Production et microscopie imageuse à vie multiparamètre en fluorescence de cellules vivantes (FLIM) de sphéroïdes multicellulaires

Résumé

Ici, nous décrivons différentes méthodes de formation de sphéroïdes multicellulaires pour effectuer une microscopie multiparamètre de suivi sur cellules vivantes. À l’aide de la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM), de l’autofluorescence cellulaire, des colorants de coloration et des nanoparticules, l’approche d’analyse du métabolisme cellulaire, de l’hypoxie et de la mort cellulaire dans le cancer tridimensionnel vivant (3D) et les sphéroïdes dérivés de cellules souches est démontrée.

Résumé

Les sphéroïdes tumoraux multicellulaires sont un modèle 3D populaire de microagrégats tissulaires pour reproduire le microenvironnement tumoral, tester et optimiser les thérapies médicamenteuses et utiliser des biocapteurs et des nanocapteurs dans un contexte 3D. Leur facilité de production, leur taille prévisible, leur croissance et les gradients de nutriments et de métabolites observés sont importants pour récapituler le microenvironnement cellulaire de type niche 3D. Cependant, l’hétérogénéité des sphéroïdes et la variabilité de leurs méthodes de production peuvent influencer le métabolisme cellulaire global, la viabilité et la réponse aux médicaments. Il est donc difficile de choisir la méthodologie la plus appropriée, compte tenu des exigences en termes de taille, de variabilité, de besoins de biofabrication et d’utilisation comme modèles tissulaires 3D in vitro en biologie des cellules souches et cancéreuses. En particulier, la production de sphéroïdes peut influencer leur compatibilité avec les microscopies quantitatives en direct, telles que l’imagerie métabolique optique, la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM), la surveillance de l’hypoxie sphéroïde avec des nanocapteurs ou la viabilité. Ici, un certain nombre de protocoles conventionnels de formation de sphéroïdes sont présentés, mettant en évidence leur compatibilité avec la microscopie à grand champ en direct, confocale et à deux photons. Le pipeline d’imagerie de suivi à l’analyse avec l’autofluorescence multiplexée FLIM et, en utilisant divers types de cancer et de sphéroïdes de cellules souches, est également présenté.

Introduction

Les sphéroïdes multicellulaires représentent un groupe de modèles tissulaires 3D obtenus par l’auto-agrégation de cellules et présentant une forme sphérique. Ils sont largement utilisés pour imiter l’interaction cellule-cellule et cellule-matrice in vitro et pour reproduire un contexte 3D dans une multitude de constructions dérivées du cancer et des cellules souches. Plusieurs techniques sont employées pour réduire l’attachement cellulaire et favoriser l’agrégation. Il s’agit notamment de la méthode de la suspension et de la chute reposant sur la tension superficielle¹ ; méthodes de repoussée de fixation des cellules telles que les plaques de fixation ultra-faibles, les micro-moules et les micropuits ^2,3 ; approche basée sur les ondes acoustiques⁴ ; méthodes d’agrégation induites par l’écoulement (fioles tournantes, bioréacteur et dispositifs microfluidiques)⁵ ; formation assistée par particules magnétiques⁶ et utilisation des matrices et échafaudages synthétiques et ECM favorisant l’agrégation ^7,8,9.

Dans la recherche sur le cancer, le développement et la validation de nouvelles thérapies médicamenteuses, les sphéroïdes sont un modèle attrayant en raison de leur capacité à récapituler les gradients limités par la diffusion spatiale des nutriments, des déchets et de l’O₂, conduisant souvent à la formation d’un noyau nécrotique, typique des tumeurs solides^10,11. Ces modèles in vitro plus fiables et plus sophistiqués remettent en question la nécessité d’une utilisation intensive de modèles animaux (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.0¹²), conformément au principe des 3R de la recherche animale (remplacement, réduction et raffinement). En plus du cancer, les sphéroïdes trouvent leur application dans la recherche sur les cellules souches. Par exemple, les cellules souches pluripotentes ont la capacité de former des corps embryoïdes (EB), qui peuvent être utilisés pour la différenciation des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) vers des types de cellules spécialisés difficiles à obtenir directement des patients, tels que les cellules précurseurs neurales¹³ ou les cellules de la granulosa ovarienne ^13,14. De plus, la formation d’une EB est souvent la première étape dans le développement de modèles organoïdes plus complexes, par exemple, neural¹⁵, rétinien¹⁶, cardiaque¹⁷, foie¹⁸, estomac¹⁹ et organoïdes intestinaux²⁰. Des facteurs tels que la taille, la reproductibilité, le débit et les applications en aval doivent être pris en compte lors du choix d’une méthode de formation de sphéroïdes appropriée pour les expériences.

La complexité accrue de la culture 3D peut entraîner une plus grande variabilité par rapport à la culture 2D. Des facteurs tels que la composition nutritionnelle²¹, l’évaporation du milieu²², la viscosité²³, le contrôle du pH²⁴, la méthode de formation des sphéroïdes et même le temps passé dans la culture^25,26 peuvent entraîner l’obtention de sphéroïdes de morphologie, de taille, de viabilité et de chimiorésistance différentes^27,28. Des recherches récentes ont démontré que les gradients d’oxygène sphéroïdes ne sont pas toujours statiques et sont affectés par la méthode de formation, la taille du sphéroïde et la viscosité extracellulaire, affectant l’hétérogénéité des sphéroïdes²⁹. Pour améliorer la reproductibilité et l’accessibilité des données sur les sphéroïdes, la base de connaissances MISpheroID a été développée²⁶, identifiant la lignée cellulaire, le milieu de culture, la méthode de formation et la taille des sphéroïdes comme les informations minimales pour un résultat reproductible. Par conséquent, une comparaison détaillée a été effectuée de plusieurs méthodes à haut débit (SphericalPlate 5D, micromoules fabriqués en laboratoire et moules à microtissus) et à faible fixation (c’est-à-dire des plaques à 96 puits recouvertes de Biofloat et de Lipidure, à la fois sans échafaudage et à base d’échafaudage) (figure 1 et tableau 1), y compris la taille du puits (compte tenu d’une estimation de la taille maximale des sphéroïdes), les consommables utilisés, le temps de préparation et la possibilité de surveiller les sphéroïdes sans les transporter vers des boîtes de microscopie. Ce dernier permet des études à long terme, tandis que les sphéroïdes produits avec des méthodes à haut débit aboutissent souvent à des expériences finales. Toutes les méthodes, à l’exception des grilles de la 5DspheriPlate, n’apportent pas d’autofluorescence indésirable, ce qui permet leur utilisation directe en microscopie.

Figure 1 : Explication des méthodes de formation des sphéroïdes. Des méthodes à haut débit telles que la SphericalPlate 5D, qui a intégré des micropuits brevetés dans la plaque, tandis que les micromoules produits en laboratoire et les moules MicroTissue utilisent des tampons pour fabriquer plusieurs micropuits en agarose (bleu). Les plaques à faible fixation telles que Lipidure (Amsbio) et Biofloat (Sarstedt) utilisent un revêtement non adhérent inhibant l’adhésion à la surface cellulaire et favorisant l’auto-agrégation cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

	5D SpheriPlate	Micromoules auto-produits	Microtissus	Méthodes de fixation faibles
Nombre de sphéroïdes/puits	750	1589	81	1
Diamètre puits	90 μm	400 μm	800 μm	1 millimètre
Volume de culture	1 mL	5 mL	1 mL	200 μL
Autres consommables	/	7 mL d’agarose à 3 %	500 μL d’agarose à 2 %	/ *
Temps de préparation	Durée : 10 minutes	2 h + 3 jours d’adaptation des médias	0,5 h + 15 min d’adaptation du support	10 à 30 min + 1 h de séchage
Surveillance	Oui	Non**	Oui	Oui
Autofluorescent	Oui	Non	Non	Non
Réutilisable	Non	Oui	Oui	Non**
Coût	€€	€	€€€€	€€€€ : Enrobage et Matrigel
				€€ : Plaque commerciale 96 puits
*Certaines lignées cellulaires nécessitent l’ajout d’ECM (c’est-à-dire 2 à 5 % de Matrigel) pour former des sphéroïdes compacts.
**Le revêtement est réutilisable jusqu’à ce qu’il soit épuisé. Cependant, chaque plaque consommera une petite quantité de média et la poussière peut s’accumuler au fil du temps. Une stérilisation par filtre est régulièrement nécessaire.

