Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden

Zusammenfassung

In diesem Artikel beschreiben wir verschiedene Methoden zur Bildung von multizellulären Sphäroiden, um eine anschließende Multiparameter-Lebendzellmikroskopie durchzuführen. Unter Verwendung von Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM), zellulärer Autofluoreszenz, Färbefarbstoffen und Nanopartikeln wird der Ansatz zur Analyse des Zellstoffwechsels, der Hypoxie und des Zelltods bei lebenden dreidimensionalen (3D) Krebs- und Stammzell-abgeleiteten Sphäroiden demonstriert.

Zusammenfassung

Multizelluläre Tumor-Sphäroide sind ein beliebtes 3D-Gewebe-Mikroaggregatmodell für die Reproduktion von Tumormikroumgebungen, die Erprobung und Optimierung von Arzneimitteltherapien und den Einsatz von Bio- und Nanosensoren im 3D-Kontext. Ihre einfache Produktion, ihre vorhersehbare Größe, ihr Wachstum und ihre beobachteten Nährstoff- und Metabolitengradienten sind wichtig, um die 3D-nischenartige Zellmikroumgebung zu rekapitulieren. Die Heterogenität der Sphäroide und die Variabilität ihrer Produktionsmethoden können jedoch den gesamten Zellstoffwechsel, die Lebensfähigkeit und das Ansprechen auf das Arzneimittel beeinflussen. Dies macht es schwierig, die am besten geeignete Methodik zu wählen, wenn man die Anforderungen an Größe, Variabilität, Anforderungen an die Biofabrikation und die Verwendung als In-vitro-3D-Gewebemodelle in der Stamm- und Krebszellbiologie berücksichtigt. Insbesondere kann die Sphäroidproduktion ihre Kompatibilität mit quantitativen Lebendmikroskopien beeinflussen, wie z. B. optische metabolische Bildgebung, Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM), Überwachung der Sphäroidhypoxie mit Nanosensoren oder Viabilität. Hier wird eine Reihe konventioneller Protokolle zur Sphäroidbildung vorgestellt, die ihre Kompatibilität mit der Live-Weitfeld-, Konfokal- und Zwei-Photonen-Mikroskopie hervorheben. Die Follow-up-Bildgebung zur Analysepipeline mit Multiplex-Autofluoreszenz FLIM und unter Verwendung verschiedener Krebsarten und Stammzell-Sphäroide wird ebenfalls vorgestellt.

Einleitung

Mehrzellige Sphäroide stellen eine Gruppe von 3D-Gewebemodellen dar, die durch die Selbstaggregation von Zellen erhalten werden und eine kugelförmige Form aufweisen. Sie werden häufig verwendet, um Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen in vitro nachzuahmen und einen 3D-Kontext in einer Vielzahl von Krebs- und Stammzell-abgeleiteten Konstrukten zu reproduzieren. Es werden verschiedene Techniken eingesetzt, um die Zelladhäsion zu reduzieren und die Aggregation zu fördern. Dazu gehören das Hanging-Drop-Verfahren, das sich auf die Oberflächenspannung¹ stützt; Methoden zur Abwehr von Zellanhaftungen, wie z. B. Platten mit extrem geringer....

Protokoll

1. Erzeugung von mehrzelligen Sphäroiden

1. Zellkultur
   HINWEIS: Zellkulturen können von der American Type Culture Collection (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich oder anderen Anbietern entnommen werden. ATCC bietet alle erforderlichen Informationen zur Handhabung, einschließlich bevorzugter Wachstumsmedien, Subkulturverfahren, Biosicherheitsniveau, Wachstumsrate und STR-Profile. Hier werden 500 Zellen/Sphäroid der humanen Dickdarmkrebs-Zelllinie HCT116 in McCoy's 5A-Medien (VWR, 392-0420) verwendet, ergänzt mit 10% FBS und 1 mM Natriumpyruvat. Für Langzeitexperimente, die täglich überwacht werden, können dem Medium 10 mM HEPES, pH 7,2 zugesetzt werd....

Diskussion

Multizelluläre Sphäroide werden zu einer Methode der Wahl bei der Untersuchung von Tumor- und Stammzell-Nischenmikroumgebungen, der Arzneimittelforschung und der Entwicklung der "Gewebebausteine" für die Biofabrikation. Die heterogene innere Architektur der Sphäroide, die Gradienten der Nährstoffe und die Sauerstoffversorgung können die von in vivo-Geweben und Tumoren in einer relativ vereinfachten und zugänglichen Umgebung nachahmen. Mit dem Bedarf an mehr methodischer Transparenz.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Also available from Sigma
10 mL serological pipets	VWR	612-3700	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
12 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	665-180	Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable	Ibidi	81201	Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes	Nerbe plus	02-502-3001	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3D Petri Dish micromolds	Microtissue	Z764000-6EA
6 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	657160	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
70% ethanol	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation
Calcein Green-AM	Tebubio	AS-89201	Apply in dilution 1:1000
CellSens Dimension software	Olympus	version 3
Collagen from human placenta, type IV	Sigma	C5533	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Confocal FLIM Microscope	Leica Microsystems	N/A	Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective
D(+)-Glucose	Merck	8342	Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	For preparation of imaging medium
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-098	Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Human colon cancer cells HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	version 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	version 4.6.1.27508
L-glutamine	Gibco	25030	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES	VWR	392-0420	Standard growth medium for HCT116 cells
micro-patterned 3D-printed PDMS stamps	N/A	N/A	Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Neubauer couting chamber	Fisher Scientific	15980396
O2 probes: MMIR1	N/A	N/A	Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution	Gibco	15140-122	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5mg	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	25535-16-4	Cell death staining, use 1 µg/mL at 1h incubation
PVDF syringe filter 0.22 µm	Novolab	A35149	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SphericalPlate 5D 24-well	Kugelmeiers	SP5D-24W
sterile petridish	Greiner bio-one	633181	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (25 cm² )	VWR	734-2311	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (75 cm²)	VWR	734-2313	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
U-bottom 96-well plate	VWR	10062-900	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope	Olympus	N/A	Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water