)1、2.がん細胞の死滅は、がん免疫サイクルを促進するためのさらなる腫瘍Agsの放出につながります。実際のところ、これらすべてのステップを通じて、免疫系は想定よりもはるかに頻繁にがん細胞を破壊し、拒絶します。しかし、がん患者では、これらのステップの少なくとも1つは適切に機能しません。我々と他の研究者は、がん細胞がより攻撃的で免疫特権的な変異体3,4,5に進化するか、T細胞の有効性6,7を妨げることによって、免疫応答を失速させようとしていることを示した。

がん研究とがん治療薬の開発はどちらも、がんと免疫細胞との関係を研究するための実験モデル、いわゆるがん免疫学に依存しています。ここでは、腫瘍免疫学サイクルの各ステップを包括的に再現し、免疫サーベイランス、そして最終的には免疫編集の表現型および機能的特徴セットを迅速かつ明確に把握できる、迅速で信頼性が高く、再現性があり、低コストの in vitro モデルについて説明します。

マルチパラメトリックフローサイトメトリー(mFC)は、がんの基礎研究、診断、およびがん臨床試験におけるトランスレーショナルリサーチにおいて、最も成功したシングルセル解析ツールの1つです。mFCは、各細胞のより多くの特徴を同時に捕捉できるため、腫瘍免疫学におけるゴールドスタンダード分析プラットフォームとしての地位を確立しています。高い感度と特異性を兼ね備えており、TME 8,9,10のような不均一な細胞懸濁液や異型細胞懸濁液から、単一細胞レベルで複数のタンパク質発現パターンと機能特性を迅速かつ再現性よく測定することができます。表現型と機能的発現パターンはどちらも時間に敏感であるため、実験デザイン、適切なパネル、コントロール、滴定抗体の選択、および適切なサンプル処理と装置の使用に細心の注意を払うことは、結果の信頼性、比較可能性、再現性、および実験結果を自信を持って解釈するために重要です11。

Tumor-on-a-chip Microfluidic Devices(ToC)は、がんと免疫細胞のダイナミクスと相互作用のin vitroマイクロスケールの生体模倣を可能にすることにより、TMEをモデル化します12,13,14,15。具体的には、ToCは、2次元(2D)または3次元(3D)培養設定で組織化された多様な細胞タイプをホストできるマルチチャネルマイクロ流体細胞培養デバイスであり、高い忠実度でモデル化し、TME12で生理学的に発生する異型細胞相互作用や化学勾配の流れなどの主要な構造的および機能単位を高精度で制御することができます。13、14、15。特に、免疫の化学引力と軌跡、ならびに免疫細胞とがん細胞との相互作用は、リアルタイムでモニタリングし、タイムラプス顕微鏡および自動追跡分析5,12,13,14,15,16によって定量化することができる。さらに、ToCは、がんの発症と進行、および治療への反応を調節する重要なプロセスを分析および操作する可能性を提供します17。

この記事では、mFCとToCを組み合わせて、がんAgsのDC媒介性食作用(ステップ1〜3)、T細胞クロスプライミング(ステップ4)、活性化およびクローン増殖(最後は5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびCu(I)触媒による環化付加[クリック]技術、高感度で正確な方法論による抗がん免疫応答のすべてのレベルを研究します。 ステップ5)、CD8E 細胞のTMEへのホーミング(ステップ6)、最後にCD8E細胞を介したがん細胞の死滅(ステップ7、 図1)。

この研究は、がん免疫サイクルを研究するためのシンプルで迅速、かつ信頼性の高い標準プロトコルを確立するための取り組みに貢献しています。mFCモデルとToCモデルの改善と統合は、これらのモデルが生物学的忠実度と実験的制御を提供するため、がん研究、TMEダイナミクス、および治療への反応に大きな可能性を秘めています。したがって、このプロトコルは、個々の細胞プレーヤーの役割と自然免疫および獲得免疫サーベイランスに対するそれらの相互相互作用を特徴付け、監視し、タイムリーに操作することを可能にすることにより、癌免疫サイクルを段階的に再現するのに役立ちます。これにより、最終的には動物実験の改良、削減、置き換えに役立ち、腫瘍を出し抜き、臨床ケアを導くための重要な洞察を得ることができます。最後に、mFCとToCの利点と限界について批判的に議論し、最先端の技術(シングルセルでの高プレックス空間解析や細胞内分解能など)と比較することで、腫瘍免疫学の研究と治療を前進させます。