Tableau 1 : Comparaison de plusieurs méthodes de formation de sphéroïdes²⁹. « Monitoring » : la possibilité de surveiller les sphéroïdes sans avoir besoin de les transférer dans une boîte de microscopie. € : 0-50€, €€ : 50-150€ , €€€ : 150-500€ , €€€€ : >500€

La microscopie à fluorescence permet de surveiller directement les principaux aspects biologiques des sphéroïdes, notamment la mort cellulaire, la viabilité, la prolifération, le métabolisme, la viscosité et même les propriétés mécaniques³⁰. La microscopie imageuse à durée de vie de fluorescence (FLIM) apporte une dimension quantitative supplémentaire pour l’étude des interactions des sondes fluorescentes au sein de leur (micro)environnement 31,32,33,34, permettant de résoudre les spectres d’émission qui se chevauchent en fonction de différentes durées d’émission ^35,36 et sonder le métabolisme cellulaire basé sur l’autofluorescence cellulaire intrinsèque. Ainsi, des composés cellulaires autofluorescents aussi répandus que le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NAD(P)H), la flavine mononucléotide (FMN), la flavine adénine dinucléotide (FAD), la protoporphyrine IX et d’autres peuvent être mesurés avec un FLIM à un ou deux photons et servent de « capteurs » intrinsèques du catabolisme du glucose, de la phosphorylation oxydative (OxPhos) et fournissent un aperçu général de l’état redox cellulaire. Le NAD(P)H existe sous forme cytoplasmique libre ou sous forme mitochondriale liée aux protéines^37,38. De même, l’état oxydé du FAD est fluorescent avec une durée de vie plus longue de la forme libre. Les microscopies NAD(P)H et FAD impliquent généralement une FLIM excitée par deux photons, visant à prévenir les photodommages de l’échantillon³⁹. Souvent, l’imagerie métabolique optique FLIM peut être combinée à l’utilisation de sondes à base de colorants, de biocapteurs génétiquement codés, de microscopie d’imagerie à durée de vie de phosphorescence (PLIM) et de mesures basées sur l’intensité ratiométrique afin de fournir une image plus complète du métabolisme, de l’oxygénation, de la prolifération et de la viabilité cellulaire^des sphéroïdes ou des organoïdes 29,30,31 . De plus, FLIM peut également être combiné avec la méthode de transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) pour mesurer la variation de la durée de vie du fluorophore donneur lorsqu’il est en contact étroit avec l’accepteur afin d’étudier la liaison d’un médicament avec son domaine cible 33,40,41.

Les images FLIM acquises sont généralement analysées pour calculer la durée de vie pixel par pixel. À l’heure actuelle, il existe au moins 3 stratégies courantes utilisées pour obtenir la durée de vie de la fluorescence : le « FLIM rapide » semi-quantitatif ⁴² (parfois appelé « sens tau »^43,44), l’ajustement de la courbe de décroissance, en utilisant un ajustement à une, deux ou trois exponentielles, et l’approche « sans ajustement » avec transformation de phase et analyse du tracé de phase. Selon le fournisseur, des logiciels fournis (LAS X, Symphotime, SPCImage, etc.) ou open source (par exemple, FLIMfit⁴⁵, FLIMJ⁴⁶ ou autres⁴⁷) peuvent être utilisés pour traiter les données FLIM mesurées. En règle générale, les logiciels fournis par le fournisseur sont utiles pour l’analyse préliminaire des données, tandis que les solutions open source peuvent fournir des études plus précises en utilisant, par exemple, des diagrammes de phaseur et la visualisation 3D.

Malgré l’utilité et l’attrait de FLIM en tant que méthode d’étude des sphéroïdes, très peu de protocoles expérimentaux sont disponibles, et il y a un manque général de connaissances dans le choix de la méthode de formation la plus appropriée pour des expériences de microscopie multiparamétrique en direct réussies impliquant FLIM. Ici, une comparaison détaillée des protocoles de formation de sphéroïdes couramment utilisés est présentée en fonction de leur morphologie, de leur viabilité et de leur oxygénation avec le nanocapteur de détection d’oxygène rouge lointain et proche infrarouge (NIR) (MMIR1) récemment validé et caractérisé. La nanoparticule cationique est imprégnée de deux colorants rapporteurs, l’aza-BODIPY de référence insensible à l’O₂ (excitation 650 nm, émission 675 nm) et la métallporphyrine sensible à l’O₂ NIR, PtTPTBPF (excitation 620 nm, émission 760 nm). Le MMIR1 permet l’analyse en temps réel des gradients d’oxygène sur un microscope à fluorescence conventionnel (à l’aide de l’analyse ratiométrique) ou un microscope à durée de vie de phosphorescence (PLIM) sans introduire de toxicité cellulaire et permettant des signaux stables, une surveillance à long terme et un multiplexage^25,29. En fonction de la nécessité de colorer avec des colorants ou des nanocapteurs, du débit de sphéroïdes ou du type de cellule, le protocole de formation le plus approprié peut être choisi. Étant donné que les études de viabilité et d’oxygénation des sphéroïdes sont pertinentes pour les études de cancer et de sphéroïdes dérivés de cellules souches, les protocoles présentés incluent également des exemples et des résultats typiques attendus du NAD(P)H-FLIM et du FAD-FLIM avec ces modèles. Les pipelines d’imagerie et d’analyse présentés ciblent les plateformes de microscopie FLIM basées sur le comptage de photons uniques corrélées dans le temps les plus populaires.

