多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

要約

ここでは、フォローアップのマルチパラメーター生細胞顕微鏡検査を実施するためのさまざまな多細胞スフェロイド形成方法について説明します。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、細胞自家蛍光、染色色素、およびナノ粒子を使用して、生きた三次元(3D)がんおよび幹細胞由来スフェロイドにおける細胞代謝、低酸素症、および細胞死の解析のためのアプローチを実証します。

要約

多細胞腫瘍スフェロイドは、腫瘍の微小環境を再現し、薬物療法を試験および最適化し、3Dコンテキストでバイオセンサーとナノセンサーを使用するための一般的な3D組織微小凝集体モデルです。それらの生産の容易さ、予測可能なサイズ、成長、および観察された栄養素と代謝物の勾配は、3Dニッチのような細胞微小環境を再現するために重要です。しかし、スフェロイドの不均一性やその作製方法のばらつきは、細胞全体の代謝、生存率、薬物応答に影響を与える可能性があります。そのため、サイズ、ばらつき、バイオファブリケーションのニーズ、幹細胞生物学やがん細胞生物学における in vitro 3D組織モデルとしての使用など、最適な方法論を選択することは困難です。特に、スフェロイドの産生は、光学代謝イメージング、蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、ナノセンサーによるスフェロイド低酸素症のモニタリング、生存率などの定量的生顕微鏡との適合性に影響を与える可能性があります。ここでは、従来のスフェロイド形成プロトコルをいくつか紹介し、生体広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡、および2光子顕微鏡との適合性を強調しています。マルチプレックス自家蛍光FLIMを使用した、さまざまな種類のがんおよび幹細胞スフェロイドを使用した解析パイプラインへのフォローアップイメージングも紹介します。

概要

多細胞スフェロイドは、細胞の自己凝集によって取得され、球形を示す3D組織モデルのグループを表します。これらは、in vitroで細胞間および細胞とマトリックスの相互作用を模倣し、多数のがんおよび幹細胞由来のコンストラクト内で3Dコンテキストを再現するために広く使用されています。細胞の付着を減らし、凝集を促進するために、いくつかの技術が採用されています。これらには、表面張力¹に依存する吊り下げ式が含まれます。超低付着プレート、マイクロモールド、マイクロウェルなどの細胞付着をはじく方法^2,3;音波ベースのアプローチ⁴;流動誘起凝集法(スピナーフラスコ、バイオリアクター、マイクロ流体デバイス)⁵;磁性粒子支援形成⁶と凝集促進合成およびECMベースのマトリックスおよび足場の使用^7,8,9。

癌の研究、開発、および新薬療法の検証において、スフェロイドは、栄養素、老廃物、およびO<....

プロトコル

1. 多細胞スフェロイドの作製

1. 細胞培養
   注:細胞培養は、American Type Culture Collection(ATCC)、Lonza、Sigma-Aldrich、またはその他のベンダーから収集できます。ATCCは、優先増殖培地、継代培養手順、バイオセーフティレベル、成長率、STRプロファイルなど、必要なすべての取り扱い情報を提供します。ここでは、ヒト結腸癌細胞株HCT116の500細胞/スフェロイドを、10%FBSと1mMピルビン酸ナトリウムを添加したMcCoyの5A培地(VWR、392-0420)に使用しています。毎日モニタリングする長期実験では、10 mM HEPES、pH 7.2を培地に添加できます。
   1. 細胞培養を70%〜90%のコンフルエント度に達するように増殖させます。
   2. 予熱(37°C)滅菌PBS(25 cm² の場合は5 mL、フラスコ75 cm² あたり10 mL)で細胞をすすぎます。
   3. 0.05%トリプシン-1 mM EDTA溶液(25 cm²の場合は0.5 mL、フラスコ75 cm² フラスコあたり1 mL)を添加し、5%_CO2、湿度95%の37°Cで5〜10分間インキュベートして細胞剥離に到達します。
      注:透過光(明視野)顕微鏡下で細胞の剥離を制御します。解離酵素溶液への細胞の過剰曝露は、細胞....

結果

適切なスフェロイド形成法の選択
選択したスフェロイド形成法は、スフェロイドのサイズ、形状、細胞密度、生存率、および薬剤感受性に大きく影響します(図2)。以前は、複数のハイスループット(SphericalPlate 5D、ラボ製マイクロモールド、およびMicroTissueモールド)と「中スループット」の低アタッチメント(BiofloatおよびLipidureコーティングされた96ウェル.......

ディスカッション

多細胞スフェロイドは、腫瘍および幹細胞ニッチ微小環境の研究、創薬、およびバイオファブリケーションのための「組織ビルディングブロック」の開発において選択される方法になりつつあります。スフェロイドの不均一な内部構造、栄養素の勾配、および酸素化は、比較的単純化されたアクセス可能な環境で、in vivo組織や腫瘍のそれらを模倣することができます。方法論の透明性.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Also available from Sigma
10 mL serological pipets	VWR	612-3700	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
12 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	665-180	Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable	Ibidi	81201	Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes	Nerbe plus	02-502-3001	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3D Petri Dish micromolds	Microtissue	Z764000-6EA
6 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	657160	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
70% ethanol	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation
Calcein Green-AM	Tebubio	AS-89201	Apply in dilution 1:1000
CellSens Dimension software	Olympus	version 3
Collagen from human placenta, type IV	Sigma	C5533	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Confocal FLIM Microscope	Leica Microsystems	N/A	Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective
D(+)-Glucose	Merck	8342	Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	For preparation of imaging medium
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-098	Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Human colon cancer cells HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	version 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	version 4.6.1.27508
L-glutamine	Gibco	25030	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES	VWR	392-0420	Standard growth medium for HCT116 cells
micro-patterned 3D-printed PDMS stamps	N/A	N/A	Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Neubauer couting chamber	Fisher Scientific	15980396
O2 probes: MMIR1	N/A	N/A	Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution	Gibco	15140-122	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5mg	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	25535-16-4	Cell death staining, use 1 µg/mL at 1h incubation
PVDF syringe filter 0.22 µm	Novolab	A35149	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SphericalPlate 5D 24-well	Kugelmeiers	SP5D-24W
sterile petridish	Greiner bio-one	633181	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (25 cm² )	VWR	734-2311	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (75 cm²)	VWR	734-2313	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
U-bottom 96-well plate	VWR	10062-900	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope	Olympus	N/A	Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water