プロトコル

動物の使用を義務付ける議定書のすべてのステップは、EU指令63/2010に準拠しており、施設動物実験委員会とイタリア保健省によって承認された実験議定書(承認番号858/2015/PR)に含まれています。

1. がん細胞の調製

  1. がん細胞培養ルーチン (-7日目; 期間: 2 時間)
    1. ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640増殖培地に10%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、100 IU / mLペニシリンGナトリウム塩、100 μg / mL硫酸ストレプトマイシン、および50 μg / mLハイグロマイシン(完全増殖培地)を添加したマウスMCA205線維肉腫細胞を、加湿細胞培養インキュベーターで標準培養条件(37°C、 5%CO2)。
      注:選択した細胞株に応じて培養条件を適応させてください。解凍の場合、細胞が最適な培養条件に適応し、正常な細胞周期を再確立するために、~1週間の回復時間が必要です。
    2. 細胞培養の増殖を最適化するために、75 cm2 フラスコに細胞を1 x 106細胞/ mLの密度で12〜15 mLの完全増殖培地でプレート化します。
      注:播種された細胞の数は、通常、特定の細胞サイズと倍加時間に応じて、異なる細胞株間で異なる場合があります。細胞のコンフルエンスは、細胞の状態に大きく影響します。細胞が小さいか、またはコンフルエントすぎると、代謝の摂動が発生し、増殖停止、クローン選択、または細胞ストレスに有利になる可能性があります。MCA205細胞の場合、継代は週に2回、1:10-1:20の分割比で行う必要があります。
    3. 細胞培養が75%〜80%の最大コンフルエンシーに達したら、細胞単層から完全な増殖培地を廃棄し、事前に温めたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄してFBSを除去し、次に予め温めた0,25%トリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を1.5mL追加し、37°Cで1〜2分間細胞を分離します。
      注:FBSには、トリプシンの酵素活性を不活性化する可能性のあるプロテアーゼ阻害剤が含まれているため、その完全な除去は重要なステップです。トリプシンのインキュベーション時間は、細胞の種類によって異なります。一般的なガイドラインとして、トリプシン濃度の高い細胞の長期インキュベーションは、細胞表面タンパク質を縞模様にし、細胞死を引き起こす可能性があるため、避けてください。このステップでは、細胞の剥離状態を光学顕微鏡で確認します。
    4. 分離した細胞を予熱した全増殖培地10 mLに集めてトリプシンの酵素活性を不活性化し、室温(RT)で1100 × g で5分間遠心分離します。Trypan Blue色素排除試験を使用して細胞計数スライドで細胞をカウントし、希釈後に適切な支持体に再播種して、維持培養(解凍から8継代以内)または以下に詳述するように下流の実験手順のために再播種します。
  2. がん細胞死 - がん細胞Agsの放出(0日目、持続時間:30分)
    1. 下流の機能実験では、100 mmの組織培養処理済みペトリ皿に3 ×10 6 MCA205細胞を10 mLの完全増殖培地でプレートします。
      注:特定の実験的アプリケーション(例えば、DC媒介性腫瘍Ag取り込みの分析)では、細胞死を誘導する前に、癌細胞は、製造元の指示に従って、蛍光細胞リンカー(材料の表)を使用して標識されています。
    2. 細胞に紫外線(UV)光18(ƛ= 254nm)を9cmの距離で3分間照射し、次いで37°C、5%CO2 で少なくとも6時間インキュベートして死滅させます。
      注:がん細胞死は、化学療法治療(免疫原性または非免疫原性薬5など)によっても誘発される可能性があります。