Protocole

1. Génération de sphéroïdes multicellulaires

1. Culture cellulaire
   REMARQUE : Les cultures cellulaires peuvent être collectées auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC), de Lonza, de Sigma-Aldrich ou d’autres fournisseurs. L’ATCC fournit tous les renseignements nécessaires à la manipulation, y compris les milieux de croissance préférés, les procédures de sous-culture, le niveau de biosécurité, le taux de croissance et les profils STR. Ici, 500 cellules/sphéroïde de la lignée cellulaire HCT116 du cancer du côlon humain sont utilisés dans le milieu 5A de McCoy (VWR, 392-0420) complété par 10 % de FBS et 1 mM de pyruvate de sodium. Pour les expériences à long terme qui sont surveillées quotidiennement, 10 mM d’HEPES, pH 7,2 peuvent être ajoutés au milieu.
   1. Cultivez des cellules pour atteindre une confluence de 70 à 90 %.
   2. Rincer les cellules avec du PBS stérile préchauffé (37 °C) (5 mL pour 25 cm² ou 10 mL par ballon de 75 cm² ).
   3. Ajouter 0,05 % de trypsine - 1 mM de solution EDTA (0,5 mL pour 25 cm² ou 1 mL par flacon de 75 cm² ) et incuber pendant 5 à 10 min à 37 °C dans 5 % de CO₂, 95 % d’humidité pour atteindre le détachement cellulaire.
      REMARQUE : Contrôlez le détachement de la cellule sous le microscope à lumière de transmission (fond clair). La surexposition des cellules à la solution enzymatique dissociante peut affecter leur viabilité.
   4. Neutralisez la trypsine en ajoutant un excès de milieu de culture cellulaire contenant 10 % de FBS (au moins 5 ml de milieu pour 1 ml de solution de dissociation).
      REMARQUE : Pour les cellules cultivées sur des milieux de culture à faible teneur en FBS ou sans FBS, la neutralisation de la trypsine peut être effectuée avec l’ajout de 0,5 mL de FBS à 100 % à la culture cellulaire traitée à la trypsine, suivie d’une centrifugation pour transférer les cellules dans leur milieu de culture d’origine.
   5. Dissocier les agrégats cellulaires par pipetage pour obtenir une suspension unicellulaire en milieu.
      REMARQUE : Le pipetage à l’aide d’une pipette sérologique avec une pointe de pipette de 1000 μL sur le dessus améliore considérablement la génération de suspension unicellulaire dans un grand volume de culture cellulaire en suspension.
   6. À l’aide d’une chambre de comptage (hémocytomètre réglé de Neubauer ou alternatives) pour compter le nombre de cellules par 1 mL de suspension cellulaire.
   7. Diluez la suspension cellulaire pour obtenir le nombre souhaité de cellules par millilitre.
   8. Ajouter une solution concentrée de sonde d’O2 (nanoparticules) à la suspension cellulaire à une concentration finale de 10 μg/mL pour l’analyse ratiométrique de l’O2.
      REMARQUE : Pour assurer une suspension cellulaire homogène (avec la sonde), remettre en suspension plusieurs fois avant la formation de sphéroïdes. Si la sonde O₂ n’est pas nécessaire, sautez cette étape et procédez à la formation des sphéroïdes. Un protocole modifié doit être appliqué lors de la manipulation des iPSC. En bref, les iPSC sont cultivées en colonies sur des plaques revêtues de Geltrex et passées à l’aide de ReLeSR comme décrit dans le protocole⁴⁸ fourni par le fournisseur. Le jour de la formation des sphéroïdes, les colonies doivent être grandes, compactes et présenter des centres multicouches avec des bordures distinctes. Rincez les cellules avec du PBS stérile préchauffé. Ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire douce (GCDR) et incuber à 37 °C pendant 8 à 10 min. À l’aide d’une pointe de 1000 μL, détacher doucement les cellules du puits et obtenir une suspension unicellulaire. Transférez la suspension unicellulaire dans un tube conique stérile de 50 mL et ajoutez 4 mL de milieu DMEM-F12 préchauffé pour neutraliser le GCDR. Lavez le puits avec 1 mL de DMEM-F12 et transférez-le dans le reste de la suspension cellulaire. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min. Remettre en suspension dans 1 mL de milieu approprié pour d’autres expériences. Pour les expériences décrites dans ce manuscrit, mTeSR + 10 μM Rock Inhibitor a été utilisé. Comptez et diluez la suspension cellulaire pour obtenir le nombre souhaité de cellules par millilitre.
2. Méthodes de formation de sphéroïdes
   1. Micro-moules en boîte de Pétri 3D
      REMARQUE : Cette méthode à haut débit est utilisée pour générer simultanément un grand nombre de sphéroïdes (81 sphéroïdes) dans un réseau de micromoules de 9 x 9 d’un diamètre de 800 m et d’une profondeur de 800 m.
      1. Rincer les micro-moules pour la coulée de boîtes de Pétri 3D en dH₂O et les mettre dans un récipient autoclave.
      2. Mesurez 2 g de poudre d’agarose de qualité électrophorèse et placez-la dans une bouteille en verre sèche de 200 ml sans danger pour l’autoclave.
         REMARQUE : Assurez-vous que le flacon et la poudre d’agarose sont secs, sans liquide ni humidité.
      3. Micro-moules autoclaves pour la coulée de boîtes de Pétri 3D et flacons avec de la poudre d’agarose pendant 30 min sur un cycle de séchage.
      4. Préparez une solution saline à 0,9 p/v en ajoutant 0,9 g de NaCl dans 100 ml d’eau ultrapure et stérilisez à l’autoclave.
         REMARQUE : Le NaCl est recommandé par le fabricant. Il augmente la stabilité de l’agarose.
      5. Préparez la solution d’agarose en ajoutant la solution saline stérile à la poudre d’agarose stérilisée. Vissez le couvercle de manière lâche pour éviter l’accumulation de pression. Agitez la bouteille pour mélanger la poudre d’agarose.
      6. Faites bouillir et dissoudre la poudre d’agarose à l’aide d’un four à micro-ondes. Arrêtez fréquemment le micro-ondes (~toutes les 10 s). Agitez la bouteille et répétez jusqu’à ce que l’agarose soit dissous.
         ATTENTION : La solution d’agarose est chaude et nécessite une manipulation soigneuse. L’agitation immédiatement après la procédure de fusion peut faire jaillir la solution de la cuve. Pour éviter les accidents, utilisez des récipients suffisamment grands remplis à 50 % de leur capacité et utilisez une protection individuelle appropriée (gants, gant de cuisine, lunettes de protection et blouse de laboratoire).
      7. Laissez refroidir la solution d’agarose dissoute à 60-70 °C. À l’aide de techniques et de conditions aseptiques, pipeter l’agarose fondu dans le micro-moule (500 μL pour la série 12 ou 330 μL pour la série 24).
         REMARQUE : Évitez la formation de bulles lors du mélange ou du pipetage de l’agarose. Éliminez toutes les petites bulles piégées dans les petites caractéristiques du micro-moule par pipetage ou grattage doux avant que l’agarose ne se solidifie.
      8. Laissez l’agarose se solidifier pendant environ 2-3 min. Ensuite, fléchissez soigneusement le micro-moule pour retirer la boîte de Pétri 3D et transférez-la sur une plaque de culture tissulaire à 12 puits.
         REMARQUE : Une flexion excessive du micro-moule peut entraîner la formation de fissures dans le moule d’agarose.
      9. Pour équilibrer la boîte de Pétri 3D, ajoutez 2,5 mL/puits de milieu de culture cellulaire. Incuber pendant 15 minutes ou plus. Retirez le milieu de culture et remplacez-le par un milieu frais. Répétez l’opération une fois de plus pour équilibrer la boîte de Pétri 3D avec un milieu de culture.
         REMARQUE : Le protocole peut être interrompu ici jusqu’à l’ensemencement des cellules. Pour un stockage à long terme (jusqu’à 2 semaines à 4 °C), utilisez une solution PBS au lieu d’une solution moyenne.
      10. Retirez complètement la boîte de Pétri 3D entourant le milieu de culture (ou PBS) et retirez avec précision le milieu à l’intérieur de la boîte de Pétri 3D en inclinant la plaque de culture tissulaire.
      11. Ensemencez avec précaution 190 μL de suspension cellulaire contenant 40 500 cellules goutte à goutte dans la chambre d’ensemencement cellulaire (voir étape 1.1).
          REMARQUE : Le nombre de micro-puits dans les timbres d’agarose détermine le nombre de sphéroïdes produits par timbre. Dans ce cas, ce moule d’agarose contient 81 micropuits (81 x 500 cellules/sphéroïde). La variation de la concentration cellulaire en suspension ajoutée à un macropuits permet de modifier le nombre de cellules par sphéroïde, contrôlant ainsi la taille du sphéroïde.
      12. Attendez ~10 min pour que les cellules s’installent dans les caractéristiques du dsh de Petri 3D. Ensuite, ajoutez 2 ml de milieu à l’extérieur de la boîte de Pétri 3D.
      13. Placez la plaque de culture tissulaire dans l’incubateur de culture cellulaire et remplacez le milieu entourant la boîte de Pétri 3D si nécessaire.
   2. Plaque de fixation basse
      REMARQUE : Cette méthode est utilisée pour générer un seul sphéroïde par puits. Des plaques revêtues (Lipidure ou Biofloat) sont disponibles dans le commerce (sautez les étapes 1.2.2.1-1.2.2.4). Alternativement, le revêtement peut être acheté séparément et utilisé pour revêtir des plaques multipuits non traitées. Il est recommandé de remplir les puits situés sur les bords des plaques de 96 puits avec de l’eau stérile ou du PBS en raison de l’évaporation plus rapide dans ces puits, limitant ainsi le nombre de puits pour les sphéroïdes à 60. Au cas où moins de sphéroïdes seraient nécessaires, remplissez les puits vides environnants avec de l’eau ou du PBS. Utilisez des embouts sans poussière pour la manipulation des liquides afin d’éviter d’apporter de petites particules dans les puits, car elles interfèrent avec la formation de sphéroïdes.
      1. Préparez une solution d’enrobage à 0,5 % p/v en dissolvant 0,25 g de poudre de polymère dans 50 ml d’éthanol dans un récipient en verre. Filtrez-stérilisez le revêtement.
         REMARQUE : La stérilisation par filtre et toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles sous flux laminaire.
      2. Ajouter 200 μL de la solution d’enrobage dans chaque puits d’une plaque de culture à fond en U de 96.
      3. Incuber pendant 1 min et enlever l’excédent de revêtement.
         REMARQUE : La solution de revêtement peut être utilisée plusieurs fois. Conserver dans un récipient en verre à température ambiante (RT). Les récipients en plastique ne sont pas conseillés, car le plastique peut se dissoudre partiellement et faire partie de la solution. S’il y a de la poussière, stérilisez le filtre avec un polyéthersulfone (PES) de 0,22 μm ou des filtres à seringue en nylon.
      4. Laissez sécher la plaque à 96 puits à l’air libre pendant environ 1 h.
         REMARQUE : Si les cellules ont besoin d’une matrice extracellulaire, passez à l’étape 1.2.3. Les plaques revêtues peuvent être stockées chez RT lorsqu’elles sont enveloppées dans de l’aluminium jusqu’à 1 mois. Lors de l’ensemencement d’une plus petite quantité de cellules/puits, la centrifugation de la plaque pendant 5 minutes à 300 g peut aider à abattre les cellules.
   3. Protocole de formation assistée par matrice extracellulaire
      REMARQUE : Certaines lignées cellulaires ne produisent pas suffisamment de matrice extracellulaire (ECM) elles-mêmes et ont besoin de l’ajout d’ECM telles que Matrigel, Cultrex ou Geltrex afin de former des sphéroïdes compacts 49,50,51. Pour des types de cellules tels que le cancer du sein MDA-MB-231, la papille dermique humaine, les cellules cancéreuses de la prostate et autres, il est possible d’utiliser l’étape 1.2.2 avec les modifications suivantes⁵², nécessitant l’ajout de l’ECM. Utilisez de préférence des embouts sans poussière pour la manipulation des liquides afin d’éviter que la poussière n’interfère avec la formation de sphéroïdes. Les étapes 1 et 4 à 7 doivent être effectuées sous une enceinte de sécurité biologique (classe II).
      1. Passez aux étapes 1.2.2.1-1.2.2.4 (plaques de fixation basses) pour le traitement de surface.
      2. Pré-refroidissez la plaque à 96 puits à 4 °C au réfrigérateur.
      3. Préparez la centrifugeuse avec l’adaptateur approprié pour la plaque à 96 puits et prérefroidissez-la à 4 °C.
      4. Préparez une solution à 5 % de matrice de membrane basale (BMM) dans un milieu de culture cellulaire pré-refroidi (4 °C).
         REMARQUE : BMM se croise rapidement à RT. Lors de la manipulation, gardez les stocks et les solutions sur la glace.
      5. Préparez la suspension cellulaire (voir étape 1.1).
      6. Ajouter 50 μL de la solution BMM dans chaque puits.
      7. Ajouter délicatement 50 μL de suspension cellulaire dans chaque puits au-dessus de la solution BMM (25 000 cellules/puits).
         REMARQUE : Ne projetez pas ce volume dans le puits, sinon les cellules se répandront sur les côtés des puits et ne s’accumuleront pas au fond. Un nombre inférieur de cellules par puits peut être obtenu en ajustant la densité cellulaire en conséquence. Toutes les cellules ne formeront pas de sphéroïdes à toutes les densités d’ensemencement ; L’optimisation doit être effectuée en termes de type de cellule et de dimension. Avec les volumes fournis, la concentration finale de BMM est de 2,5 %. Si une concentration différente est nécessaire, la solution mère doit être préparée à une concentration plus faible/plus élevée.
      8. Centrifuger la plaque à 96 puits pendant 5 min à 300 x g et 4 °C.
         REMARQUE : Sans cette étape, les cellules ne s’agrègent pas correctement au fond du puits, ce qui provoque la formation de plusieurs agrégats plus petits. La centrifugeuse doit être refroidie pour éviter la réticulation à ce stade.
      9. Placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Les agrégats sont considérés comme matures le jour 4 après l’ensemencement.
         REMARQUE : Pour des protocoles supplémentaires sur la formation des sphéroïdes, reportez-vous au Fichier supplémentaire 1.

