Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מפרטים פרוטוקול פשוט, מהיר ואמין של זרימה רב-פרמטרית בסיוע ציטומטריה וגידול על שבב כדי לנטר ולאפיין את השלבים המרכיבים את מחזור החיסון לסרטן. ואכן, הבנה מעמיקה של יחסי הגומלין בין סרטן לתאי מערכת החיסון מספקת תובנות קריטיות כדי להערים על גידולים ולהנחות את הטיפול הקליני.

Abstract

מחקר סרטן בסיסי ופיתוח טיפולים יעילים להתקפת נגד מסתמכים שניהם על מחקרים ניסיוניים המפרטים את יחסי הגומלין בין תאים סרטניים וחיסוניים, מה שמכונה מחזור חסינות לסרטן. מערכות תרבית משותפת במבחנה בשילוב עם ציטומטריית זרימה מולטי-פרמטרית (mFC) והתקנים מיקרופלואידים של גידול על שבב (ToCs) מאפשרים ניטור ואפיון פשוטים, מהירים ואמינים של כל שלב במחזור החסינות לסרטן ומובילים לזיהוי המנגנונים האחראים להטיית האיזון בין מעקב חיסוני לסרטן לבין התחמקות חיסונית. הבנה מעמיקה של יחסי הגומלין הדינמיים בין תאי סרטן ומערכת החיסון מספקת תובנות קריטיות כדי להערים על גידולים ותאיץ את קצב הפרסונליזציה והאופטימיזציה הטיפולית בחולים. באופן ספציפי, כאן אנו מפרטים פרוטוקול פשוט בסיוע mFC ו- ToC לפענוח המורכבויות הדינמיות של כל שלב במחזור החסינות לסרטן בשורות תאי סרטן מורין ובתאי חיסון שמקורם בעכבר ומתמקדים במעקב חיסוני. בהתחשב בתכונות הקשורות לזמן ועלות של פרוטוקול זה, זה בהחלט אפשרי בקנה מידה גדול. יתר על כן, עם שינויים קלים, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם הן לשורות תאים סרטניים אנושיים והן לתאי חיסון אנושיים שמקורם בדם היקפי ובשילוב עם עיכוב גנטי ו / או פרמקולוגי של מסלולים ספציפיים על מנת לזהות סמנים ביולוגיים של תגובה חיסונית.

Introduction

במהלך העשורים האחרונים, אימונותרפיה נמצאת בחוד החנית של אפשרויות חדשניות לטיפול בסרטן. רתימת מערכת החיסון למטרות אנטי-סרטניות סיפקה הוכחת היתכנות רבת עוצמה לטובת המטופל במגוון ממאירויות המטולוגיות ומוצקות עם פרוגנוזות גרועות מבחינה היסטורית. מכיוון שאימונותרפיה מציעה הזדמנות לסוגי סרטן שאחרת קשה לטפל בהם, היא חווה קצב התקדמות מהיר להדהים. ניתן לייחס התקדמות כזו, לפחות בחלקה, להבנה המעודנת של יחסי הגומלין בין תאים סרטניים לתאי מערכת החיסון. יחסי גומלין אלה דומים ל"מנוע" הזנה קדימה שמערכת החיסון מציתה כדי להרוס תאים סרטניים, מה שמכונה מחזור חסינות לסרטן. תגובה חיסונית אנטי-סרטנית זו מתקדמת בשלוש רמות עיקריות: זיהוי, עיבוד ותגובה. ראשית, בשלב ההכרה, אנטיגנים סרטניים (Ags) המיוצרים במהלך היווצרות הגידול משתחררים על ידי תאים סרטניים גוססים במיקרו-סביבה של הגידול (TME, שלב 1) ונבלעים על ידי תאים דנדריטיים חודרי גידול (DCs, שלב 2). לאחר מכן, בשלב העיבוד, DCs מציגים את האפיטופים של הגידול שנלכד Ags דרך מולקולות קומפלקס ההיסטותאימות הגדולות (MHC), מבטאים על פני השטח שלהם רמות גבוהות יותר של מולקולות קוסטימולטוריות (שלב 3), ועוברים לבלוטות לימפה מנקזות גידולים (dLNs) כדי להציג את המטען שלהם לתאי CD8 T נאיביים (CD8N, שלב 4). כל השלבים הללו מתכנסים בתהליך הסופי של התגובה שבמהלכו תאי CD8 T צולבים ספציפיים לגידול Ag (CD8C-P) מופעלים, מבשילים לתאי CD8 T (CD8E) ועוברים הרחבה שבטית (שלב 5). לאחר מכן תאיCD8 E עוזבים את ה- dLN וחוזרים הביתה דרך הדם ל- TME (שלב 6) שם הם מזהים ונקשרים באופן ספציפי לתאים סרטניים באמצעות האינטראקציה בין קולטן תאי T שלהם (TCR) לבין הגידול הקוגניטיבי שלהם Ags, משחררים מולקולות ציטוטוקסיות [כלומר, אינטרפרון (IFN)-γ, פרפורינים ואנזימים (Grzs)] והורגים תאים סרטניים (שלב 7)1, 2. הרג תאים סרטניים מוביל לשחרור של גידול נוסף Ags כדי לתדלק את מחזור החיסון לסרטן. למעשה, באמצעות כל השלבים האלה, מערכת החיסון הורסת ודוחה תאים סרטניים לעתים קרובות הרבה יותר ממה ששיערו. עם זאת, בחולי סרטן, לפחות אחד מהשלבים הללו אינו פועל כראוי. אנו ואחרים הראו כי תאים סרטניים מבקשים לעכב את התגובה החיסונית על ידי התפתחות לגרסאות אגרסיביות יותר וחסויות חיסון 3,4,5 או פגיעה ביעילות תאי T 6,7.

חקר הסרטן ופיתוח תרופות לסרטן מסתמכים שניהם על מודלים ניסיוניים המאפשרים לחקור את הקשר בין סרטן לתאים חיסוניים, מה שמכונה אונקו-אימונולוגיה. להלן מתוארים מודלים מהירים, אמינים, ניתנים לשחזור ובעלות נמוכה במבחנה המשחזרים באופן מקיף כל שלב במחזור האונקו-אימונולוגיה ומוצעים תצוגה מהירה וברורה של מערכי התכונות הפנוטיפיים והפונקציונליים של מעקב חיסוני ובסופו של דבר עריכה חיסונית.