2. がん細胞と免疫細胞の共培養

  1. DC媒介性がんAgの取り込みと提示(0日目;タイミング:ベンチ時間1時間、インキュベーション時間24時間)
    1. 4〜6時間後、前述のように免疫担当マウスの骨髄(BM)細胞からin vitroで分化したDCを回収し8、それらを完全増殖培地でRTで1100×gで5分間2回洗浄する。
      注:DCは、以前に報告されたように、Histodenzベースの勾配での遠心分離により、マウス脾細胞から分離することもできます19。良い方法として、凍結保存されたDCを使用する場合は、完全な増殖培地を予熱し、1:1000ベンゾナーゼを補充して細胞の凝集を防ぎ、融解時の良好な回復を確保するようにしてください。
    2. 上記のようにBM由来の「空」DC(DCN)をカウントし(ステップ1.1.4を参照)、次いでUV照射アポトーシス細胞との共培養を2:1の比率(5 ×10 105アポトーシスMCA205細胞の2.5 × 105 DCs、以前に最適化した8)で12ウェルプレートに1mLの新鮮な完全増殖培地で24時間、37°で24時間、UV照射アポトーシス細胞と共培養する。C、5%CO2。実験的コントロールとして、食作用が妨げられる状態である4°Cで細胞をインキュベートします。
      注:共培養の表面と体積を増やすと、アポトーシスがん細胞とDCの相互作用が妨げられ、最適で効果的な食作用が妨げられる可能性があるため、増やさないでください。また、他のがん細胞モデルを用いる場合、がん細胞:DC比を最適化するための検討を行う必要があります。
  2. mFCによるがんAg取り込み評価(1日目、期間:2時間)
    1. インキュベーション後、細胞を15 mLチューブに集め、10 mLの完全増殖培地でRT1100 x g で5分間2回洗浄します。
      注:DCメンブレンに付着し、まだ完全には飲み込まれていないアポトーシス細胞のバックグラウンドノイズを低減するために、細胞ペレットを0.1 M EDTAでRTで5分間インキュベートします。次に、細胞懸濁液(約2 x 106 個の細胞を含む)を、ステップ2.2.1と同様に、10 mLの増殖培地で2回遠心分離します。
    2. 細胞表面染色では、0.5 μgのIgGアイソタイプコントロールまたは抗マウスフィコエリトリン(PE)標識CD11cのいずれかを含む20 μLの冷蛍光活性化セルソーティング(FACS)バッファー(1% FBS、0.1 M EDTA、PBS中0.1 M EDTA)にBM由来DCを再懸濁し、96ウェルU字型底部組織培養処理マイクロプレートに封入し、暗所4°Cで20分間インキュベートすることで蛍光色素シグナルを保持し、光退色を防ぎます。
      注:がん抗原の取り込みが起こると、共刺激分子(すなわち、CD80またはCD86とMHC-II、および免疫チェックポイントリガンドCD274抗原[PDL1として最もよく知られている])の発現レベルをチェックすることにより、「完全な」DC(DCPHAGO)の活性化も確認できます。原則として、フローサイトメーターの性能を最適にするためには、抗体濃度を慎重に滴定し、細胞数を1 x 105から1 x 108細胞/テストの範囲にする必要があります。
    3. その後、細胞をFACSバッファーで2回洗浄し、活力固定可能な近赤外線(IR)色素を含むPBS溶液100μLを最終濃度1μMでRTで30分間加えます。
      注:別の方法として、使用済みの蛍光発光と重複しない他の活力固定性色素(バイオレット、ブルー、オレンジ、ライム、アクアなど)を使用することができます。
    4. 細胞をPBSで一度洗浄し、mFCによるCD11cおよびPKH67レベルのフローサイトメトリー分析の前に、FACSバッファーに再懸濁します。mFCの集録中、そしてデータ解析では、以下のゲーティング戦略を進めます。
      1. 前方散乱面積(FSC-A、x軸)と側方散乱面積(SSC-A、y軸)の特性(ゲート1)に基づいて、目的の細胞を特定します。FSC-A(x軸)と前方散乱高さ(FSC-H、y軸、ゲート2)をプロットすることにより、セルのダブレットと凝集塊を分析から除外します。
      2. 780/60 nmの発光バンドパス(bp)フィルター領域(x軸)とSSC-A(y軸、ゲート3)をプロットして、死細胞を除去します。最後に、ゲート3に基づいて、575/26 nmおよび530/30 nmの発光bpフィルターをそれぞれ使用して、2パラメータ密度プロットでCD11cマーカーおよびPKH67蛍光細胞リンカーの細胞陽性を検出します。
    5. データ分析を実行します。
      注:十分に分離された発光波長で簡単かつ効率的に標識できるように、必ず抗体を組み合わせてください。これにより、使用する蛍光色素のコンペンセーション設定が簡素化され、目的のパラメーターを簡単、迅速、かつ信頼性の高い定量化が可能になります。
  3. CD8 T細胞のプライミングと活性化(1日目;期間:ベンチ時間1時間、インキュベーション時間72-96時間)