2. Microscopie en direct des sphéroïdes

1. Préparation des sphéroïdes pour l’analyse d’imagerie en direct
   REMARQUE : Selon le plan d’expérience (par exemple, surveillance à long terme ou analyse finale, configuration du microscope ou propriétés spectrales de la fluorescence mesurée) ou en raison de l’incompatibilité de la méthode de production des sphéroïdes avec la microscopie (par exemple, épaisseur de l’échantillon, autofluorescence du matériau, flottement des sphéroïdes pendant l’imagerie), surveillance directe des sphéroïdes dans la plaque, où ils ont été produits, peut ne pas être possible. Le protocole explique la préparation des sphéroïdes pour l’imagerie, qui conviennent à la plupart des microscopes à champ large inversé et des microscopes confocaux.
   1. Préparez et préchauffez (37 °C) le support d’imagerie : DMEM complété par HEPES-Na, pH 7,2 (10 mM), pyruvate de sodium (1 mM), L-glutamine (2 mM) et glucose (5 mM), sans rouge de phénol.
      REMARQUE : Le bicarbonate de sodium seul ou en combinaison avec HEPES-Na peut être utilisé, si le contrôle du CO₂ est fourni pendant l’imagerie²⁴. Certains types de cultures cellulaires ne peuvent pas tolérer la présence d’HEPES. Selon la conception expérimentale, les teneurs en pyruvate, en glutamine et en glucose peuvent être modifiées.
   2. Préparez des boîtes de microscopie stériles (disponibles dans le commerce ou fabriquées en laboratoire) avec des surfaces en verre de couverture recouvertes (pour une forte adhérence sphéroïde) ou non revêtues (faible adhérence sphéroïde) (épaisseur #1,5).
      REMARQUE : Le besoin et le type d’enrobage dépendent du type de cellule, des propriétés d’adhésion des sphéroïdes et de la vitesse de leur migration cellulaire de l’interface de culture 3D à l’interface de culture 2D. Il est important d’en tenir compte, car le revêtement peut faciliter la perte d’organisation 3D, en modifiant la forme des micro-gradients chez les sphéroïdes et, par conséquent, le comportement cellulaire. Pour certaines expériences (par exemple, l’imagerie a analysé la réponse à la stimulation médicamenteuse), une forte adhérence des sphéroïdes à la surface est requise, et un revêtement avec de la gélatine, du BMM, du collagène, du collagène / poly-D-lysine ou de la poly-D-lysine est préféré.
   3. Lavez délicatement les sphéroïdes colorés par la sonde O₂ des micropuits de l’agarose à micromotifs ou de la plaque à 96 puits et transférez les sphéroïdes encore flottants dans un flacon de 2 ml.
      REMARQUE : Pour assurer la collecte de tous les sphéroïdes à partir de la méthode à haut débit, rincez le moule 1 à 3 fois avec le volume supplémentaire de milieu de culture, en combinant toutes les suspensions de sphéroïdes dans un seul flacon. Pour les sphéroïdes dans une plaque de fixation basse, prélever les sphéroïdes un par un dans des puits individuels dans un flacon ou directement dans une boîte de microscopie si un petit nombre de sphéroïdes est suffisant pour l’expérience. Lors du transfert de gros sphéroïdes, coupez l’extrémité de la pointe de la pipette pour éviter tout dommage lors du pipetage.
   4. Laissez le flacon en position verticale jusqu’à 5 min pour laisser les sphéroïdes se déposer au fond du flacon, formant une pastille visible.
   5. Retirez le milieu du tube, en laissant les sphéroïdes intacts, et remettez-les doucement en suspension dans une quantité suffisante de culture fraîche.
      REMARQUE : Pour faciliter la manipulation des sphéroïdes, le transfert des sphéroïdes sur le support d’imagerie peut également être effectué à ce stade en petits lots ; Voir les étapes 2.1.7 et 2.1.8. Les sphéroïdes des différents groupes expérimentaux doivent être traités de la même manière, car la composition du milieu et le temps de préconditionnement du milieu peuvent affecter leur métabolisme.
   6. Pendant que les sphéroïdes flottent, transférez un volume égal de suspension de sphéroïdes par puits de la boîte de microscopie.
   7. Incuber les sphéroïdes pendant 1 à 2 h à 37 °C dans un incubateur de CO₂ pour assurer leur fixation à la surface de la parabole/puits de microscopie. Pour l’imagerie, passez à l’étape 2.1.9. Pour la coloration des sphéroïdes avec des sondes supplémentaires, passez à l’étape 2.1.8.
      REMARQUE : Le taux de migration cellulaire du sphéroïde 3D à l’interface de surface 2D est fonction du temps. Pour éviter une perte d’organisation 3D, le temps d’incubation doit être optimisé en fonction du type de cellule, du type de revêtement de surface et de la conception de l’expérience. Par exemple, HCT116, selon la taille du sphéroïde, a besoin d’au moins 2 h pour une bonne fixation du sphéroïde à la surface recouverte de collagène IV/poly-D-lysine, tandis que la fixation et la migration du hDPSC vers l’interface 2D sont extrêmement rapides, entraînant une perte d’organisation 3D en 1 à 2 h. Pour éviter l’imagerie de « sphéroïdes 2D » dues à une étalement excessif, des surfaces en verre non revêtues sont utilisées avec un temps d’incubation réduit.
   8. Ajouter une ou plusieurs sondes de fluorescence à des concentrations recommandées ou optimisées empiriquement à un volume connu de suspension sphéroïde. Incuber pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur de CO₂ avant l’imagerie.
      REMARQUE : Pour les essais vivants/morts, utiliser l’iodure de propidium et le Calcein Green-AM à une concentration finale standard de 1 μg/mL. Pour éviter l’effet toxique de la coloration à l’iodure de propidium sur les corps embryoïdes d’iPSC, la concentration finale d’iodure de propidium était de 0,5 μg/mL. Le temps de chargement de la sonde peut être prolongé si la diffusion de la sonde n’est pas efficace en raison de la grande taille du sphéroïde. Le temps de chargement doit toujours être considéré comme faisant partie du temps d’incubation total nécessaire à la fixation du sphéroïde à la surface. Si une période plus longue est nécessaire pour la fixation des sphéroïdes, la procédure de coloration doit être organisée à la fin de cette période. Sachez qu’un temps d’incubation plus long peut entraîner une perte d’organisation 3D.
   9. Retirez les milieux de culture cellulaire ou les milieux contenant des sondes fluorescentes et remplacez-les par un volume nécessaire de supports d’imagerie. Pour vous assurer qu’aucun fond de fluorescence de média n’est sur le chemin de l’imagerie sphéroïde, répétez l’étape d’échange de média (lavage) jusqu’à 5 fois.
      REMARQUE : Pour éviter l’élimination des sphéroïdes lors du changement de support, il est recommandé d’aspirer soigneusement le support avec une pipette de 200 μL à partir des bords des boîtes de microscopie et d’effectuer l’ajout de support par la paroi ou latéralement dans la boîte de microscopie.
   10. Passez immédiatement à l’étape 2.2.1 du protocole d’imagerie.
       REMARQUE : Une pause trop longue entre la préparation à l’imagerie et l’acquisition réelle de l’imagerie peut influencer le métabolisme cellulaire (par exemple, via une modification de la composition du milieu), la viabilité (certaines sondes fluorescentes utilisées pour l’analyse des paramètres ont des effets toxiques, qui peuvent stimuler la mort cellulaire après une longue période d’incubation) ainsi qu’entraîner une perte d’organisation 3D. Si plusieurs groupes de sphéroïdes ou conditions expérimentales doivent être comparés, le plan expérimental doit être élaboré en conséquence pour que le moment du traitement, du préconditionnement et des procédures d’imagerie soit aussi égal que possible entre les groupes analysés.
2. Acquisition d’images
   REMARQUE : Le protocole décrit l’imagerie multiparamétrique de sphéroïdes vivants à l’aide du microscope confocal Stellaris 8 Falcon (Leica) et du logiciel Leica Application Suite X (LAS X) version 4.7. Cependant, seules des modifications mineures seront nécessaires pour effectuer une telle analyse sur d’autres plateformes de microscopie.
   1. Allumez l’unité de contrôle de la température 30 à 60 minutes avant l’imagerie. Réglez la vitesse de ventilation et la température nécessaires (35-37 °C).
      REMARQUE : Si, en plus du contrôle de la température, la concentration de gaz (par exemple, CO₂ ou O₂) doit être contrôlée pendant l’imagerie, les appareils correspondants doivent également être démarrés à l’avance pour atteindre les conditions nécessaires avant l’imagerie.
   2. Allumez le microscope et les appareils connectés (c’est-à-dire le laser WLL, l’ordinateur, la pompe à eau pour l’objectif d’immersion dans l’eau et d’autres blocs électroniques en fonctionnement). Démarrez le logiciel de contrôle du microscope (par exemple, LAS X Machine Mode ou Mode Machine avec contrôle de l’environnement) fourni avec la configuration exacte du microscope et initialisez l’étalonnage de la platine.
   3. Choisissez l’objectif requis dans le logiciel et appliquez le liquide d’immersion si nécessaire.
      REMARQUE : Pour la microscopie en direct, il est recommandé d’utiliser des objectifs à immersion dans l’eau ou le glycérol ayant une distance de travail suffisante (« longue »), par exemple HC Fluotar L 25x/0,95 W VIS IR (distance de travail de 2,4 mm), HC PL Apo 40x/1,25 GLYC (distance de travail de 0,35 mm) ou au moins NA = 0,4 ou plus pour les objectifs à air. Le choix du grossissement et de la distance de travail dépend de la nature et de la taille de l’échantillon imagé et des signaux de fluorescence mesurés (luminosité, rendement quantique, efficacité de coloration, voir par exemple, discussion sur les colorants et les nanoparticules⁵³). Les grands objets (sphéroïdes ou organoïdes, d’une taille de >500 μm), les « bioréacteurs » ou les puces microfluidiques nécessitent des objectifs à longue distance de travail et un grossissement plus faible, tandis que l’analyse de cellules individuelles ou d’organites cellulaires nécessite un grossissement élevé, souvent obtenu par imagerie « mosaïque ».
   4. Installez la parabole de microscopie avec des sphéroïdes sur la scène. Ajustez la mise au point et trouvez un objet/une région d’intérêt (ROI).
      REMARQUE : Si des objets petits, faiblement fluorescents, à faible contraste ou rares doivent être trouvés et qu’il est difficile de trouver la mise au point, il est recommandé de pré-focaliser sur les parois de la parabole de microscopie et de « masquer » la surface de l’objet d’intérêt par serpentine, en commençant par l’un des coins du puits.
   5. Choisissez la fenêtre Ouvrir le projet et cliquez sur l’icône correspondante, Créer un nouveau projet. Donnez un nom standard (par exemple, commençant par « description AA-MM-JJ+ ») au dossier du projet de recherche. Pendant l’imagerie, toutes les images produites seront automatiquement enregistrées dans le fichier .lif du projet créé.