ציטומטריית זרימה מולטי-פרמטרית (mFC) היא אחד הכלים האנליטיים החד-תאיים המוצלחים ביותר במחקר בסיסי של סרטן, אבחון ומחקר תרגומי בניסויים קליניים בסרטן. מכיוון שהיא מאפשרת ללכוד בו זמנית תכונות נוספות בכל תא, mFC הרוויחה את מקומה כפלטפורמת ניתוח סטנדרטית זהב באונקו-אימונולוגיה. הוא משלב רגישות גבוהה וספציפיות עם האפשרות למדוד דפוסי ביטוי חלבונים מרובים ותכונות תפקודיות במהירות ובאופן שניתן לשחזר ברמת תא בודד מתרחיפים של תאים הטרוגניים ואפילו הטרוטיפיים, כמו אלה של TME 8,9,10. מכיוון שגם תבניות ביטוי פנוטיפיות וגם תבניות ביטוי פונקציונאליות הן תלויות זמן, תשומת לב קפדנית לתכנון הניסוי, בחירת פאנלים, בקרות ונוגדנים טיטרד מתאימים, ושימוש מתאים בעיבוד דגימות ובמכשור הם קריטיים לאמינות, יכולת השוואה ויכולת שחזור של תוצאות ולפרש בביטחון את תוצאות הניסוי11.

התקנים מיקרופלואידים של גידול-על-שבב (ToCs) מודלים את ה-TME בכך שהם מאפשרים ביומימטיקה בקנה מידה מיקרו-מבחנה של סרטן ודינמיקה של תאי מערכת החיסון ויחסי גומלין 12,13,14,15. באופן ספציפי, ToCs הם התקנים רב-ערוציים לתרביות תאים מיקרופלואידיות המסוגלים לארח סוגי תאים מגוונים המאורגנים בסביבות תרבית דו-ממדיות (2D) או תלת-ממדיות (3D) ומסוגלים למדל בנאמנות גבוהה ולשלוט בדיוק גבוה, ביחידות מבניות ותפקודיות מרכזיות כגון אינטראקציות תאיות הטרוטיפיות וזרימות של שיפועים כימיים המתרחשים פיזיולוגית ב-TME12, 13,14,15. בפרט, כימותרפיה חיסונית ומסלולים, כמו גם אינטראקציה של תאי מערכת החיסון עם תאים סרטניים, ניתן לנטר בזמן אמת ולכמת על ידי מיקרוסקופ בהילוך מהיר וניתוח מעקב אוטומטי 5,12,13,14,15,16. יתר על כן, ToCs מציעים את האפשרות לנתח ולתפעל תהליכים מכריעים המווסתים את הופעת הסרטן ואת ההתקדמות והתגובה לטיפול17.

במאמר זה, mFC עם ToCs משולבים כדי לחקור את כל רמות התגובה החיסונית האנטי-סרטנית העוברת דרך פגוציטוזה בתיווך DC של סרטן Ags (שלבים 1-3), הצלבת תאי T (שלב 4), הפעלה והרחבת שיבוט (האחרון באמצעות 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) וטכנולוגיית ציקלואידציה מזורזת Cu(I), מתודולוגיה רגישה ומדויקת ביותר, שלב 5), ביות תאי CD8E ל-TME (שלב 6) ולבסוף הרג תאי סרטן בתיווך CD8 E (שלב 7, איור 1).

עבודה זו תורמת למאמץ לקראת קביעת פרוטוקולים סטנדרטיים פשוטים, מהירים ואמינים לחקר מחזור החיסון לסרטן. השיפור והשילוב של מודלי mFC ו-ToC בחקר הסרטן, דינמיקת TME והתגובה לטיפול טומנים בחובם פוטנציאל גדול מכיוון שמודלים אלה מספקים נאמנות ביולוגית יחד עם בקרה ניסיונית. לפיכך, פרוטוקול זה מסייע לשחזר, באופן מדורג, את מחזור החסינות לסרטן בכך שהוא מאפשר לאפיין, לנטר ולתמרן בזמן את תפקידיהם של שחקני תאים בודדים ואת יחסי הגומלין שלהם על מעקב חיסוני טבעי ונרכש. זה בסופו של דבר יעזור לחדד, להפחית ולהחליף מחקרים בבעלי חיים תוך מתן תובנות קריטיות כדי להערים על גידולים ולהנחות את הטיפול הקליני. לבסוף, היתרונות והמגבלות של mFC ו- ToC נדונים באופן ביקורתי ומושווים לטכנולוגיות חדישות (למשל, ניתוחים מרחביים גבוהים ברזולוציה של תא בודד ואפילו תת-תאי) כדי לדחוף קדימה את המחקר והטיפול האונקו-אימונולוגי.

Protocol

כל שלבי הפרוטוקול המחייבים שימוש בבעלי חיים תואמים את הנחיית האיחוד האירופי 63/2010 וכלולים בפרוטוקול ניסוי שאושר על ידי הוועדה המוסדית לניסויים בבעלי חיים ומשרד הבריאות האיטלקי (אישור מספר 858/2015/PR).

