תרבות משותפת במערכות מבחנה כדי לשחזר את מחזור החיסון לסרטן

Summary

כאן, אנו מפרטים פרוטוקול פשוט, מהיר ואמין של זרימה רב-פרמטרית בסיוע ציטומטריה וגידול על שבב כדי לנטר ולאפיין את השלבים המרכיבים את מחזור החיסון לסרטן. ואכן, הבנה מעמיקה של יחסי הגומלין בין סרטן לתאי מערכת החיסון מספקת תובנות קריטיות כדי להערים על גידולים ולהנחות את הטיפול הקליני.

Abstract

מחקר סרטן בסיסי ופיתוח טיפולים יעילים להתקפת נגד מסתמכים שניהם על מחקרים ניסיוניים המפרטים את יחסי הגומלין בין תאים סרטניים וחיסוניים, מה שמכונה מחזור חסינות לסרטן. מערכות תרבית משותפת במבחנה בשילוב עם ציטומטריית זרימה מולטי-פרמטרית (mFC) והתקנים מיקרופלואידים של גידול על שבב (ToCs) מאפשרים ניטור ואפיון פשוטים, מהירים ואמינים של כל שלב במחזור החסינות לסרטן ומובילים לזיהוי המנגנונים האחראים להטיית האיזון בין מעקב חיסוני לסרטן לבין התחמקות חיסונית. הבנה מעמיקה של יחסי הגומלין הדינמיים בין תאי סרטן ומערכת החיסון מספקת תובנות קריטיות כדי להערים על גידולים ותאיץ את קצב הפרסונליזציה והאופטימיזציה הטיפולית בחולים. באופן ספציפי, כאן אנו מפרטים פרוטוקול פשוט בסיוע mFC ו- ToC לפענוח המורכבויות הדינמיות של כל שלב במחזור החסינות לסרטן בשורות תאי סרטן מורין ובתאי חיסון שמקורם בעכבר ומתמקדים במעקב חיסוני. בהתחשב בתכונות הקשורות לזמן ועלות של פרוטוקול זה, זה בהחלט אפשרי בקנה מידה גדול. יתר על כן, עם שינויים קלים, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם הן לשורות תאים סרטניים אנושיים והן לתאי חיסון אנושיים שמקורם בדם היקפי ובשילוב עם עיכוב גנטי ו / או פרמקולוגי של מסלולים ספציפיים על מנת לזהות סמנים ביולוגיים של תגובה חיסונית.

Introduction

במהלך העשורים האחרונים, אימונותרפיה נמצאת בחוד החנית של אפשרויות חדשניות לטיפול בסרטן. רתימת מערכת החיסון למטרות אנטי-סרטניות סיפקה הוכחת היתכנות רבת עוצמה לטובת המטופל במגוון ממאירויות המטולוגיות ומוצקות עם פרוגנוזות גרועות מבחינה היסטורית. מכיוון שאימונותרפיה מציעה הזדמנות לסוגי סרטן שאחרת קשה לטפל בהם, היא חווה קצב התקדמות מהיר להדהים. ניתן לייחס התקדמות כזו, לפחות בחלקה, להבנה המעודנת של יחסי הגומלין בין תאים סרטניים לתאי מערכת החיסון. יחסי גומלין אלה דומים ל"מנוע" הזנה קדימה שמערכת החיסון מציתה כדי להרוס תאים סרטניים, מה שמכונה מחזור חסינות לסרטן. תגובה חיסונית אנטי-סרטנית זו מתקדמת בשלוש רמות עיקריות: זיהוי, עיבוד ותגובה. ראשית, בשלב ההכרה, אנטיגנים סרטניים (Ags....

Protocol

כל שלבי הפרוטוקול המחייבים שימוש בבעלי חיים תואמים את הנחיית האיחוד האירופי 63/2010 וכלולים בפרוטוקול ניסוי שאושר על ידי הוועדה המוסדית לניסויים בבעלי חיים ומשרד הבריאות האיטלקי (אישור מספר 858/2015/PR).