   6. Ouvrez la fenêtre Acquisition . Réglez la longueur d’onde d’excitation du laser à lumière blanche (WLL) et la plage requise des détecteurs à balayage hybrides ou par résonance (type HyD S, HyD X ou HyD R) en fonction des propriétés spectrales connues de la fluorescence mesurée (spectres d’excitation/d’absorbance et d’émission). Choisissez les types de balayage Ligne ou Image .
      REMARQUE : Pour la plupart des colorants fluorescents disponibles dans le commerce, les propriétés spectrales peuvent être trouvées (ou ajoutées) dans le package LAS X Dye Assistant. Choisissez le détecteur avec la plage de sensibilité spectrale appropriée compatible avec les propriétés spectrales de la sonde et, dans le cas de FLIM, compatible avec le comptage de photons (c’est-à-dire HyD X ou HyD R). Pour l’imagerie multiparamétrique, régler la WLL dans plusieurs positions d’excitation (par exemple, pour l’imagerie simultanée de FAD/Flavins et de deux canaux de fluorescence de la sonde ratiométrique MMIR1 O₂ - de référence et sensible, les paramètres d’excitation/d’émission peuvent être de 460 nm/510-590 nm HyD X1 et 614 nm/631-690 HyD X3 et 724-800 nm HyD R en conséquence dans une ou deux séquences de balayage séquentiel). Il est important d’attribuer le détecteur approprié pour collecter l’émission, car les détecteurs peuvent avoir différentes sensibilités spectrales⁵⁴.
   7. (Facultatif pour FLIM) Dans la fenêtre Acquisition , choisissez le mode FLIM pour effectuer une imagerie combinée au comptage de photons (collecte de désintégration). Immédiatement, un « module FLIM supplémentaire dans le logiciel LAS X » sera ouvert pour naviguer et analyser les données FLIM.
   8. (Facultatif pour FLIM) Choisissez le taux de répétition des impulsions WLL en fonction de la durée de vie moyenne attendue du fluorophore.
      REMARQUE : La fréquence de l’impulsion laser doit être ajustée pour collecter la décroissance complète de la fluorescence. Cela peut être fait à l’aide d’une fonction Pulse Picker installée sur le microscope. Le chevauchement de la décroissance de la fluorescence avec l’impulsion laser entraînera un raccourcissement de la durée de vie estimée de la fluorescence. Il est recommandé d’avoir des intervalles d’impulsion de 4 à 5 fois plus longs que la durée de vie moyenne prévue de la fluorescence (par exemple, 25 ns/40 MHz pour des durées de vie allant jusqu’à 5 ns). De nombreux lasers pulsés ont un taux de répétition fixe de 80 MHz (idéal uniquement pour une plage allant jusqu’à 2-3 ns). Ceci est important pour choisir les fluorophores appropriés pour l’expérience.
   9. Démarrez l’aperçu de l’imagerie à l’aide du mode FAST LIVE et ajustez la mise au point fine de l’objet d’imagerie sur une section d’intérêt.
      ATTENTION : Respectez strictement les règles de sécurité laser. Tenez toujours compte des règles de sécurité laser et attendez que l’imagerie s’arrête avant d’allumer la lumière de transmission, de regarder dans l’oculaire ou sur l’échantillon.
      REMARQUE : En mode FAST LIVE , un balayage haute vitesse de 600 Hz (correspond à une fréquence d’images maximale de 4,43/s si le mode de balayage X bidirectionnel est utilisé), une résolution de 256 x 256 pixels sont appliquées automatiquement à l’image pour protéger la fluorescence du photoblanchiment. Ouvrez le sténopé (par exemple, à 3-4 UA) et/ou augmentez l’intensité du laser si le signal de fluorescence est trop faible pour faire la mise au point sur l’objet. Évitez la collecte incomplète de pourritures.
   10. (Facultatif pour FLIM) En regardant un histogramme d’intensité de pixel apparaissant pendant l’imagerie dans la fenêtre d’un module FLIM (mode en direct ), ajustez l’intensité laser/la taille et la résolution appropriées pour atteindre le taux de comptage ~1 photon/limite d’impulsion laser (ligne rouge). Évitez d’aller nettement au-dessus de 1 pour exclure un risque d’effet d’carambolage. Si nécessaire, ajustez le taux de répétition des impulsions WLL pour avoir une collection complète de désintégrations dans une fenêtre de décroissance (pour éviter une collecte incomplète, voir l’étape 2.2.8).
       REMARQUE : Si le nombre de photons (intensité) n’est pas suffisant pour reconstruire une décroissance fiable pour l’analyse d’ajustement ou le nuage de tracé de phaseur, appliquez plusieurs répétitions de balayage (images ou lignes, ou configurez le temps de balayage), augmentez l’intensité du laser et/ou sacrifiez la résolution (taille de la zone d’intérêt numérisée). Sachez que la diminution du taux de répétition du laser nécessite la collecte d’un plus grand nombre de photons pour une reconstruction fiable de la désintégration, et qu’une correction supplémentaire des paramètres d’imagerie peut être nécessaire. Soyez conscient de l’impact potentiel d’une lumière intense et d’un éclairage continu long sur la viabilité cellulaire et le métabolisme⁵⁵. L’impact négatif sur la viabilité et le métabolisme peut être différent dans chaque cas individuel, en fonction de l’intensité, de la durée et de la longueur d’onde de la lumière d’excitation, ainsi que de la modalité d’imagerie (par exemple, imagerie confocale à un photon ou imagerie multiphotonique). Ajuster les paramètres d’imagerie en conséquence et, si nécessaire, contrôler la vivie/mort cellulaire par Calcein Green-AM ou l’intensité de l’iodure de propidium dans les expériences pilotes⁵⁶. Dans la mesure du possible, d’autres optimisations du protocole de coloration de la sonde de fluorescence doivent être envisagées pour atteindre un signal de fluorescence adéquat pendant la microscopie en direct.
   11. (Facultatif pour 3D z-stack) Dans Fast Live , définissez les coordonnées, la direction du balayage et attribuez-les au début et à la fin dans la fenêtre Z-stack (mode de balayage XYZ). Choisissez la taille du pas Z ou le nombre de pas.
       REMARQUE : Bien que le logiciel calcule automatiquement le nombre « optimal » d’étapes, en fonction de la résolution utilisée et des paramètres de numérisation, la reconstruction 3D en direct peut normalement nécessiter un plus petit nombre d’étapes pour obtenir une acquisition rapide, par exemple, une taille de pas de 1 à 2 μm, une taille de pile de 50 à 100 μm, une numérisation bidirectionnelle, nécessitant 2 à 3 minutes du temps de numérisation total. Sachez que les organites subcellulaires, les cellules et le modèle cellulaire 3D peuvent également se déplacer pendant les mesures. De plus, en raison de la profondeur de pénétration de la lumière et des limites de diffusion, il n’est généralement possible d’atteindre qu’une profondeur de balayage de 50 à 100 μm sur le FLIM confocal.
   12. Lorsque tous les paramètres nécessaires sont appliqués, démarrez l’imagerie.
   13. Donnez à l’image un nom approprié.
   14. Recherchez l’objet d’imagerie suivant en mode lumière de transmission et répétez la procédure d’imagerie avec les paramètres d’imagerie précédemment optimisés (étapes 2.2.8 à 2.2.12).
       REMARQUE : Pour la comparaison basée sur l’intensité ou l’analyse du rapport d’intensité (par exemple, l’analyse de l’oxygénation basée sur la sonde MMIR O₂), conservez toujours les mêmes paramètres d’imagerie pour tous les objets analysés (grossissement et type de lentille d’objectif, intensité laser, puissance et fréquence d’impulsion, longueur d’onde d’excitation, portée des détecteurs, sténopé, vitesse de balayage, temps de séjour des pixels et résolution). Cependant, comme la durée de vie de la fluorescence ne dépend pas de l’intensité de la fluorescence et nécessite la collecte d’un nombre approprié de photons pour un calcul fiable, les paramètres d’imagerie FLIM peuvent être réajustés au cours de l’expérience pour maintenir le nombre de photons collectés comparables entre différents traitements ou conditions expérimentales. Par conséquent, pour l’analyse multiparamétrique où l’analyse basée sur l’intensité et l’analyse basée sur la durée de vie de la fluorescence sont toutes deux nécessaires, des paramètres d’imagerie universels optimisés doivent être appliqués pour tous les objets des groupes expérimentaux comparés. Pour la comparaison « FLIM uniquement », il est possible de comparer les images acquises avec des paramètres d’imagerie légèrement différents, car le logiciel LAS X fournit le calcul de l’IRF pour la mesure d’image individuelle⁴². Cependant, pour l’analyse d’ajustement FLIM en dehors de LAS X (par exemple, FLIMfit⁴⁵), la fonction de réponse de l’instrument (IRF) doit être mesurée pour chaque condition d’imagerie différente, car elle ne peut pas être exportée à partir du logiciel d’imagerie. Par conséquent, pour la simplicité de la conception expérimentale et de la charge de travail, il est recommandé d’appliquer les mêmes paramètres d’imagerie à toutes les images de l’ensemble de données. Ensuite, les mesures IRF correspondantes peuvent être effectuées à l’aide de fluorophores à durée de vie éteints ou à fluorescence rapide (dans la gamme ps) avec les propriétés d’émission du canal spectral mesuré 57,58,59, par luminescence de nanoparticules d’or ⁶⁰ ou par signal de génération de seconde harmonique pour le multiphoton FLIM⁶¹. Dans le logiciel LAS X, les paramètres d’imagerie précédemment optimisés peuvent être chargés pour un nouveau projet en faisant un clic droit sur le fichier qui vous intéresse et en choisissant Appliquer les paramètres d’image.
   15. Une fois la session d’imagerie terminée, enregistrez le projet d’imagerie. Pour finaliser la séance d’imagerie, retirez l’échantillon de la platine de microscopie et nettoyez l’objectif du liquide d’immersion (le cas échéant) selon la procédure standard mise en œuvre dans l’installation d’imagerie. Fermez le projet et le logiciel. Éteignez le microscope, les lasers et tous les appareils connectés.
   16. Procédez à l’analyse des données d’imagerie (étape 2.3).
3. Traitement d’images de phaseur NAD(P)H/FAD-FLIM avec le module LAS X FLIM et FIJI