1. הכנת תאים סרטניים

  1. שגרת תרבית תאים סרטניים (יום -7; משך: שעתיים)
    1. לגדל תאי פיברוסרקומה MCA205 מורין במכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 מדיום גידול בתוספת 10% (v/v) נסיוב בקר עוברי (FBS), 2 mM L-גלוטמין, 100 IU/mL פניצילין G מלח נתרן, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין סולפט, ו 50 מיקרוגרם / מ"ל היגרומיצין (מדיום גידול מלא), באינקובטור תרבית תאים לח בתנאי תרבית סטנדרטיים (37 ° C, 5% CO2).
      הערה: התאימו את תנאי התרבית בהתאם לקו התאים שבחרתם. במקרה של הפשרה, התאים זקוקים ~ 1 שבוע של זמן התאוששות כדי להסתגל לתנאי תרבית אופטימליים ולהקים מחדש מחזורי תאים נורמליים.
    2. כדי לייעל את צמיחת תרבית התא, תאי צלחת ב 75 ס"מ2 צלוחיות בצפיפות של 1 x 106 תאים / מ"ל ב 12-15 מ"ל של מדיום גידול שלם.
      הערה: מספר תאי הזרע עשוי להשתנות בין קווי תאים שונים, בדרך כלל בהתאם לגודל תא ספציפי וזמן ההכפלה. מפגש התאים משפיע באופן דרמטי על מצב התאים. אם התאים קטנים או חופפים מדי, הפרעות מטבוליות יכולות להתרחש ולהעדיף מעצר מתפשט, ברירה שבטית או לחץ תאי. עבור תאי MCA205, המעבר צריך להתבצע פעמיים בשבוע ביחס פיצול של 1:10-1:20.
    3. כאשר תרביות תאים מגיעות למפגש מרבי של 75%-80%, יש להשליך את מצע הגידול המלא מחד-שכבתי התא, לשטוף תאים במי מלח חומצי פוספט שחומם מראש (PBS) כדי להסיר FBS, ולאחר מכן להוסיף 1.5 מ"ל של 0.25% טריפסין/אתילאנדיאמין טטראצטי (EDTA) שחומם מראש למשך 1-2 דקות ב-37°C כדי לנתק תאים.
      הערה: FBS מכיל מעכבי פרוטאז שעלולים להשבית את הפעילות האנזימטית של טריפסין, ולכן הסרתו המלאה היא שלב מכריע. זמן הדגירה של טריפסין משתנה בהתאם לסוג התא. כהנחיה כללית, הימנעו מדגירה ארוכת טווח של תאים עם ריכוז טריפסין גבוה, שכן היא עלולה לפשוט חלבונים על פני התא ולגרום למוות תאי. בשלב זה, בדוק את מצב ניתוק התא עם מיקרוסקופ אור.
    4. לאסוף תאים מנותקים ב 10 מ"ל של מדיום גידול מלא שחומם מראש כדי להשבית את הפעילות האנזימטית של טריפסין ולצנטריפוגה אותם במשך 5 דקות ב 1100 × גרם בטמפרטורת החדר (RT). ספור תאים בשקופית ספירת תאים באמצעות בדיקת אי הכללת צבע כחול טריפאן ולאחר מכן זרע אותם מחדש עם דילול לתמיכות מתאימות לתרבית תחזוקה (לא יותר מ -8 מעברים מהפשרה) או להליכים ניסיוניים במורד הזרם, כמפורט להלן.
  2. מוות תאי סרטן - שחרור תא סרטני Ags (יום 0; משך: 30 דקות)
    1. לניסויים פונקציונליים במורד הזרם, צלחת 3 × 106 תאי MCA205 בצלחת פטרי 100 מ"מ שטופלה בתרבית רקמה ב -10 מ"ל של מדיום גידול שלם.
      הערה: עבור יישומים ניסיוניים ספציפיים (למשל, ניתוח של ספיגת גידול בתיווך DC), לפני גרימת מוות תאי, תאים סרטניים סומנו באמצעות מקשר תאים פלואורסצנטי (טבלה של חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
    2. להקרין תאים עם אור אולטרה סגול (UV)18 (ƛ = 254 ננומטר) במרחק 9 ס"מ במשך 3 דקות ולאחר מכן לדגור אותם ב 37 ° C, 5% CO2 במשך לפחות 6 שעות כדי לתת להם למות.
      הערה: מוות של תאים סרטניים יכול להיגרם גם על ידי טיפול כימותרפי (למשל, תרופות אימונוגניות או לא אימונוגניות5).

