Производство и многопараметрическая флуоресцентная флуоресцентная микроскопия живых клеток (FLIM) многоклеточных сфероидов

Резюме

В данной статье мы описываем различные методы формирования многоклеточных сфероидов для проведения последующей многопараметрической микроскопии живых клеток. С помощью флуоресцентной микроскопии с визуализацией в течение жизни (FLIM), клеточной автофлуоресценции, окрашивания красителей и наночастиц продемонстрирован подход к анализу клеточного метаболизма, гипоксии и гибели клеток в живом трехмерном (3D) раке и сфероидах, полученных из стволовых клеток.

Аннотация

Сфероиды многоклеточных опухолей являются популярной 3D-моделью микроагрегата тканей для воспроизведения микроокружения опухоли, тестирования и оптимизации медикаментозной терапии, а также использования био- и наносенсоров в 3D-контексте. Простота их производства, предсказуемый размер, рост и наблюдаемые градиенты питательных веществ и метаболитов важны для повторения 3D-нишевого клеточного микроокружения. Тем не менее, гетерогенность сфероидов и вариабельность методов их производства могут влиять на общий клеточный метаболизм, жизнеспособность и реакцию на лекарственные препараты. Это затрудняет выбор наиболее подходящей методологии с учетом требований к размеру, вариабельности, потребностям биопроизводства и использованию в качестве 3D-моделей тканей in vitro в биологии стволовых и раковых клеток. В частности, производство сфероидов может влиять на их совместимость с количественными микроскопиями в реальном времени, такими как оптическая метаболическая визуализация, флуоресцентная микроскопия в течение жизни (FLIM), мониторинг гипоксии сфероидов с помощью наносенсоров или жизнеспособность. Здесь представлен ряд традиционных протоколов формирования сфероидов, подчеркивающих их совместимость с широкоугольной, конфокальной и двухфотонной микроскопией в реальном времени. Также представлен конвейер последующей визуализации для анализа с помощью мультиплексного автофлуоресцентного FLIM и с использованием различных типов сфероидов рака и стволовых клеток.

Введение

Многоклеточные сфероиды представляют собой группу трехмерных моделей тканей, полученных путем самоагрегации клеток и имеющих сферическую форму. Они широко используются для имитации межклеточного взаимодействия и межклеточного матриксного взаимодействия in vitro и для воспроизведения 3D-контекста во множестве конструкций, полученных из раковых и стволовых клеток. Для уменьшения прикрепления клеток и стимулирования агрегации используется несколько методов. К ним относятся метод висячих капель, основанный на поверхностном натяжении¹; методы отталкивания клеточных пластин, такие как пластины со сверхнизким прикреплением, микроформы и микро....

протокол

1. Генерация многоклеточных сфероидов

1. Культура клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные культуры могут быть собраны из American Type Culture Collection (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich или других поставщиков. ATCC предоставляет всю необходимую информацию по обращению, включая предпочтительные питательные среды, процедуры субкультивирования, уровень биобезопасности, скорость роста и профили STR. Здесь 500 клеток/сфероид клеточной линии рака толстой кишки человека HCT116 используется в среде McCoy's 5A (VWR, 392-0420) с добавлением 10% FBS и 1 мМ пирувата натрия. Для долгосрочных экспериментов, которые контролируются ежедневно, в среду можно добавлять 10 м....

Результаты

Выбор подходящего способа формирования сфероида
Выбранный метод формирования сфероидов может существенно влиять на размер, форму, плотность клеток, жизнеспособность и чувствительность к лекарственным препаратам (рис. 2). Ранее сравнивали влияние нескольких.......

Обсуждение

Многоклеточные сфероиды становятся предпочтительным методом в изучении микроокружения опухолей и стволовых клеток, открытии лекарств и разработке «тканевых строительных блоков» для биопроизводства. Гетерогенная внутренняя архитектура, градиенты питательных веществ и оксигенации .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Also available from Sigma
10 mL serological pipets	VWR	612-3700	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
12 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	665-180	Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable	Ibidi	81201	Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes	Nerbe plus	02-502-3001	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3D Petri Dish micromolds	Microtissue	Z764000-6EA
6 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	657160	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
70% ethanol	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation
Calcein Green-AM	Tebubio	AS-89201	Apply in dilution 1:1000
CellSens Dimension software	Olympus	version 3
Collagen from human placenta, type IV	Sigma	C5533	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Confocal FLIM Microscope	Leica Microsystems	N/A	Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective
D(+)-Glucose	Merck	8342	Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	For preparation of imaging medium
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-098	Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Human colon cancer cells HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	version 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	version 4.6.1.27508
L-glutamine	Gibco	25030	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES	VWR	392-0420	Standard growth medium for HCT116 cells
micro-patterned 3D-printed PDMS stamps	N/A	N/A	Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Neubauer couting chamber	Fisher Scientific	15980396
O2 probes: MMIR1	N/A	N/A	Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution	Gibco	15140-122	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5mg	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	25535-16-4	Cell death staining, use 1 µg/mL at 1h incubation
PVDF syringe filter 0.22 µm	Novolab	A35149	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SphericalPlate 5D 24-well	Kugelmeiers	SP5D-24W
sterile petridish	Greiner bio-one	633181	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (25 cm² )	VWR	734-2311	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (75 cm²)	VWR	734-2313	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
U-bottom 96-well plate	VWR	10062-900	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope	Olympus	N/A	Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water