   REMARQUE : Le protocole décrit une analyse de la durée de vie en fluorescence de sphéroïdes imagés pour les données dans le domaine fréquentiel sur des exemples de NAD(P)H et de FLIM d’autofluorescence FAD/Flavines. La mesure de l’autofluorescence NAD(P)H est devenue un étalon-or pour l’analyse métabolique, où les composants courts et plus longs de la durée de vie de l’autofluorescence NAD(P)H sont associés à la glycolyse ou à la phosphorylation oxydative (OxPhos), respectivement. Cela peut être analysé par le décalage sur un diagramme de phaseur le long de la trajectoire métabolique vers les étalons mesurés de NAD(P)H libre ou de NAD(P)H lié aux protéines^31,62. Pour analyser la trajectoire du décalage métabolique, ainsi que pour comparer la position des nuages de phaseurs (voir la NOTE ci-dessous l’étape 2.3.6) sur un graphique entre groupes expérimentaux, une analyse simplifiée des coordonnées de phaseur, basée sur le calcul du centre géométrique (centroïde) du nuage de phases, a été mise en œuvre²⁹. Le protocole décrit illustre le calcul des coordonnées du centroïde en FIDJI et la mesure de la distance entre deux points sur un tracé de phaseur à l’aide de coordonnées (par exemple, la distance entre un centroïde du nuage de phaseur d’autofluorescence SPHÉROÏDE NAD(P)H et un point théorique « NAD(P)H libre »). De même, les signaux FAD et autres signaux d’autofluorescence peuvent être analysés. Un ensemble de données 1 avec .lif (logiciel LAS X requis) ou .ptu formats de fichiers pour l’apprentissage de cette procédure sont fournis (Dossier supplémentaire 2, Fichier supplémentaire 3, Fichier supplémentaire 4, Fichier supplémentaire 5, Fichier supplémentaire 6, Fichier supplémentaire 7, Fichier supplémentaire 8, Fichier supplémentaire 9, et Dossier supplémentaire 10).
   1. Ouvrez le module FLIM dans LAS X, sélectionnez Ouvrir le projet et chargez le fichier d’image du sphéroïde (.lif) pour l’analyse NAD(P)H/FAD d’autofluorescence.
      REMARQUE : En raison de bogues potentiels et de pertes de données intermédiaires dans le module FLIM, utilisez une copie du fichier image sphéroïde d’origine (.lif) pour l’analyse NAD(P)H/FAD, en gardant le fichier brut inchangé.
   2. Sélectionnez une seule image et accédez à l’interface d’analyse FLIM. Cliquez sur Phaseur pour accéder au tracé du phaseur et activer le mode d’analyse du phaseur. Appliquez le filtre (Médiane ou Ondelettes) et définissez le Seuil pour minimiser le bruit et améliorer la visibilité des données pour toutes les analyses de phaseur. Choisissez les harmoniques. Pour l’analyse du changement métabolique basée sur les données NAD(P)H, passez aux étapes 2.3.3 à 2.3.5. Pour la comparaison générale des diagrammes de phaseur, passez à l’étape 2.3.6.
      REMARQUE : Appliquez les paramètres d’analyse (type de filtre, harmoniques, seuil, binning et ROI de phaseur) de la même manière à toutes les images d’un ensemble de données comparées.
   3. (Facultatif pour l’analyse du NAD(P)H) Choisissez n’importe quelle image liée à un jeu de données et utilisez l’option Dessiner le curseur de rapport pour deux composants pour localiser avec précision la position de 0,45 ns sur un cercle universel d’un espace de tracé de phaseur standard. Cette position sera attribuée à une durée de vie moyenne de fluorescence d’une solution homogène pure de NAD(P)H libre, qui est normalement proche de la désintégration mono-exponentielle⁶².
      REMARQUE : Le NADH libre et le NAD(P)H libre ont des propriétés spectrales similaires et des valeurs similaires de durée de vie de fluorescence dans une solution aqueuse, avec deux composants à courte durée de vie, 0,3 ns et 0,7 ns⁶³. Ainsi, pour la simplicité de l’analyse basée sur le phaseur et en raison d’une petite différence entre les composantes de la durée de vie, leur décroissance de fluorescence est acceptée comme étant mono-exponentielle, ce qui permet d’attribuer le nuage de phaseur sur un cercle universel. La durée de vie moyenne de référence d’une forme de NAD(P)H libre peut également être mesurée et tracée dans un espace de phaseur pour une analyse similaire. La durée de vie de référence a été choisie sur la base de la littérature⁶² ; notez que dans d’autres sources, on peut trouver une valeur légèrement différente d’un NAD(P)H libre en solution (0,4 ns⁶⁴).
   4. (Facultatif pour l’analyse du NAD(P)H) Exportez le tracé de phaseur avec la durée de vie libre NAD(P)H allouée (voir étape 2.3.3) en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le graphique et en sélectionnant Exporter les données. Exportez le tracé du phaseur sous forme de fichier au format .tiff vers un dossier de stockage désigné.
      REMARQUE : La taille en pixels d’origine de l’image du tracé de phaseur exportée à partir du module LAS X FLIM est toujours de 1024 x 600 pixels. Si un autre logiciel est utilisé pour l’exportation et la pré-analyse des données, assurez-vous que toutes les images du tracé du phaseur sont exportées avec la même taille et la même résolution.
   5. Pour exporter un nuage de phaseurs lié à un sphéroïde, utilisez l’outil Dessiner le curseur du module LAS X FLIM pour choisir la ROI du sphéroïde sur l’image. Exportez le tracé de phaseur généré comme indiqué à l’étape 2.3.4.
      REMARQUE : Les coordonnées g et s correspondantes (similaires à x et y) de l’espace de phaseur seront attribuées à chaque pixel du ROI choisi, en fonction de leur durée de vie, transformé en un ensemble de données de domaine fréquentiel^64,65. Le groupe de pixels avec des valeurs similaires de t_f (durée de vie de la phase) et t_m (durée de vie de la modulation) formera un motif de nuage (nuage de phase) sur un graphique, où le codage couleur (avec une plage allant du bleu profond au rouge) reflétera l’abondance des valeurs de durée de vie. Par la position du nuage sur un cercle universel ou à l’intérieur, les décroissances mono- ou multi-exponentielles peuvent être distinguées. Certains milieux de mesure présentent une forte (auto)fluorescence, conduisant à l’apparition d’un nuage correspondant sur un tracé de phaseur, qui ne peut pas être simplement éliminé avec le seuil de moyen d’intensité. Ce motif influencera le calcul des coordonnées du centroïde et doit être exclu du tracé de phaseur exporté. L’utilisation du retour sur investissement du sphéroïde permet d’exclure les pixels non liés de l’analyse ultérieure du phaseur.
   6. Répétez la procédure d’exportation du tracé de phaseur pour tous les ROI de sphéroïdes dans un ensemble de données (voir les étapes 2.3.4 et 2.3.6). De plus, vérifiez l’ensemble des images .tiff exportées pour garantir l’ensemble des données pour une analyse comparative plus approfondie et assurez-vous que toutes les images exportées ont la même taille de pixel (voir REMARQUE à l’étape 2.3.4).
      REMARQUE : À ce stade du protocole, l’ensemble d’images doit inclure le phaseur avec l’emplacement du NAD(P)H libre (basé sur la littérature ou les données obtenues empiriquement) et tous les tracés de phaseur de ROI sphéroïdes (ou d’autres modèles de ROI si nécessaire pour l’analyse spécifique). À partir de cette étape, une analyse plus approfondie sera effectuée aux FIDJI et par la suite dans une feuille de calcul. À l’aide de la fenêtre d’outils Analyser , définissez l’option Échelle dans FIJI et assurez-vous que toutes les images du tracé de phaseur sont calibrées avec le même type d’unité, par exemple, uniquement en pixels. Si ce n’est pas le cas, définissez l’unité de longueur dans la fenêtre Définir l’échelle pour l’unité choisie (par exemple, pour une échelle basée sur les pixels, mettez 1 dans le champ Distance en pixels et définissez l’unité de longueur sur Pixel). Pour une comparaison plus approfondie, mesurez toutes les données exportées à l’aide du même type d’unité.
   7. (Facultatif pour l’analyse du NAD(P)H) Déterminer la position du point de pixel d’une durée de vie moyenne de fluorescence en NAD(P)H libre sur l’image correspondante du tracé de phaseur exporté (voir étape 2.3.3) : Ouvrez l’image du phaseur avec FIJI, agrandissez l’image pour visualiser clairement, avec une résolution de pixel, l’intersection entre le demi-cercle universel et la ligne du curseur de rapport pour deux composants ; utilisez l’outil ROI Rectangle pour sélectionner l’intersection.
      REMARQUE : Assurez-vous que la sélection rectangulaire se trouve dans une petite zone autour du point d’intersection pour déterminer avec précision ses coordonnées à l’étape suivante (étape 2.3.9).
   8. (Facultatif pour l’analyse du NAD(P)H) Ouvrez l’outil Analyser , choisissez la fenêtre Définir les mesures , puis sélectionnez Centroid comme paramètre de mesure. Cliquez sur Mesurer dans la fenêtre de l’outil Analyser pour déterminer les coordonnées du centroïde du point de référence NAD(P)H libre. Exportez ces coordonnées vers une feuille de calcul.
      REMARQUE : Les coordonnées NAD(P)H libres seront utilisées comme point de référence pour comparer les distances entre ce point et la position du nuage de phasor sphéroïde dans un ensemble de données (la façon de caractériser le décalage métabolique entre la glycolyse et l’OxPhos dans l’analyse d’autofluorescence NAD(P)H FLIM)
   9. À l’aide de FIJI, ouvrez l’image du nuage de phaseurs sphéroïdes. Ouvrez l’outil Fenêtre d’image , choisissez Ajuster, puis sélectionnez Seuil de couleur dans la barre d’outils. Sélectionnez la méthode de seuillage de votre choix (par exemple, Otsu) et définissez la valeur de teinte et la valeur de luminosité pour affiner les paramètres de sélection d’une pièce de nuage de phaseur avec les coordonnées de pixels les plus abondantes. Cliquez sur Sélectionner pour définir la zone du cluster.
      REMARQUE : Conservez les mêmes paramètres de seuil pour toutes les images de tracé de phaseur, qui doivent être analysées. Pour les données NAD(P)H-FLIM présentées, la méthode de seuillage Otsu avec une valeur de teinte de 9 et une valeur de luminosité de 160 a été choisie et appliquée à toutes les images de phaseur. Alternativement, la zone sélectionnée peut être copiée dans le gestionnaire de retour sur investissement (suivez le chemin Modifier > Sélection > Ajouter au gestionnaire) pour créer une bibliothèque de retours sur investissement de phaseur pour une analyse plus approfondie.
   10. Tout en conservant la sélection, calculez les coordonnées du centroïde de la zone sélectionnée en suivant la procédure décrite à l’étape 2.3.9. Exportez ces coordonnées dans le fichier de tableur.
   11. Répétez les étapes 2.3.9 et 2.3.10 pour déterminer les coordonnées du centroïde de toutes les images de phaseur de retour sur investissement afin de créer un ensemble de données dans la feuille de calcul.
       REMARQUE : L’utilisation de la bibliothèque ROI Manager permet de simplifier et d’organiser l’analyse du ROI (voir étape 2.3.10)
   12. (Facultatif pour l’analyse du NAD(P)H) Ouvrez la feuille de calcul avec les coordonnées de référence de NAD(P)H et les ROI sphéroïdes exportés de différents groupes de comparaison. Calculer la distance entre chaque centroïde de phaseur de sphéroïde et la position de référence du NAD(P)H libre à l’aide des coordonnées déterminées et de l’équation suivante :
       