2. תרבית משותפת של סרטן ותאים חיסוניים

  1. קליטה והצגה של סרטן בתיווך DC (יום 0; תזמון: שעה אחת ספסל, 24 שעות זמן דגירה)
    1. לאחר 4-6 שעות, אספו DCs, במבחנה שהתמיינו מתאי מח עצם (BM) של עכברים בעלי יכולת חיסונית כמתוארקודם 8, ושטפו אותם פעמיים במשך 5 דקות ב 1100 x גרם ב RT במדיום גדילה מלא.
      הערה: לחילופין, ניתן לבודד DCs מטחול עכבר על ידי צנטריפוגה על שיפוע מבוסס היסטודנץ, כפי שדווח קודם לכן19. כשיטה טובה, אם משתמשים ב-DCs בהקפאה, הקפידו לחמם מראש את מצע הגידול המלא והוסיפו לו 1:1000 בנזונאז כדי למנוע התגבשות תאים ובכך להבטיח התאוששות טובה עם ההפשרה.
    2. לאסוף תאים סרטניים מוקרנים UV משלב 1.2.2 ולצנטריפוגה אותם במשך 5 דקות ב 1100 x גרם ב RT. לספור DCs "ריקים" נגזר BM (DCN) כמו לעיל (ראה שלב 1.1.4) ולאחר מכן להגדיר את התרבות המשותפת עם תאים אפופטוטיים מוקרנים UV ביחס של 2: 1 (5 × 105 תאים אפופטוטיים MCA205 עבור 2.5 × 105 DCs, כפי שאופטימיזציה קודמת8) בלוחות 12 בארות ב 1 מ"ל של מדיום צמיחה שלם טרי במשך 24 שעות ב 37 °C, 5% CO2. כמו בקרות ניסיוני, לדגור תאים ב 4 ° C, מצב שבו phagocytosis הוא הקשה.
      הערה: אין להגדיל את פני השטח והנפח של תרבית משותפת מכיוון שהדבר עלול לעכב אינטראקציות אפופטוטיות בין תאים סרטניים ל-DC ובכך לעכב פגוציטוזה אופטימלית ויעילה. יתר על כן, מחקרים כדי לייעל את יחס התא הסרטני:DC צריך להתבצע אם מודלים אחרים של תאים סרטניים משמשים.
  2. הערכת ספיגת סרטן על ידי mFC (יום 1; משך: 2 שעות)
    1. לאחר 24 שעות של דגירה, לאסוף תאים בצינורות 15 מ"ל ולשטוף אותם פעמיים במשך 5 דקות ב 1100 x גרם ב RT ב 10 מ"ל של מדיום גידול מלא.
      הערה: כדי להפחית את רעשי הרקע של תאים אפופטוטיים הדבוקים לקרום DC ועדיין לא נבלעו לחלוטין, כדורי התא מודגרים במשך 5 דקות ב- RT עם 0.1 M EDTA. מתלי תאים (המכילים כ 2 x 106 תאים) לאחר מכן צנטריפוגות פעמיים עם 10 מ"ל של מדיום גידול כמו בשלב 2.2.1.
    2. עבור צביעת פני השטח של התא, יש להשהות מחדש DCs שמקורם ב-BM ב-20 μL של מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות קרה (FACS) (1% FBS, 0.1 M EDTA ב-PBS) המכיל 0.5 מיקרוגרם של בקרת איזוטיפ מסוג IgG או CD11c מצומד נגד עכברים מסוג פיקואריתרין (PE) במיקרו-צלחת מצומדת של 96 בארות בצורת U של רקמה תחתונה שטופלה בתרבית ולדגור עליהם במשך 20 דקות ב-4°C בחושך כדי לשמר אות פלואורוכרום ולהימנע מהלבנה.
      הערה: ברגע שמתרחשת ספיגת אנטיגן סרטני, ניתן לאמת הפעלה "מלאה" של DC (DCPHAGO) גם על ידי בדיקת רמות הביטוי של מולקולות קוסטימולטוריות (כלומר, CD80 או CD86 ו- MHC-II ושל ליגנד נקודות הביקורת החיסונית CD274 אנטיגן [הידוע ביותר בשם PDL1]). ככלל, לביצועי ציטומטר זרימה אופטימליים, ריכוז הנוגדנים צריך להיות טיטרציה בזהירות ומספר התא צריך לנוע בין 1 x 105 ל 1 x 108 תאים / בדיקה.
    3. לאחר מכן, שטפו תאים פעמיים במאגר FACS והוסיפו 100 μL של תמיסת PBS המכילה צבע כמעט אינפרא אדום (IR) הניתן לקיבוע חיוניות בריכוז סופי של 1 מיקרומטר למשך 30 דקות ב-RT.
      הערה: כחלופה, ניתן להשתמש בצבעים חיוניים אחרים הניתנים לתיקון (למשל, סגול, כחול, כתום, ליים, אקווה) שאינם חופפים לפליטות פלואורסצנטיות משומשות.
    4. יש לשטוף תאים פעם אחת ב-PBS ולהשעות אותם מחדש במאגר FACS לפני ניתוח ציטומטרי של רמות CD11c ו-PKH67 באמצעות mFC. במהלך רכישת mFC, ולאחר מכן בניתוח נתונים, המשך באסטרטגיית ה- gating הבאה:
      1. זהה את התאים המעניינים בהתבסס על מאפייני אזור הפיזור הקדמי שלהם (FSC-A, ציר x) ואזור הפיזור הצדדי (SSC-A, ציר y) (שער 1). אל תכלול כפילים וגושים של תאים בניתוח על-ידי התוויית FSC-A (ציר x) וגובה פיזור קדימה (FSC-H, ציר y, שער 2).
      2. הסר תאים מתים על-ידי התוויית אזור מסנן פס פליטה של 780/60 ננומטר (bp) (ציר x) ו- SSC-A (ציר y, שער 3). לבסוף, בהתבסס על שער 3 לזהות חיוביות התא עבור סמן CD11c ומקשר תאים פלואורסצנטי PKH67 בחלקות צפיפות של שני פרמטרים באמצעות מסנני bp פליטה של 575/26 ננומטר ו- 530/30 ננומטר, בהתאמה.
    5. בצע ניתוח נתונים.
      הערה: הקפידו לשלב נוגדנים על מנת להבטיח תיוג קל ויעיל עם אורכי גל פליטה מופרדים היטב. זה מפשט את הגדרת הפיצוי עבור פלואורופורים בשימוש ומאפשר כימות קל, מהיר ואמין של הפרמטרים המעניינים.
