Microscopía de imagen de por vida (FLIM) de fluorescencia de células vivas multiparamétricas y producción de esferoides multicelulares

Resumen

En este trabajo se describen diferentes métodos de formación de esferoides multicelulares para realizar un seguimiento de la microscopía multiparamétrica de células vivas. Mediante el uso de microscopía de imágenes de fluorescencia (FLIM), autofluorescencia celular, colorantes de tinción y nanopartículas, se demuestra el enfoque para el análisis del metabolismo celular, la hipoxia y la muerte celular en cáncer tridimensional vivo (3D) y esferoides derivados de células madre.

Resumen

Los esferoides tumorales multicelulares son un modelo popular de microagregados de tejidos en 3D para reproducir el microambiente tumoral, probar y optimizar terapias farmacológicas y utilizar biosensores y nanosensores en un contexto 3D. Su facilidad de producción, tamaño predecible, crecimiento y gradientes de nutrientes y metabolitos observados son importantes para recapitular el microambiente celular de nicho en 3D. Sin embargo, la heterogeneidad de los esferoides y la variabilidad de sus métodos de producción pueden influir en el metabolismo celular general, la viabilidad y la respuesta a los fármacos. Esto dificulta la elección de la metodología más adecuada, teniendo en cuenta los requisitos en tamaño, variabilidad, necesidades de biofabricación y uso como modelos de tejidos 3D in vitro en biología de células madre y cancerosas. En particular, la producción de esferoides puede influir en su compatibilidad con microscopías cuantitativas en vivo, como las imágenes metabólicas ópticas, la microscopía de imágenes de fluorescencia durante toda la vida útil (FLIM), el seguimiento de la hipoxia de esferoide con nanosensores o la viabilidad. Aquí, se presentan una serie de protocolos convencionales de formación de esferoides, destacando su compatibilidad con las microscopías vivas de campo amplio, confocales y de dos fotones. También se presenta la línea de imágenes de seguimiento para análisis con FLIM de autofluorescencia multiplexada y, utilizando varios tipos de esferoides de células madre y cáncer.

Introducción

Los esferoides multicelulares representan un grupo de modelos de tejidos en 3D obtenidos por la autoagregación de células y que presentan una forma esférica. Son ampliamente utilizados para imitar la interacción célula-célula y célula-matriz in vitro y para reproducir un contexto 3D dentro de una multitud de construcciones derivadas del cáncer y las células madre. Se emplean varias técnicas para reducir la adhesión celular y promover la agregación. Estos incluyen el método de caída colgante que se basa en la tensión superficial¹; métodos de repelencia de la fijación de células, como placas de fijación ultrabajas, micromoldes y micropoc....

Protocolo

1. Generación de esferoides multicelulares

1. Cultivo celular
   NOTA: Los cultivos celulares se pueden recolectar de la American Type Culture Collection (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich u otros proveedores. ATCC proporciona toda la información de manejo requerida, incluidos los medios de crecimiento preferidos, los procedimientos de subcultivo, el nivel de bioseguridad, la tasa de crecimiento y los perfiles STR. En este caso, se utilizan 500 células/esferoide de la línea celular HCT116 de cáncer de colon humano en los medios 5A de McCoy (VWR, 392-0420) suplementados con un 10% de FBS y 1 mM de piruvato de sodio. Para experimentos a largo plazo que....

Discusión

Los esferoides multicelulares se están convirtiendo en un método de elección en los estudios de microentornos de nicho tumorales y de células madre, el descubrimiento de fármacos y el desarrollo de los "bloques de construcción de tejidos" para la biofabricación. La arquitectura interna heterogénea de los esferoides, los gradientes de nutrientes y la oxigenación pueden imitar los de los tejidos y tumores in vivo en un entorno relativamente simplificado y accesible. Con la necesidad de una mayor transpare.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Also available from Sigma
10 mL serological pipets	VWR	612-3700	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
12 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	665-180	Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable	Ibidi	81201	Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes	Nerbe plus	02-502-3001	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3D Petri Dish micromolds	Microtissue	Z764000-6EA
6 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	657160	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
70% ethanol	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation
Calcein Green-AM	Tebubio	AS-89201	Apply in dilution 1:1000
CellSens Dimension software	Olympus	version 3
Collagen from human placenta, type IV	Sigma	C5533	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Confocal FLIM Microscope	Leica Microsystems	N/A	Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective
D(+)-Glucose	Merck	8342	Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	For preparation of imaging medium
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-098	Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Human colon cancer cells HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	version 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	version 4.6.1.27508
L-glutamine	Gibco	25030	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES	VWR	392-0420	Standard growth medium for HCT116 cells
micro-patterned 3D-printed PDMS stamps	N/A	N/A	Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Neubauer couting chamber	Fisher Scientific	15980396
O2 probes: MMIR1	N/A	N/A	Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution	Gibco	15140-122	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5mg	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	25535-16-4	Cell death staining, use 1 µg/mL at 1h incubation
PVDF syringe filter 0.22 µm	Novolab	A35149	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SphericalPlate 5D 24-well	Kugelmeiers	SP5D-24W
sterile petridish	Greiner bio-one	633181	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (25 cm² )	VWR	734-2311	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (75 cm²)	VWR	734-2313	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
U-bottom 96-well plate	VWR	10062-900	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope	Olympus	N/A	Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water