       Où X_c et Y_c sont les coordonnées du centroïde, X_f et Y_f sont les coordonnées de référence.
       REMARQUE : L’application du paramètre centroïde pour déterminer le décalage vers la durée de vie de référence n’est appropriée que si tous les centroïdes d’un ensemble de données se trouvent sur la même trajectoire linéaire vers le point de référence. Pour vérifier cela, tous les points de centroïde de l’ensemble de données doivent être tracés avec le point de référence dans le même espace de coordonnées, et l’alignement de tendance linéaire doit être effectué. Si le coefficient R² de la droite de tendance linéaire tracée par tous les points est proche de 1 (par exemple, R² est compris entre 0,8 et 0,99), l’analyse de distance est considérée comme appropriée.
   13. Organisez toutes les données en conséquence pour la comparaison et effectuez des analyses statistiques à l’aide de tout logiciel correspondant (par exemple, Origin, MatLab). Choisissez le test statistique approprié en fonction des caractéristiques de l’ensemble de données (normalité de distribution, nombre d’unités statistiques, etc.).
       REMARQUE : Pour l’analyse NAD(P)H, comparer les valeurs de distance afin de caractériser le décalage métabolique en fonction des conditions expérimentales. Pour comparer les tracés de phaseur entre les groupes expérimentaux, effectuez la comparaison des coordonnées des centroïdes du nuage de phaseur ROI.