  3. הכנה והפעלה של תאי CD8 T (יום 1; משך: שעה אחת זמן ספסל, 72-96 שעות זמן דגירה)
    1. לטהר תאי CD8 T טבליות מורין (CD8N) כפישתואר קודם 8.
    2. ספירה והשעיה מחדש של תאי CD8 T מבודדים ב-500 מיקרוליטר של מדיום גידול שלם טרי ותרבית אותם עם DCs שמקורם ב-BM שלקחו בעבר תאי MCA205 אפופטוטיים ביחס של 2.5:1 (2.5 × 105 DCs עבור 1 × 105 תאי T, כפי שאופטימיזציה קודמת8) למשך 72 שעות בלוחות 12 בארות בנפח סופי של 1.5 מ"ל ב-37°C, 5% CO2.
      הערה: כדי להדגיש את תוצאות הניסוי, נבדקו יחסים שונים של תרביות תאים ונבחר הטוב ביותר.
  4. ניתוח התפשטות תאי CD8 T על ידי בדיקת EdU mFC (יום 4; משך: 15 דקות זמן ספסל, 16-20 שעות דגירה)
    1. הוסף את אנלוגי הנוקלאוזיד לתימידין EdU למדיום התרבית המשותפת בריכוז סופי של 10 מיקרומטר וערבב היטב.
      הערה: מאחר שתנאי התרבית, שינויים בסוג התא וצפיפות התא עשויים להשפיע על שילוב EdU בדנ"א, בדוק טווח של ריכוזי EdU וזמני דגירה בניסויי פיילוט. דגירות ארוכות או קצרות יותר עשויות לדרוש ריכוזים נמוכים או גבוהים יותר, בהתאמה. כלול תאים מאותה אוכלוסייה שלא טופלו ב- EdU כבקרת צביעה שלילית.
    2. לאחר 16-20 שעות, לשחזר צנטריפוגה CD8C-P פעמיים במשך 5 דקות ב 1100 x גרם ב RT.
    3. צבעו את התאים עבור סמנים על פני השטח ב-20 מיקרוליטר של חיץ FACS קר בתוספת 0.5 מיקרוגרם CD8a מצומד נגד עכבר פלואורסצאין (FITC) ו-0.25 מיקרוגרם CD3 מצומד PE נגד עכבר או עם פקדי איזוטיפ IgG המתאימים במיקרו-צלחת תחתונה בצורת U בצורת U שטופלה ב-TC ודגרו עליהם במשך 20 דקות ב-4°C בחושך.
      הערה: כדי למנוע הפרעה, מומלץ לא להשתמש בהצמדות נוגדנים Qdot לפני ביצוע תגובת הלחיצה.
    4. יש לשטוף תאים פעמיים במאגר FACS (כמו בשלב 2.2.3) ולהשהות מחדש את כדורי התא ב-100 מיקרוליטר של תמיסת PBS המכילה את צבע המים הניתן לקיבוע חיוניות בריכוז סופי של 1 מיקרומטר למשך 30 דקות ב-RT.
      1. העבירו את מתלי התאים לצינורות זרימה, שטפו אותם פעם אחת עם 3 מ"ל של אלבומין בסרום בקר 1% (BSA) ב-PBS, והמשיכו בקיבוע התאים ב-100 מיקרוליטר של קיבוע (כלומר, 4% פרפורמלדהיד ב-PBS) למשך 15 דקות ב-RT, מוגן מפני אור.
      2. מיד לאחר מכן, שטפו תאים פעם אחת עם 3 מ"ל של 1% BSA ב-PBS, דגרו עליהם ב-100 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 1x חדירות מבוססת סאפונין ושטפו מגיב במשך 15 דקות ב-RT, ולאחר מכן המשיכו ישירות לתגובת התוויה.
        הערה: מגיב חדירות ושטיפה 1x מבוסס סאפונין מוכן על ידי דילול נפח של תמיסה 10x 1:10 עם 1% BSA ב- PBS. מגיב זה יכול לשמש גם עם השעיות תאים המכילים דם שלם או תאי דם אדומים, כפי שהוא משמר את מאפייני פיזור האור המורפולוגי של לויקוציטים תוך שכיבת תאי דם אדומים.
      3. על פי מספר הדגימות שיש לנתח, הכינו את קוקטייל התגובה על ידי ערבוב עדין ורציף של נפחים מצוינים של PBS, זרז מגן נחושת, Alexa Fluor (AF) 647-conjugated picolyl azide, ותוסף חיץ 1x EdU.
        1. השתמש בקוקטייל התגובה תוך 15 דקות מההכנה. הוסיפו 500 μL של תערובת התגובה לכל צינור, ערבבו היטב ודגרו במשך 30 דקות ב-RT בחושך.
      4. לשטוף תאים פעם אחת עם 3 מ"ל של 1x saponin-מבוסס permeabilization ו לשטוף מגיב, ולהשעות אותם מחדש ב 100 μL של אותה תמיסה לפני שתמשיך עם שיטות mFC סטנדרטיות לקביעת אחוז שלב S מתפשט CD8C-P באוכלוסיית התא באמצעות mFC. במהלך רכישת mFC ולאחר מכן בניתוח נתונים, המשך באסטרטגיית gating הבאה:
        1. זהה את התאים המעניינים בהתבסס על המאפיינים FSC-A (ציר x) ו- SSC-A (ציר y) שלהם (שער 1). אל תכלול כפילים וגושים של תאים בניתוח על-ידי התוויית FSC-A (ציר x) ו- FSC-H (ציר y, שער 2). הסר תאים מתים על-ידי התוויית אזור מסנן BP פליטה של 525/50 ננומטר (ציר x) ו- SSC-A (ציר y, שער 3).
        2. זהה חיוביות תאים עבור CD8a ו- CD3 בחלקות צפיפות של שני פרמטרים באמצעות מסנני bp פליטה של 530/30 ננומטר ו- 575/26 ננומטר, בהתאמה (שער 4). לבסוף, בהתבסס על שער 4, יש לנתח תאים נוספים עבור שילוב AF647-EdU כעוצמה פלואורסצנטית ממוצעת בהיסטוגרמה של פרמטר יחיד באמצעות מסנן פליטה של 660/620 ננומטר bp.
          הערה: האות הפלואורסצנטי שנוצר על-ידי תיוג EdU מזוהה בצורה הטובה ביותר באמצעות קצב זרימה נמוך במהלך הרכישה.
      5. בצע ניתוח נתונים.