    1. 前述のように、マウス脾臓CD8 T細胞(CD8N)を精製します8。
    2. 単離したCD8 T細胞を500 μLの新鮮完全増殖培地でカウントして再懸濁し、以前にアポトーシスMCA205細胞を取り上げていたBM由来DCと2.5:1の比率(1 × 105 T細胞に対して2.5 × 105 DC、以前に最適化した8)で、最終容量1.5 mL、37°C、12ウェルプレートで72時間培養します。 5%のCO2。
      注:実験結果を強調するために、さまざまな細胞培養比率がテストされ、最良のものが選択されました。
  4. EdU mFC アッセイによる CD8 T 細胞増殖解析 (4 日目;所要時間:ベンチ時間15分、インキュベーション16-20時間)
    1. チミジンEdUのヌクレオシド類似体を最終濃度10 μMで共培養培地に添加し、よく混合します。
      注:培養条件、細胞タイプのばらつき、および細胞密度がDNAへのEdUの取り込みに影響を与える可能性があるため、パイロット実験でさまざまなEdU濃度とインキュベーション時間をテストします。インキュベーションが長い場合または短い場合は、それぞれ低濃度または高濃度が必要になる場合があります。EdUで処理されていない同じ集団の細胞をネガティブ染色コントロールとして含めます。
    2. 16-20時間後、CD8C-P を回収し、室温で1100 x g で5分間2回遠心分離します。
    3. 0.5 μgの抗マウスフルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合CD8aおよび0.25 μgの抗マウスPE結合CD3を添加した20 μLの冷FACSバッファー、または96ウェルU字型ボトムTC処理マイクロプレートでそれぞれのIgGアイソタイプコントロールで細胞を染色し、暗所で4°Cで20分間インキュベートします。
      注:干渉を避けるため、Click反応を行う前にQdot®抗体コンジュゲートを使用しないことをお勧めします。
    4. 細胞をFACSバッファーで2回洗浄し(ステップ2.2.3と同様)、細胞ペレットをバイタリティ固定型Aqua色素を含むPBS溶液100μLに最終濃度1μMでRTで30分間再懸濁します。
      1. 細胞懸濁液をフローチューブに移し、PBS中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)3 mLで1回洗浄し、100 μLの固定剤(すなわち、PBS中の4%パラホルムアルデヒド)で15分間、光から保護した室温で細胞固定を行います。
      2. 直後に、PBS中の1% BSAを3 mLで細胞を1回洗浄し、1xサポニンベースの透過化および洗浄試薬を含む溶液100 μLでRTで15分間インキュベートした後、直接標識反応に進みます。
        注:1xサポニンベースの透過処理および洗浄試薬は、PBS中の1%BSAで10倍溶液1:10を希釈することにより調製します。この試薬は、赤血球を溶解しながら白血球の形態学的光散乱特性を保持するため、全血または赤血球を含む細胞懸濁液にも使用できます。
      3. 分析するサンプルの数に応じて、指示された量のPBS、銅保護剤触媒、Alexa Fluor (AF) 647-結合ピコリルアジド、および1x EdUバッファー添加剤を穏やかかつ連続的に混合して、反応カクテルを調製します。
        1. リアクションカクテルは準備後15分以内に使用してください。.反応混合物500μLを各チューブに加え、よく混合し、暗所でRTで30分間インキュベートします。
      4. 細胞を3 mLの1倍サポニンベースの透過処理試薬および洗浄試薬で一度洗浄し、同じ溶液100 μLに再懸濁してから、mFCを使用して細胞集団中のS期増殖CD8C-P の割合を決定するための標準的なmFC法に進みます。mFCの集録中、そしてデータ解析では、以下のゲーティング戦略を進めます。
        1. FSC-A(x軸)およびSSC-A(y軸)の特性(ゲート1)に基づいて目的の細胞を同定します。FSC-A(x軸)とFSC-H(y軸、ゲート2)をプロットすることにより、セルのダブレットと凝集塊を分析から除外します。525/50 nmの発光bpフィルター領域(x軸)とSSC-A(y軸、ゲート3)をプロットして、死細胞を除去します。
        2. 530/30 nm および 575/26 nm の bp 蛍光 bp フィルターをそれぞれ使用して、2 パラメーター密度プロットで CD8a および CD3 の細胞陽性を検出します (ゲート 4)。最後に、ゲート4に基づいて、660/620 nm bp 発光フィルターを使用して、AF647-EdU 取り込みの細胞を 1 つのパラメーター ヒストグラムで平均蛍光強度としてさらに解析します。
          注:EdU標識によって生成された蛍光シグナルは、取得時に低流量で検出するのが最適です。
      5. データ分析を実行します。