Résultats

Choisir la méthode de formation de sphéroïde appropriée
La méthode de formation des sphéroïdes choisie peut grandement influencer la taille, la forme, la densité cellulaire, la viabilité et la sensibilité aux médicaments des sphéroïdes (Figure 2). Auparavant, les effets de plusieurs méthodes à haut débit (SphericalPlate 5D, micromoules fabriqués en laboratoire et moules MicroTissue) et à faible fixation à « débit moyen » (plaques à 96 puits revêtue...

Discussion

Les sphéroïdes multicellulaires deviennent une méthode de choix dans l’étude des microenvironnements de niche des tumeurs et des cellules souches, la découverte de médicaments et le développement des « éléments constitutifs tissulaires » pour la biofabrication. L’architecture interne hétérogène des sphéroïdes, les gradients de nutriments et l’oxygénation peuvent imiter ceux des tissus et des tumeurs in vivo dans un cadre relativement simplifié et accessible. Avec la nécessité d’une ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Also available from Sigma
10 mL serological pipets	VWR	612-3700	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
12 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	665-180	Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable	Ibidi	81201	Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes	Nerbe plus	02-502-3001	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3D Petri Dish micromolds	Microtissue	Z764000-6EA
6 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	657160	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
70% ethanol	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation
Calcein Green-AM	Tebubio	AS-89201	Apply in dilution 1:1000
CellSens Dimension software	Olympus	version 3
Collagen from human placenta, type IV	Sigma	C5533	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Confocal FLIM Microscope	Leica Microsystems	N/A	Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective
D(+)-Glucose	Merck	8342	Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	For preparation of imaging medium
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-098	Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Human colon cancer cells HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	version 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	version 4.6.1.27508
L-glutamine	Gibco	25030	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES	VWR	392-0420	Standard growth medium for HCT116 cells
micro-patterned 3D-printed PDMS stamps	N/A	N/A	Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Neubauer couting chamber	Fisher Scientific	15980396
O2 probes: MMIR1	N/A	N/A	Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution	Gibco	15140-122	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5mg	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	25535-16-4	Cell death staining, use 1 µg/mL at 1h incubation
PVDF syringe filter 0.22 µm	Novolab	A35149	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SphericalPlate 5D 24-well	Kugelmeiers	SP5D-24W
sterile petridish	Greiner bio-one	633181	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (25 cm² )	VWR	734-2311	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (75 cm²)	VWR	734-2313	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
U-bottom 96-well plate	VWR	10062-900	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope	Olympus	N/A	Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water