3. גירוי מחדש של CD8C-P עם תאים סרטניים

  1. CD8C-P מזהה תאים סרטניים חיים (יום 4; משך: 1 שעה זמן ספסל, 48-72 שעות של דגירה)
    1. לשחזר CD8C-P מתרבות משותפת (עיין בשלב 2.3.2) ולצנזר אותם במשך 10 דקות ב 1100 x גרם ב RT ב 10 מ"ל של מדיום צמיחה מלא.
      הערה: בשלב זה, אמת את התמיינות תאי CD8 T על-ידי בדיקת רמות הביטוי של סמן ההפעלה CD95.
    2. כדורי תא השעיה, המכילים כ 2.5 × 106 תאים, ב 100 μL של מיקרו-כדוריות להסרת תאים מתים לכל 1 x 107 תאים סה"כ.
      הערה: עבור מספרי תאים גבוהים יותר, הרחב את המגיב ואת אמצעי האחסון הכוללים בהתאם.
    3. מערבבים היטב ודגרים במשך 15 דקות ב-RT.
      הערה: במידת הצורך, נפח הדגימה מותאם על-ידי הוספת מאגר מחייב 1x, בהתאם להוראות היצרן, כדי להשיג מינימום של 500 μL הדרוש להפרדה מגנטית.
    4. מיד לאחר מכן, המשך עם הפרדת תאים מגנטיים לאחר מכן. מקמו עמודי הפרדה בשדה המגנטי של מפריד מתאים ושטפו אותם בכמות המתאימה של חיץ קשירה 1x. העבר מתלי תאים לעמודות הפרדה ואסוף את הזרימה המכילה את מקטע התא החי ללא תווית.
    5. שטפו שוב עמודות עם הכמות המתאימה של מאגר כריכה אחד. לאסוף תאים ללא תווית שעוברים דרכם ולשלב אותם עם השפכים משלב 3.1.4.
      הערה: כדי להגביר את יעילות ההסרה המגנטית של תאים מתים, ניתן להעשיר את מקטע התא החי בהליך הפרדה שני כמתואר בשלבים 3.1.1-3.1.5 באמצעות עמודה חדשה.
    6. צנטריפוגות מועשרות CD8C-P חי במשך 5 דקות ב 1100 x גרם ב RT במדיום צמיחה מלא לפני ספירת תאים ולאחר מכן תרבית אותם עם תאי MCA205 טריים ביחס של 2:1 (1 x 105 תאי CD8 T עבור 5 x 104 תאי MCA205, כפי שאופטימיזציה קודמת8) ב 12 לוחות באר בנפח סופי של 1 מ"ל. לאחר זריעת תאים, הניחו לוחות תרבית משותפת באינקובטור תרבית תאים לחים או במערכת ניתוח תאים חיים במשך 72 שעות ב 37 ° C, 5% CO2, לפני שתמשיך עם בדיקות במורד הזרם.
  2. סחר בתאי CD8 T לעבר תאים סרטניים במודלים מיקרופלואידים של ToC (יום 5; משך: שעתיים זמן ספסל, 72 שעות דגירה)
    1. יש לעקר אד הוק מכשירי ToC microfluidic מפוברקים13,20 תחת ארון UV למשך 20 דקות, לשטוף פעמיים עם PBS, ולאחר מכן לדגור עם מדיום צמיחה מלא במשך 1 שעה לפחות.
      הערה: תאי MCA205 ו- CD8C-P אינם מוכתמים בפרוטוקול זה; עם זאת, ניתן לתייג את שניהם באמצעות עוקבי תאים חיים פלואורסצנטיים.
    2. השהה מחדש בעדינות 1 × 105 תאי MCA205 ב 15 μL של מדיום גידול מלא, תוך הקפדה על השגת התפלגות תאים הומוגנית, ולהזריק אותם לאט לתאי השבב בצד שמאל (תא הגידול) כפי שתואר קודם לכן. המתן 5-10 דקות כדי לאפשר לתאים סרטניים להיצמד למרתף השבבים.
      1. בדוק את ההתפלגות הנכונה וההומוגנית של תאים סרטניים בשבב המיקרופלואידי תחת מיקרוסקופ. תוצאות הניסוי יכולות להיות מושפעות מנוכחות של בועות.
    3. Resuspend 1 x 106 CD8C-P ב 50 μL של מדיום צמיחה מלא. מזלפים בעדינות את תרחיף תאי החיסון לתוך תאי השבב הימניים (תא החיסון).
      הערה: בשלב זה, השתמש במיקרוסקופ כדי לאשר שתאי מערכת החיסון מפוזרים לתוך תא הביניים, ויוצרים "חזית", המייצגת את נקודת ההתחלה של הניסוי.
    4. כדי למנוע לחץ ותנודות מיקרופלואידיות, מלא בזהירות את כל מאגרי השבבים כפי שצוין קודם לכן13 עם עד 150 μL של מדיום גידול מלא ומניחים שבבים מורכבים על משטח ישר באינקובטור תרבית תאים Humified ב 37 ° C, 5% CO2 למשך לפחות 1 שעה כדי לייצב את המערכת לפני הקלטות time-lapse.
      הערה: בדוק בזהירות הפסדי אידוי פוטנציאליים של נפחים בשני המאגרים של כל תא שבב ופצה אותם על ידי הוספת מדיום טרי כל 2 עד 3 ימים. במידת הצורך, ניתן לשאוף עד 100 מיקרוליטר של סופרנאטנטים מכל תא תא כדי לבצע פרופיל ציטוקינים.
    5. השתמש במיקרוסקופ וידאו המצויד במערכת דגירה כדי להקליט סדרות תמונות בשדה בהיר של מערך המיקרו-ערוצים בין אזורי ההתקן הימני והשמאלי המכילים MCA205 ותאי מערכת החיסון, בהתאמה, וכדי להמחיש את הדינמיקה של חדירת תאי מערכת החיסון ואינטראקציה בין תאי מערכת החיסון לתאי סרטן.
      הערה: במסגרת הניסוי המשמשת כאן, הקלטות בהילוך מהיר של התאים נאספו באינקובטור במשך 72 שעות באמצעות מיקרוסקופ שרכש מיקרופוטו אחד כל 2 דקות. מטב את תנאי ההדמיה כדי למנוע חשיפה מוגזמת לתמונות וכדי לקבל קצב פריימים גבוה על מנת לבצע בקלות ניתוחי מעקב אחר תאי מערכת החיסון במורד הזרם. בסוף קיטוע הזמן, בצע ניתוח מעקב חצי אוטומטי13,20.
  3. הפעלת CD8E והערכה ציטומטרית של זרימת תגובתיות הגידול (יום 7 ו -8; משך: שעתיים)
    1. לאחר 48 ו-72 שעות של דגירה (ראה שלב 3.1.6), לשחזר CD8E וצנטריפוגה פעמיים במשך 5 דקות ב 1100 x גרם ב RT.
      הערה: כדי להעריך את הרמות התוך-תאיות של מולקולות ציטוטוקסיות המיוצרות על ידי CD8E (כלומר, IFN-γ ו- Grz-B), תרביות משותפות של תאים סרטניים וחיסוניים הודגרו בעבר במשך 6 שעות לפחות עם 1:1000 ברפלדין A ו- 1:1500 מונסין.