3. がん細胞によるCD8C-P の再刺激

  1. CD8C-P は生きたがん細胞を認識します(4日目;期間:1時間のベンチ時間、48-72時間のインキュベーション)
    1. 共培養物からCD8C-P を回収し(ステップ2.3.2を参照)、10 mLの完全増殖培地中でRTで1100 x g で10分間遠心分離します。
      注:このステップでは、活性化マーカーCD95の発現レベルをチェックして、CD8 T細胞の分化を確認します。
    2. 約2.5 × 106細胞を含む細胞ペレットを、1 x 107細胞あたり100 μLの死細胞除去マイクロビーズに再懸濁します。
      注:細胞数が多い場合は、それに応じて試薬と総量をスケールアップしてください。
    3. よく混合し、室温で15分間インキュベートします。
      注:必要に応じて、製造元の指示に従って1x結合バッファーを添加することにより、サンプル量を調整し、磁気分離に必要な最小500μLを達成します。
    4. 直後に、その後の磁気セル分離に進みます。分離カラムを適切なセパレーターの磁場に置き、適切な量の1x結合バッファーですすいでください。細胞懸濁液を分離カラムに移し、非標識生細胞画分を含むフロースルーを回収します。
    5. カラムを適切な量の1x結合バッファーで再度洗浄します。通過するラベルのないセルを収集し、ステップ3.1.4の廃液と結合します。
      注:死細胞の磁気除去の効率を高めるために、新しいカラムを使用することにより、ステップ3.1.1〜3.1.5で説明したように、生細胞画分を第2の分離手順で濃縮することができます。
    6. 濃縮した生CD8C-PをRTで1100 x gで5分間遠心分離し、細胞カウントの前に完全増殖培地で、新鮮なMCA205細胞と2:1の比率で培養します(5 x 104 MCA205細胞に対して1 x 105 CD8 T細胞、以前に最適化された8)12ウェルプレートで最終容量1 mLで培養します。細胞播種後、共培養プレートを加湿細胞培養インキュベーターまたは生細胞解析システムに72時間、37°C、5%CO2で置き、その後、ダウンストリームアッセイに進みます。
  2. ToCマイクロ流体モデルにおけるがん細胞へのCD8 T細胞輸送(5日目;期間:ベンチ時間2時間、インキュベーション72時間)
    1. アドホックに作製したToCマイクロ流体デバイス13,20をUVキャビネット内で20分間滅菌し、PBSで2回洗浄した後、完全な増殖培地と少なくとも1時間インキュベートします。
      注:MCA205細胞およびCD8C-P は、このプロトコルでは染色されません。ただし、どちらも蛍光生液適合性セルトラッカーで標識できます。
    2. 1×105 MCA205細胞を15μLの全増殖培地に穏やかに再懸濁し、均一な細胞分布が得られるように注意しながら、前述したように左側のチップチャンバー(腫瘍チャンバー)にゆっくりと注入する。がん細胞をチップの地下室に付着させるまで5〜10分待ちます。
      1. 顕微鏡下でマイクロ流体チップ内のがん細胞の正確で均一な分布を確認します。実験結果は、気泡の存在によって影響を受ける可能性があります。
    3. 1 x 106 CD8C-P を50 μLの完全増殖培地に再懸濁します。免疫細胞懸濁液を右側のチップチャンバー(免疫チャンバー)に静かにピペットで移します。
      注:このステップでは、顕微鏡を使用して、免疫細胞が中間チャンバーに分布し、実験の開始点を表す「フロント」が作成されていることを確認します。
    4. 圧力とマイクロ流体の変動を避けるために、前に示したように すべてのチップリザーバーを最大150μLの完全な増殖培地で慎重に満たし、組み立てたチップを37°C、5%CO2 の加湿細胞培養インキュベーターの水平面に少なくとも1時間置き、タイムラプス記録の前にシステムを安定させます。
      注:各チップチャンバーの2つのリザーバー内の体積の潜在的な蒸発損失を注意深く確認し、2〜3日ごとに新しい媒体を追加してそれらを補正します。必要に応じて、各細胞コンパートメントから最大100 μLの上清を吸引して、サイトカインプロファイリングを行うことができます。
    5. インキュベーションシステムを搭載したビデオ顕微鏡を用いて、MCA205を含む左右のデバイス領域と免疫細胞の間にあるマイクロチャネルアレイの明視野画像シリーズを記録し、免疫細胞の浸潤や免疫細胞とがん細胞の相互作用のダイナミクスを可視化します。
      注:ここで使用した実験環境では、細胞のタイムラプス記録をインキュベーターに72時間収集し、2分ごとに1枚の顕微鏡写真を取得した顕微鏡で観察しました。イメージング条件を最適化して、過度の写真露光を回避し、取得フレームレートを高くして、下流の免疫細胞追跡分析を簡単に実行できます。タイムラプスの最後に、半自動追跡分析13、20を行う。
  3. CD8E 活性化と腫瘍反応性フローサイトメトリー評価 (7 日目と 8 日目;所要時間:2時間)
    1. インキュベーションの48時間および72時間後(ステップ3.1.6を参照)、CD8E を回収し、室温で1100 x g で5分間2回遠心分離します。
      注:CD8E (すなわち、IFN-γおよびGrz-B)によって産生される細胞傷害性分子の細胞内レベルを評価するために、がん免疫細胞共培養物は、以前に1:1000ブレフェルジンAおよび1:1500モネンシンと少なくとも6時間インキュベートされています。
    2. 細胞表面の染色には、 補足表1に示すように、冷FACSバッファーで調製した3種類の一次抗体ミックスの20 μLに細胞を再懸濁します。
      注:抗体結合の特異性を確保するために、ステップ2.2.2のように、適切なIgGアイソタイプコントロールの存在下でmFC実験を実施します。
    3. 96ウェルU字型の底部組織培養処理マイクロプレートで、光から保護された状態で4°Cで20分間細胞をインキュベートします。混合物AおよびBからの細胞ペレット(補足表1)については、ステップ3.3.5に直接進んでください。
    4. クイック洗浄後、ミックスCの細胞ペレットに100 μLの固定/透過化溶液を加えます(補足表1)。暗所で4°Cで20分間インキュベートした後、細胞を200 μLの冷透過/洗浄バッファーで2回洗浄し、0.25 μgの抗マウスFITC標識IFN-γおよび0.125 μgの抗マウスPE標識Grz-Bを含む20 μLの冷冷透過/洗浄バッファー、またはそれぞれのIgGアイソタイプで再懸濁します。細胞を4°Cで30分間インキュベートし、光から保護します。
    5. その後、細胞をFACS緩衝液中で2回洗浄し、活力固定型Aqua色素を含むPBS溶液100μLを最終濃度1μMでRTで30分間細胞ペレットに添加します(ステップ2.2.4と同様)。
    6. 細胞をPBSで一度洗浄し、FACSバッファーに再懸濁してから、mFCによるがん細胞に対するCD8 T細胞活性化のフローサイトメトリー解析を行います。mFCの集録中、そしてデータ解析では、以下のゲーティング戦略を進めます。