1. הכנת תאים סרטניים

1. שגרת תרבית תאים סרטניים (יום -7; משך: שעתיים)
   1. לגדל תאי פיברוסרקומה MCA205 מורין במכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 מדיום גידול בתוספת 10% (v/v) נסיוב בקר עוברי (FBS), 2 mM L-גלוטמין, 100 IU/mL פניצילין G מלח נתרן, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין סולפט, ו 50 מיקרוגרם / מ"ל היגרומיצין (מדיום גידול מלא), באינקובטור תרבית תאים לח בתנאי תרבית סטנדרטיים (37 ° C, 5% CO₂).
      הערה....

תוצאות

היכולת של CD11c⁺ DCs, תת-הקבוצה הידועה של פגוציטים המתמחה בהצגה צולבת^21,22 ומגודרת כפי שמוצג באיור 2A, לבלוע גופים אפופטוטיים מתאי סרטן MCA205 מוקרנים UV שסומנו בעבר במקשר תאים פלואורסצנטיים PKH67 הוערכה על-ידי mFC. כצפוי, CD11c⁺ DCs לכדו ביעילות תאי.......

Discussion

ניטור התגובה החיסונית האנטי-סרטנית הוא בעל חשיבות עליונה כדי להבהיר ולהבין את יחסי הגומלין המולקולריים והתאיים המורכבים הפועלים ב-TME ותומכים במאבק מתמיד על עליונות²³. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול פשוט בסיוע mFC ו- ToC לניטור ואפיון השלבים המרכיבים את מחזור החיסון לסרטן. עם שינויים קל.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtubes	Eppendorf	30120086
100 kV e-beam litography	Vistec
100 mm Petri dishes	Greiner Bio One	664160
12-well plates	Euroclone	ET3012
15 and 50 mL tubes	Corning	352096; 352070
40 μm cell strainer	Corning	CLS431750
5 mL polystyrene tubes	Greiner Bio-One	120180
70 μm cell strainer	Corning	CLS431751
75 cm2 cell culture treated flask	Euroclone	ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody	Miltenyi Biotec	130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) Antibody	BioLegend	100206
Aptes	Sigma Aldrich	440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug	BD Biosciences	555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)	BD Biosciences	555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD Biosciences	554724
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological, Salem	A1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)	eBioscience	12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)	eBioscience	17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)	eBioscience	25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)	eBioscience	11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)	Invitrogen	MCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)	eBioscience	48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)	eBioscience	11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)	eBioscience	17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)	eBioscience	53-0951-82
Cell counting slides	Kova International	87144E
Chromium quartz masks	MB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10635
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman Coulter
Dead Cell Removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)	EuroClone	ECB4053L
EDTA	Invitrogen	AM9260G
Fetal bovine serum (FBS)	EuroClone	ECS0180L
Flowjo v10.0.7	Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)	eBioscience	12-8898-82
H2O2	Sigma Aldrich
H2SO4	Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)	Thermo Scientific
Ice machine	Brema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)	eBioscience	11-7311-82
Illustrator CC 2015	Adobe Systems Inc.
ImageJ	National Institute of Health
Incucyte 2022A Software	Sartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells	Sartorius	4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System	Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope	Bulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Angelantoni
L-glutamine 200 mM	EuroClone	ECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L10119
MACS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201; 130-042-401
MACS separators	Miltenyi Biotec	130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell line	Sigma-Aldrich	SCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002552
Microsoft Excel	Microsoft, Redmond
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2	Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT	Nikon Instruments Inc.
Optical litography	EVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfate	EuroClone	ECB3001D/1
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201
Pipettes	Eppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits	Sigma-Aldrich	PKH67GL-1KT	fluorescent cell linker  kit
plastic coverslip	IBIDI	10812
Propidium Iodide	Thermo Scientific	P1304MP
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	EuroClone	ECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge Series	Thermo Scientific	75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 series	MicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punches	Kai Medical, Tedpella
Sylgard 184	Dowsil, Dow Corning	101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)	eBioscience	12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS	Sigma Aldrich	92360
Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Scientific	15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol Red	EuroClone	ECM0920
Vacuum dessicator