    2. עבור צביעת פני השטח של התא, יש להשהות מחדש תאים ב-20 μL של שלוש תערובות נוגדנים ראשוניות שונות שהוכנו במאגר FACS קר כמו בטבלה משלימה 1.
      הערה: כדי להבטיח את הספציפיות של קשירת נוגדנים, בצע ניסויי mFC בנוכחות בקרות איזוטיפ IgG מתאימות כמו בשלב 2.2.2.
    3. יש לדגור על תאים במיקרו-צלחת בצורת תרבית רקמה תחתונה בצורת U בעלת 96 בארות למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4°C, המוגנת מפני אור. עבור כדורי תאים מתערובות A ו- B (טבלה משלימה 1), המשך ישירות לשלב 3.3.5.
    4. לאחר שטיפה מהירה, יש להוסיף 100 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע/חלחול לכדורי תאים מתערובת C (טבלה משלימה 1). לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורה של 4° צלזיוס בחושך, יש לשטוף תאים פעמיים ב-200 מיקרוליטר של חיץ חדירה/שטיפה קרה ולהשהות אותם מחדש ב-20 מיקרוליטר של חיץ חדירה/שטיפה קר המכיל 0.25 מיקרוגרם של IFN-γ מצומד נגד עכבר מסוג FITC ו-0.125 מיקרוגרם של GRZ-B מצומד נגד עכבר PE או עם איזוטיפים מסוג IgG המתאימים. יש לדגור על תאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C, מוגנים מפני אור.
    5. לאחר מכן, שטפו תאים פעמיים במאגר FACS והוסיפו לכדורי התא 100 μL של תמיסת PBS המכילה את צבע Aqua הניתן לקיבוע חיוניות בריכוז סופי של 1 מיקרומטר למשך 30 דקות ב-RT (כמו בשלב 2.2.4).
    6. לשטוף תאים פעם אחת PBS ולהשעות אותם מחדש במאגר FACS לפני ניתוח ציטומטרי זרימה של הפעלת תאי CD8 T נגד תאים סרטניים באמצעות mFC. במהלך רכישת mFC ולאחר מכן בניתוח נתונים, המשך באסטרטגיית gating הבאה:
      1. זהה את התאים המעניינים בהתבסס על המאפיינים FSC-A (ציר x) ו- SSC-A (ציר y) שלהם (שער 1). אל תכלול כפילים וגושים של תאים בניתוח על-ידי התוויית FSC-A (ציר x) ו- FSC-H (ציר y, שער 2). הסר תאים מתים על-ידי התוויית אזור מסנן BP פליטה של 525/50 ננומטר (ציר x) ו- SSC-A (ציר y, שער 3).
      2. זהה חיוביות תאים עבור CD8a ו- CD3 בחלקות צפיפות של שני פרמטרים באמצעות מסנני BP של 660/20 ננומטר ו- 780/60 ננומטר או 530/30 ננומטר ופליטת 575/26 ננומטר (שער 4). לבסוף, בהתבסס על שער 4, ניתן לנתח תאים נוספים בחלקות צפיפות של שני פרמטרים עבור CD44 (מסנן bp פליטת 530/30 ננומטר), CD25 (מסנן bp פליטת 575/26 ננומטר) ו- CD69 (מסנן bp פליטת 450/50 ננומטר) עבור סמן CD137 (מסנן bp פליטת 660/20 ננומטר), ועבור IFN-γ (מסנן bp פליטת 530/30 ננומטר) ו- Grz-B (מסנן bp פליטת 575/26 ננומטר) עבור תערובת A, B ו-C (טבלה משלימה 1), בהתאמה.
        הערה: תגובתיות גידול תאי CD8E יכולה להיבדק עוד יותר על ידי הערכת ביטוי פני השטח של חלבון הקשור ליזוזומלי CD107a באמצעות בדיקת degranulation אד הוק .
    7. בצע ניתוח נתונים.
  4. CD8E חקירה בתיווך תאים הורג הגידול על ידי מערכת ניתוח תאים חיים ו mFC (יום 8; משך: שעה ספסל, 72 שעות דגירה)
    1. לבדיקת הרג גידולים באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים, השלימו את מדיום התרבית המשותפת (ראה שלב 3.1.6) בצבע כימות מוות תאי בזמן אמת בריכוז סופי של 250 ננומטר.
    2. לאחר הצבת לוחות התרבית המשותפת במערכת ניתוח התאים החיים, אפשרו לצלחת להתחמם ל-37°C למשך 30 דקות לפני הסריקה. בצע סריקת נתונים כל שעתיים עד 72 שעות כדי לאסוף הקלטות בהילוך מהיר, אשר ינותחו על ידי תוכנות מתאימות.
    3. עבור בדיקת הרג גידולים באמצעות mFC, 72 שעות מאוחר יותר (ראה שלב 3.1.6), קציר ותאי צנטריפוגות פעמיים במשך 5 דקות ב 1100 x גרם ב RT.
    4. תאי צביעה לסמני פני שטח ב-20 μL של חיץ FACS קר המכיל 0.125 מיקרוגרם של בקרת איזוטיפ IgG או CD45 מצומד נגד עכבר כחול פסיפי (PB) במיקרו-צלחת תחתונה בצורת U בצורת 96 באר שטופלה ב-TC ודגרה עליהם במשך 20 דקות ב-4°C בחושך. מיד לאחר מכן, שטפו תאים פעמיים במאגר FACS והוסיפו את צבע החיוניות פרופידיום יודיד (PI) בריכוז סופי של 1 מיקרומטר לפני ניתוח ציטומטרי זרימה. במהלך רכישת mFC ולאחר מכן בניתוח נתונים, המשך באסטרטגיית gating הבאה:
      1. זהה את התאים המעניינים בהתבסס על המאפיינים FSC-A (ציר x) ו- SSC-A (ציר y) שלהם (שער 1). אל תכלול כפילים וגושים של תאים בניתוח על-ידי התוויית FSC-A (ציר x) ו- FSC-H (ציר y, שער 2).
      2. זיהוי תאים סרטניים עבור שליליות CD45 באמצעות מסנן bp פליטה של 450/50 ננומטר (שער 3). לבסוף, נתח תאים עבור שילוב PI כעוצמה פלואורסצנטית ממוצעת בהיסטוגרמה של פרמטר יחיד באמצעות מסנן פליטה של 610/620 ננומטר bp.
        הערה: מוות של תאים סרטניים יכול להיות מנותח גם על ידי ביצוע בדיקת אפופטוזיס V-PI Annexin או על ידי הערכת רמות הביטוי של Caspase-3 ו -7 שסוע.
    5. בצע ניתוח נתונים.
      הערה: ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת Prism GraphPad v.8.4.0.

תוצאות

היכולת של CD11c+ DCs, תת-הקבוצה הידועה של פגוציטים המתמחה בהצגה צולבת21,22 ומגודרת כפי שמוצג באיור 2A, לבלוע גופים אפופטוטיים מתאי סרטן MCA205 מוקרנים UV שסומנו בעבר במקשר תאים פלואורסצנטיים PKH67 הוערכה על-ידי mFC. כצפוי, CD11c+ DCs לכדו ביעילות תאי...

Discussion

ניטור התגובה החיסונית האנטי-סרטנית הוא בעל חשיבות עליונה כדי להבהיר ולהבין את יחסי הגומלין המולקולריים והתאיים המורכבים הפועלים ב-TME ותומכים במאבק מתמיד על עליונות23. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול פשוט בסיוע mFC ו- ToC לניטור ואפיון השלבים המרכיבים את מחזור החיסון לסרטן. עם שינויים קל...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

A.S. נתמך על ידי AIRC (IG #28807) ועל ידי PRIN (#P2022YE2MX). M.M. נתמך על ידי מלגת AIRC-FIRC (#25558). A.D.N. נתמכת על ידי Innovation Ecosystem Rome Technopole ECS00000024 במימון האיחוד האירופי - הדור הבא של האיחוד האירופי, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubes Eppendorf30120086
100 kV e-beam litographyVistec
100 mm Petri dishes Greiner Bio One664160
12-well platesEuroclone ET3012
15 and 50 mL tubesCorning 352096; 352070
40 μm cell strainer Corning CLS431750
5 mL polystyrene tubes Greiner Bio-One120180
70 μm cell strainer Corning CLS431751
75 cm2 cell culture treated flaskEuroclone ET7076
Adsorbent wipes
Allumin foil
anti-mouse CD107a (LAMP-1) AntibodyMiltenyi Biotec130-111-319
anti-mouse CD25 (7D4) Antibody Miltenyi Biotec130-118-678
anti-mouse CD3 (17A2) AntibodyBioLegend100206
AptesSigma Aldrich440140
BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlugBD Biosciences555028
BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)BD Biosciences555029
BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)BD Biosciences554724
Bovine serum albumin (BSA)US Biological, SalemA1312
CD11c Monoclonal Antibody (N418)eBioscience12-0114-81
CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)eBioscience17-1371-82
CD3 Monoclonal Antibody (17A2)eBioscience25-0032-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7)eBioscience11-0441-82
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)InvitrogenMCD4528
CD69 Monoclonal Antibody (H1.2F3)eBioscience48-0691-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience11-0081-82
CD8a Monoclonal Antibody (53-6.7)eBioscience17-0081-82
CD95 (APO-1/Fas) Monoclonal Antibody (15A7)eBioscience53-0951-82
Cell counting slidesKova International87144E
Chromium quartz masksMB W&A, Germany
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay KitInvitrogenC10635
CytoFLEX Flow CytometerBeckman Coulter
Dead Cell Removal KitMiltenyi Biotec130-090-101
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS)EuroCloneECB4053L
EDTAInvitrogenAM9260G
Fetal bovine serum (FBS)EuroCloneECS0180L
Flowjo v10.0.7Flowjo, LLC
Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)eBioscience12-8898-82
H2O2Sigma Aldrich
H2SO4Sigma Aldrich
hotplate
Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)Thermo Scientific
Ice machineBrema Ice Makers
IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)eBioscience11-7311-82
Illustrator CC 2015Adobe Systems Inc.
ImageJNational Institute of Health
Incucyte 2022A SoftwareSartorius
Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead CellsSartorius4632
Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System Sartorius
JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging MicroscopeBulldog Bio
Laboratory bench
Laboratory refrigerator (4°C)
Laboratory Safety Cabinet (Class II)Angelantoni
L-glutamine 200 mMEuroCloneECB3004D
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34957
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitInvitrogenL10119
MACS columnsMiltenyi Biotec130-042-201; 130-042-401 
MACS separatorsMiltenyi Biotec130-042-10; 130-042-302
MCA205 mouse fibrosarcoma cell lineSigma-AldrichSCC173
Microbiologically controlled animal facility equipped with Class II safety cabine
MicroCL 21R MicrocentrifugeThermo Scientific75002552
Microsoft Excel Microsoft, Redmond 
Mouse: C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664
Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouseMiltenyi Biotec130-096-543
Nikon ECLIPSE Ts2Nikon Instruments Inc.
NIS-Elements BR 5.30.0064-BITNikon Instruments Inc.
Optical litographyEVG
Penicillin G sodium salt and streptomycin sulfateEuroCloneECB3001D/1
Pipet aidDrummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201
PipettesEppendorf
PKH67 Fluorescent Cell Linker KitsSigma-AldrichPKH67GL-1KTfluorescent cell linker  kit
plastic coverslipIBIDI10812
Propidium IodideThermo ScientificP1304MP
Reactive Ion Etching systemOxford plasmalab
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)EuroCloneECB9006L
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)Corning- Millipore-Sigma; St. Louis,
MO		CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489
SL 16 Centrifuge SeriesThermo Scientific75004031
Sterile scalpels, surgical forceps, scissors and pliers
Sterile tips (1–10 μL, 20–200 μL, 1000 μL)EuroClone Spa, Milan, ItalyECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005
SU-8 3000 seriesMicroChem corp, Newton, (MA)
Suite of dermal biopsy punchesKai Medical, Tedpella
Sylgard 184Dowsil, Dow Corning101697
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597)eBioscience12-5961-82
Thermostatic bath
Timer
TMCS Sigma Aldrich92360
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA w/ Phenol RedEuroCloneECM0920
Vacuum dessicator

References

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype. Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).
  3. Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure. Cells. 10 (9), 2361 (2021).
  4. Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. The three Es of cancer immunoediting. Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).
  5. Musella, M., et al. Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B. Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).
  6. Anderson, K. G., et al. Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies. J Immunother Cancer. 11 (6), e006533 (2023).
  7. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  8. Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry. Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).
  9. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Front Mol Biosci. 7, 612801 (2020).
  10. Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy. Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).
  11. Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge. Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).
  12. Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. 3D cancer models: One step closer to in vitro human studies. Front Immunol. 14, 1175503 (2023).
  13. De Ninno, A., et al. Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments. JoVE. (170), e61895 (2021).
  14. Mattei, F., et al. Oncoimmunology meets organs-on-chip. Front Mol Biosci. 8, 627454 (2021).
  15. Businaro, L., et al. Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment. Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).
  16. Vacchelli, E., et al. Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1. Science. 350 (6263), 972-978 (2015).
  17. Maulana, T. I., et al. Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy. Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).
  18. Lorenzi, S., et al. Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming. J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).
  19. Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies. Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).
  20. Lucarini, V., et al. Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma. J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).
  21. Gutiérrez-Martínez, E., et al. Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets. Front Immunol. 6, 363 (2015).
  22. Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  23. Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition. Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).
  24. Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI. Front Oncol. 13, 1172314 (2023).
  25. Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
  26. Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research. Clin Transl Med. 12 (1), 696 (2022).
  27. Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics. Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).
  28. Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. Current trends in flow cytometry automated data analysis software. Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).
  29. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved