Production et microscopie imageuse à vie multiparamètre en fluorescence de cellules vivantes (FLIM) de sphéroïdes multicellulaires

Résumé

Ici, nous décrivons différentes méthodes de formation de sphéroïdes multicellulaires pour effectuer une microscopie multiparamètre de suivi sur cellules vivantes. À l’aide de la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM), de l’autofluorescence cellulaire, des colorants de coloration et des nanoparticules, l’approche d’analyse du métabolisme cellulaire, de l’hypoxie et de la mort cellulaire dans le cancer tridimensionnel vivant (3D) et les sphéroïdes dérivés de cellules souches est démontrée.

Résumé

Les sphéroïdes tumoraux multicellulaires sont un modèle 3D populaire de microagrégats tissulaires pour reproduire le microenvironnement tumoral, tester et optimiser les thérapies médicamenteuses et utiliser des biocapteurs et des nanocapteurs dans un contexte 3D. Leur facilité de production, leur taille prévisible, leur croissance et les gradients de nutriments et de métabolites observés sont importants pour récapituler le microenvironnement cellulaire de type niche 3D. Cependant, l’hétérogénéité des sphéroïdes et la variabilité de leurs méthodes de production peuvent influencer le métabolisme cellulaire global, la viabilité et la réponse aux médicaments. Il est donc difficile de choisir la méthodologie la plus appropriée, compte tenu des exigences en termes de taille, de variabilité, de besoins de biofabrication et d’utilisation comme modèles tissulaires 3D in vitro en biologie des cellules souches et cancéreuses. En particulier, la production de sphéroïdes peut influencer leur compatibilité avec les microscopies quantitatives en direct, telles que l’imagerie métabolique optique, la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM), la surveillance de l’hypoxie sphéroïde avec des nanocapteurs ou la viabilité. Ici, un certain nombre de protocoles conventionnels de formation de sphéroïdes sont présentés, mettant en évidence leur compatibilité avec la microscopie à grand champ en direct, confocale et à deux photons. Le pipeline d’imagerie de suivi à l’analyse avec l’autofluorescence multiplexée FLIM et, en utilisant divers types de cancer et de sphéroïdes de cellules souches, est également présenté.

Introduction

Les sphéroïdes multicellulaires représentent un groupe de modèles tissulaires 3D obtenus par l’auto-agrégation de cellules et présentant une forme sphérique. Ils sont largement utilisés pour imiter l’interaction cellule-cellule et cellule-matrice in vitro et pour reproduire un contexte 3D dans une multitude de constructions dérivées du cancer et des cellules souches. Plusieurs techniques sont employées pour réduire l’attachement cellulaire et favoriser l’agrégation. Il s’agit notamment de la méthode de la suspension et de la chute reposant sur la tension superficielle¹ ; méthodes de repoussée de fixation des cellules telles que les pla....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Génération de sphéroïdes multicellulaires

1. Culture cellulaire
   REMARQUE : Les cultures cellulaires peuvent être collectées auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC), de Lonza, de Sigma-Aldrich ou d’autres fournisseurs. L’ATCC fournit tous les renseignements nécessaires à la manipulation, y compris les milieux de croissance préférés, les procédures de sous-culture, le niveau de biosécurité, le taux de croissance et les profils STR. Ici, 500 cellules/sphéroïde de la lignée cellulaire HCT116 du cancer du côlon humain sont utilisés dans le milieu 5A de McCoy (VWR, 392-0420) complété par 10 % de FBS et 1 mM de pyruvate de sodium. Po....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Choisir la méthode de formation de sphéroïde appropriée
La méthode de formation des sphéroïdes choisie peut grandement influencer la taille, la forme, la densité cellulaire, la viabilité et la sensibilité aux médicaments des sphéroïdes (Figure 2). Auparavant, les effets de plusieurs méthodes à haut débit (SphericalPlate 5D, micromoules fabriqués en laboratoire et moules MicroTissue) et à faible fixation à « débit moyen » (plaques à 96 puits revêtue.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Les sphéroïdes multicellulaires deviennent une méthode de choix dans l’étude des microenvironnements de niche des tumeurs et des cellules souches, la découverte de médicaments et le développement des « éléments constitutifs tissulaires » pour la biofabrication. L’architecture interne hétérogène des sphéroïdes, les gradients de nutriments et l’oxygénation peuvent imiter ceux des tissus et des tumeurs in vivo dans un cadre relativement simplifié et accessible. Avec la nécessité d’une .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Also available from Sigma
10 mL serological pipets	VWR	612-3700	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
12 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	665-180	Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable	Ibidi	81201	Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes	Nerbe plus	02-502-3001	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3D Petri Dish micromolds	Microtissue	Z764000-6EA
6 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	657160	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
70% ethanol	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation
Calcein Green-AM	Tebubio	AS-89201	Apply in dilution 1:1000
CellSens Dimension software	Olympus	version 3
Collagen from human placenta, type IV	Sigma	C5533	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Confocal FLIM Microscope	Leica Microsystems	N/A	Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective
D(+)-Glucose	Merck	8342	Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	For preparation of imaging medium
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-098	Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Human colon cancer cells HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	version 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	version 4.6.1.27508
L-glutamine	Gibco	25030	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES	VWR	392-0420	Standard growth medium for HCT116 cells
micro-patterned 3D-printed PDMS stamps	N/A	N/A	Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Neubauer couting chamber	Fisher Scientific	15980396
O2 probes: MMIR1	N/A	N/A	Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution	Gibco	15140-122	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5mg	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	25535-16-4	Cell death staining, use 1 µg/mL at 1h incubation
PVDF syringe filter 0.22 µm	Novolab	A35149	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SphericalPlate 5D 24-well	Kugelmeiers	SP5D-24W
sterile petridish	Greiner bio-one	633181	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (25 cm² )	VWR	734-2311	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (75 cm²)	VWR	734-2313	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
U-bottom 96-well plate	VWR	10062-900	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope	Olympus	N/A	Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water