الإنتاج والفحص المجهري للتصوير مدى الحياة للخلايا الحية متعدد المعلمات (FLIM) للكرويات متعددة الخلايا

Summary

هنا ، نصف طرق تكوين كروية متعددة الخلايا مختلفة لإجراء الفحص المجهري للخلايا الحية متعدد المعلمات للمتابعة. باستخدام المجهر التصويري مدى الحياة الفلوري (FLIM) ، والتألق الذاتي الخلوي ، والأصباغ الملطخة ، والجسيمات النانوية ، يتم إثبات نهج تحليل استقلاب الخلايا ، ونقص الأكسجة ، وموت الخلايا في السرطان الحي ثلاثي الأبعاد (3D) والأجسام الكروية المشتقة من الخلايا الجذعية.

Abstract

كرويات الورم متعددة الخلايا هي نموذج microaggregate الأنسجة 3D شعبية لإعادة إنتاج البيئة المكروية للورم ، واختبار وتحسين العلاجات الدوائية واستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية والنانوية في سياق 3D. تعد سهولة إنتاجها وحجمها الذي يمكن التنبؤ به ونموها وتدرجات المغذيات والأيض المرصودة مهمة لتلخيص البيئة المكروية للخلايا الشبيهة ب 3D. ومع ذلك ، يمكن أن يؤثر عدم التجانس الكروي وتنوع طرق إنتاجها على التمثيل الغذائي الكلي للخلايا ، والقدرة على البقاء ، والاستجابة الدوائية. هذا يجعل من الصعب اختيار المنهجية الأنسب ، مع الأخذ في الاعتبار المتطلبات في الحجم ، والتباين ، واحتياجات التصنيع الحيوي ، واستخدامها كما هو الحال في نماذج الأنسجة 3D في المختبر في بيولوجيا الخلايا الجذعية والسرطانية. على وجه الخصوص ، يمكن أن يؤثر إنتاج الكرة الأرضية على توافقها مع المجهر الحي الكمي ، مثل التصوير الأيضي البصري ، أو الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة (FLIM) ، أو مراقبة نقص الأكسجة الكروي باستخدام أجهزة الاستشعار النانوية ، أو الجدوى. هنا ، يتم تقديم عدد من بروتوكولات تكوين كروية تقليدية ، مما يسلط الضوء على توافقها مع المجهر الحي واسع المجال ، والبؤري ، وثنائي الفوتون. كما يتم تقديم التصوير التكميلي لخط أنابيب التحليل باستخدام FLIM متعدد التألق الذاتي ، وباستخدام أنواع مختلفة من السرطان وكروية الخلايا الجذعية.

Introduction

تمثل الأجسام الكروية متعددة الخلايا مجموعة من نماذج الأنسجة 3D التي تم الحصول عليها عن طريق التجميع الذاتي للخلايا وإظهار شكل كروي. وهي تستخدم على نطاق واسع لتقليد التفاعل بين الخلايا والخلايا والمصفوفة في المختبر وإعادة إنتاج سياق 3D ضمن العديد من التركيبات المشتقة من السرطان والخلايا الجذعية. يتم استخدام العديد من التقنيات لتقليل ارتباط الخلية وتعزيز التجميع. وتشمل هذه طريقة التعليق والإفلات التي تعتمد على التوتر السطحي¹ ؛ طرق صد مرفقات الخلايا مثل ألواح التعلق المنخفضة للغاية والقوالب الدقيقة^{والآبار الدقيقة 2,3} ؛ النهج القائم على الموجات الصوتية⁴ ؛ طر....

Protocol

1. توليد كرويات متعددة الخلايا

1. زراعة الخلايا
   ملاحظة: يمكن جمع مزارع الخلايا من مجموعة ثقافة النوع الأمريكية (ATCC) أو Lonza أو Sigma-Aldrich أو بائعين آخرين. يوفر ATCC جميع معلومات المناولة المطلوبة ، بما في ذلك وسائط النمو المفضلة ، وإجراءات الاستزراع الفرعي ، ومستوى السلامة الأحيائية ، ومعدل النمو ، وملامح STR. هنا ، يتم استخدام 500 خلية / كروية من خط خلايا سرطان القولون البشري HCT116 في وسائط McCoy's 5A (VWR ، 392-0420) مع 10٪ FBS و 1 mM Sodium Pyruvate. بالنسبة للتجارب طويلة المدى التي تتم مراقبتها يوميا ، يمكن إضافة 10 mM HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.2 إلى الوسائط.
   1. تنمو ثقافة الخلايا للوصول إلى التقاء 70٪ -90٪.
   2. شطف ا....

النتائج

اختيار طريقة تكوين كروية مناسبة
يمكن أن تؤثر طريقة تكوين الكرة المختارة بشكل كبير على حجم الكرات وشكلها وكثافة الخلية وصلاحيتها وحساسية الدواء (الشكل 2). في السابق ، تمت مقارنة تأثيرات العديد من الطرق عالية الإنتاجية (SphericalPlate 5D ، والقوالب الدقيقة المصنوعة في الم.......

Discussion

أصبحت الكرات متعددة الخلايا طريقة مفضلة في دراسات البيئات الدقيقة المتخصصة للأورام والخلايا الجذعية ، واكتشاف الأدوية ، وتطوير "لبنات بناء الأنسجة" للتصنيع الحيوي. يمكن أن تحاكي البنية الداخلية غير المتجانسة للكرويات وتدرجات العناصر الغذائية والأوكسجين تلك الموجودة في الأنسجة والأورا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Also available from Sigma
10 mL serological pipets	VWR	612-3700	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
12 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	665-180	Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable	Ibidi	81201	Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes	Nerbe plus	02-502-3001	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3D Petri Dish micromolds	Microtissue	Z764000-6EA
6 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	657160	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
70% ethanol	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation
Calcein Green-AM	Tebubio	AS-89201	Apply in dilution 1:1000
CellSens Dimension software	Olympus	version 3
Collagen from human placenta, type IV	Sigma	C5533	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Confocal FLIM Microscope	Leica Microsystems	N/A	Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective
D(+)-Glucose	Merck	8342	Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	For preparation of imaging medium
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-098	Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Human colon cancer cells HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	version 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	version 4.6.1.27508
L-glutamine	Gibco	25030	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES	VWR	392-0420	Standard growth medium for HCT116 cells
micro-patterned 3D-printed PDMS stamps	N/A	N/A	Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Neubauer couting chamber	Fisher Scientific	15980396
O2 probes: MMIR1	N/A	N/A	Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution	Gibco	15140-122	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5mg	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	25535-16-4	Cell death staining, use 1 µg/mL at 1h incubation
PVDF syringe filter 0.22 µm	Novolab	A35149	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SphericalPlate 5D 24-well	Kugelmeiers	SP5D-24W
sterile petridish	Greiner bio-one	633181	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (25 cm² )	VWR	734-2311	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (75 cm²)	VWR	734-2313	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
U-bottom 96-well plate	VWR	10062-900	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope	Olympus	N/A	Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water