      1. FSC-A(x軸)およびSSC-A(y軸)の特性(ゲート1)に基づいて目的の細胞を同定します。FSC-A(x軸)とFSC-H(y軸、ゲート2)をプロットすることにより、セルのダブレットと凝集塊を分析から除外します。525/50 nmの発光bpフィルター領域(x軸)とSSC-A(y軸、ゲート3)をプロットして、死細胞を除去します。
      2. 660/20 nm と 780/60 nm または 530/30 nm と 575/26 nm の蛍光 bp フィルター (ゲート 4) を使用して、2 パラメーター密度プロットで CD8a と CD3 の細胞陽性を検出します。最後に、ゲート4に基づいて、CD44(530/30 nm発光bpフィルター)、CD25(575/26 nm発光bpフィルター)、およびCD69(450/50 nm発光bpフィルター)マーカーの2パラメーター密度プロットで細胞をさらに解析し、CD137マーカー(660/20 nm発光bpフィルター)、およびIFN-γ(530/30 nm発光bpフィルター)およびGrz-B(575/26 nm発光bpフィルター)のミックスA、 B、C(補足表1)である。
        注:CD8E 細胞腫瘍反応性は、 アドホック 脱顆粒アッセイを通じてCD107aリソソーム関連タンパク質の表面発現を評価することにより、さらに試験することができる。
    7. データ分析を実行します。
  4. 生細胞解析システムとmFCによるCD8E 細胞性腫瘍死滅研究(8日目;期間:ベンチ時間1時間、インキュベーション72時間)
    1. 生細胞解析システムによる腫瘍死殺アッセイでは、共培養培地(ステップ3.1.6を参照)に、最終濃度250 nMのリアルタイム細胞死定量色素を添加します。
    2. 共培養プレートを生細胞解析システムに置いた後、プレートを37°Cに30分間温めてからスキャンします。2時間ごとに最大72時間までデータスキャンを実行して、タイムラプス記録を収集し、適切なソフトウェアで分析します。
    3. mFCを用いた腫瘍死滅アッセイでは、72時間後(ステップ3.1.6を参照)、細胞を回収し、室温で1100 x g で5分間2回遠心分離します。
    4. 96ウェルU字型ボトムTC処理マイクロプレートに0.125 μgのIgGアイソタイプコントロールまたは抗マウスパシフィックブルー(PB)標識CD45のいずれかを含む20 μLの冷FACSバッファーで表面マーカーの細胞を染色し、暗所で4°Cで20分間インキュベートします。直後に、FACSバッファーで細胞を2回洗浄し、フローサイトメトリー解析の前に、バイタリティ色素であるヨウ化プロピジウム(PI)を最終濃度1μMで添加します。mFCの集録中、そしてデータ解析では、以下のゲーティング戦略を進めます。
      1. FSC-A(x軸)およびSSC-A(y軸)の特性(ゲート1)に基づいて目的の細胞を同定します。FSC-A(x軸)とFSC-H(y軸、ゲート2)をプロットすることにより、セルのダブレットと凝集塊を分析から除外します。
      2. 450/50 nm 発光 bp フィルター (ゲート 3) を使用して、がん細胞の CD45 陰性を検出します。最後に、610/620 nm bp 発光フィルターを使用して、PI インクルージョンを 1 つのパラメーターヒストグラムで平均蛍光強度として解析します。
        注:がん細胞死は、アネキシンV-PIアポトーシスアッセイを実施するか、切断されたカスパーゼ-3および-7の発現レベルを評価することによっても分析できます。
    5. データ分析を実行します。
      注:統計解析は、Prism GraphPad Software v.8.4.0を使用して行いました。

結果

CD11c+ DCsは、交差提示21,22に特化し、図2Aに示すようにゲート化された広く知られている食細胞サブセットであり、以前にPKH67蛍光細胞リンカーで標識されたUV照射MCA205癌細胞からのアポトーシス体を飲み込む能力をmFCによって評価した。予想通り、CD11c+ DCは、37°Cではin vitroでアポトーシスMCA205細胞を効率...

ディスカッション

抗がん免疫応答のモニタリングは、TMEで作用し、覇権をめぐる絶え間ない戦いを支える複雑な分子的および細胞的相互作用を解明し理解するために最も重要である23。ここでは、がん免疫サイクルを構成するステップのモニタリングと特性評価のための簡単なmFCおよびToC支援プロトコルについて詳しく説明します。マウス細胞株とマウス由来免疫細胞をベースにしたこのプ?...

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

A.S. は AIRC (IG #28807) と PRIN (#P2022YE2MX) によってサポートされています。M.M.はAIRC-FIRCフェローシップ(#25558)の支援を受けています。A.D.N.は、イノベーションエコシステムローマテクノポールECS00000024、EU - 次世代EU、PNRRミッション4、コンポーネント2、投資1.5の資金提供を受けています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubes Eppendorf30120086
100 kV e-beam litographyVistec
100 mm Petri dishes Greiner Bio One664160
12-well platesEuroclone ET3012
15 and 50 mL tubesCorning 352096; 352070
40 μm cell strainer Corning CLS431750
5 mL polystyrene tubes Greiner Bio-One120180
70 μm cell strainer Corning CLS431751
75 cm2 cell culture treated flaskEuroclone ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) AntibodyMiltenyi Biotec130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody Miltenyi Biotec130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) AntibodyBioLegend100206
AptesSigma Aldrich440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlugBD Biosciences555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)BD Biosciences555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)BD Biosciences554724
Bovine serum albumin (BSA)US Biological, SalemA1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)eBioscience12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)eBioscience17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)eBioscience25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)eBioscience11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)InvitrogenMCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)eBioscience48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)eBioscience53-0951-82
Cell counting slidesKova International87144E
Chromium quartz masksMB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay KitInvitrogenC10635
CytoFLEX Flow CytometerBeckman Coulter
Dead Cell Removal KitMiltenyi Biotec130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)EuroCloneECB4053L
EDTAInvitrogenAM9260G
Fetal bovine serum (FBS)EuroCloneECS0180L
Flowjo v10.0.7Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)eBioscience12-8898-82
H2O2Sigma Aldrich
H2SO4Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)Thermo Scientific
Ice machineBrema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)eBioscience11-7311-82
Illustrator CC 2015Adobe Systems Inc.
ImageJNational Institute of Health
Incucyte 2022A SoftwareSartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead CellsSartorius4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging MicroscopeBulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)Angelantoni
L-glutamine 200 mMEuroCloneECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitInvitrogenL10119
MACS columnsMiltenyi Biotec130-042-201; 130-042-401 
MACS separatorsMiltenyi Biotec130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell lineSigma-AldrichSCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R MicrocentrifugeThermo Scientific75002552
Microsoft Excel Microsoft, Redmond 
Mouse: C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouseMiltenyi Biotec130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BITNikon Instruments Inc.
Optical litographyEVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfateEuroCloneECB3001D/1
Pipet aidDrummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201
PipettesEppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker KitsSigma-AldrichPKH67GL-1KTfluorescent cell linker  kit
plastic coverslipIBIDI10812
Propidium IodideThermo ScientificP1304MP
Reactive Ion Etching systemOxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)EuroCloneECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)Corning- Millipore-Sigma; St. Louis,
MO		CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge SeriesThermo Scientific75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)EuroClone Spa, Milan, ItalyECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 seriesMicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punchesKai Medical, Tedpella
Sylgard 184Dowsil, Dow Corning101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)eBioscience12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS Sigma Aldrich92360
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol RedEuroCloneECM0920
Vacuum dessicator

参考文献

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype. Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).
  3. Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure. Cells. 10 (9), 2361 (2021).
  4. Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. The three Es of cancer immunoediting. Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).
  5. Musella, M., et al. Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B. Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).
  6. Anderson, K. G., et al. Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies. J Immunother Cancer. 11 (6), e006533 (2023).
  7. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  8. Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry. Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).
  9. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Front Mol Biosci. 7, 612801 (2020).
  10. Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy. Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).
  11. Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge. Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).
  12. Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. 3D cancer models: One step closer to in vitro human studies. Front Immunol. 14, 1175503 (2023).
  13. De Ninno, A., et al. Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments. JoVE. (170), e61895 (2021).
  14. Mattei, F., et al. Oncoimmunology meets organs-on-chip. Front Mol Biosci. 8, 627454 (2021).
  15. Businaro, L., et al. Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment. Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).
  16. Vacchelli, E., et al. Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1. Science. 350 (6263), 972-978 (2015).
  17. Maulana, T. I., et al. Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy. Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).
  18. Lorenzi, S., et al. Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming. J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).
  19. Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies. Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).
  20. Lucarini, V., et al. Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma. J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).
  21. Gutiérrez-Martínez, E., et al. Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets. Front Immunol. 6, 363 (2015).
  22. Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  23. Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition. Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).
  24. Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI. Front Oncol. 13, 1172314 (2023).
  25. Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
  26. Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research. Clin Transl Med. 12 (1), 696 (2022).
  27. Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics. Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).
  28. Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. Current trends in flow cytometry automated data analysis software. Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).
  29. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

In VitroTumor on a chip

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved