Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Özet

Burada, takip çok parametreli canlı hücre mikroskobu gerçekleştirmek için farklı çok hücreli sferoid oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz. Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), hücresel otofloresan, boyama boyaları ve nanopartiküller kullanılarak, canlı üç boyutlu (3D) kanser ve kök hücre türevli sferoidlerde hücre metabolizması, hipoksi ve hücre ölümünün analizi için yaklaşım gösterilmiştir.

Özet

Çok hücreli tümör sferoidleri, tümör mikroçevresini yeniden üretmek, ilaç tedavilerini test etmek ve optimize etmek ve biyo ve nanosensörleri 3D bağlamda kullanmak için popüler bir 3D doku mikroagregat modelidir. Üretim kolaylığı, öngörülebilir boyutları, büyümeleri ve gözlemlenen besin ve metabolit gradyanları, 3B niş benzeri hücre mikro ortamını özetlemek için önemlidir. Bununla birlikte, sferoid heterojenliği ve üretim yöntemlerinin değişkenliği, genel hücre metabolizmasını, canlılığını ve ilaç yanıtını etkileyebilir. Bu, kök ve kanser hücresi biyolojisinde in vitro 3D doku modellerinde olduğu gibi boyut, değişkenlik, biyofabrikasyon ihtiyaçları ve kullanım gereksinimleri göz önüne alındığında en uygun metodolojiyi seçmeyi zorlaştırır. Özellikle, sferoid üretimi, optik metabolik görüntüleme, floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), nanosensörlerle küresel hipoksinin izlenmesi veya canlılık gibi kantitatif canlı mikroskoplarla uyumluluklarını etkileyebilir. Burada, canlı geniş alan, konfokal ve iki fotonlu mikroskoplarla uyumluluklarını vurgulayan bir dizi geleneksel sferoid oluşum protokolü sunulmaktadır. Çoğullanmış otofloresan FLIM ile ve çeşitli kanser türleri ve kök hücre sferoidleri kullanılarak analiz hattına yönelik takip görüntülemesi de sunulmaktadır.

Giriş

Çok hücreli sferoidler, hücrelerin kendi kendine toplanmasıyla elde edilen ve küresel bir şekil sergileyen bir grup 3B doku modelini temsil eder. Hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimini in vitro olarak taklit etmek ve çok sayıda kanser ve kök hücre türevi yapı içinde 3B bir bağlamı yeniden üretmek için yaygın olarak kullanılırlar. Hücre bağlanmasını azaltmak ve agregasyonu teşvik etmek için çeşitli teknikler kullanılır. Bunlar, yüzey gerilimine¹ dayanan asılı-damla yöntemini; ultra düşük bağlantı plakaları, mikro kalıplar ve mikro kuyular gibi hücre bağlanma itme yöntemleri ^2,3

Protokol

1. Çok hücreli sferoidlerin oluşumu

1. Hücre kültürü
   NOT: Hücre kültürleri, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich veya diğer satıcılardan toplanabilir. ATCC, tercih edilen büyüme ortamı, alt kültürleme prosedürleri, biyogüvenlik seviyesi, büyüme oranı ve STR profilleri dahil olmak üzere gerekli tüm kullanım bilgilerini sağlar. Burada, McCoy'un 5A ortamında (VWR, 392-0420) %10 FBS ve 1 mM Sodyum Piruvat ile desteklenmiş 500 hücre / sferoid insan kolon kanseri hücre hattı HCT116 kullanılır. Günlük olarak izlenen uzun süreli deneyler için ortama 10 mM HEPES, pH 7.2 eklenebilir.
   1. % 70 -% 90 birleşmeye ulaşmak için h....

Tartışmalar

Çok hücreli sferoidler, tümör ve kök hücre niş mikro çevreleri, ilaç keşfi ve biyofabrikasyon için 'doku yapı taşlarının' geliştirilmesi çalışmalarında tercih edilen bir yöntem haline gelmektedir. Sferoidlerin heterojen iç mimarisi, besin gradyanları ve oksijenasyon, nispeten basitleştirilmiş ve erişilebilir bir ortamda in vivo doku ve tümörlerinkini taklit edebilir. Daha fazla metodolojik şeffaflığa ^26,28 ve standardizasyona⁷¹

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Also available from Sigma
10 mL serological pipets	VWR	612-3700	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
12 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	665-180	Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable	Ibidi	81201	Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes	Nerbe plus	02-502-3001	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3D Petri Dish micromolds	Microtissue	Z764000-6EA
6 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	657160	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
70% ethanol	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation
Calcein Green-AM	Tebubio	AS-89201	Apply in dilution 1:1000
CellSens Dimension software	Olympus	version 3
Collagen from human placenta, type IV	Sigma	C5533	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Confocal FLIM Microscope	Leica Microsystems	N/A	Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective
D(+)-Glucose	Merck	8342	Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	For preparation of imaging medium
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-098	Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Human colon cancer cells HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	version 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	version 4.6.1.27508
L-glutamine	Gibco	25030	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES	VWR	392-0420	Standard growth medium for HCT116 cells
micro-patterned 3D-printed PDMS stamps	N/A	N/A	Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Neubauer couting chamber	Fisher Scientific	15980396
O2 probes: MMIR1	N/A	N/A	Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution	Gibco	15140-122	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5mg	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	25535-16-4	Cell death staining, use 1 µg/mL at 1h incubation
PVDF syringe filter 0.22 µm	Novolab	A35149	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SphericalPlate 5D 24-well	Kugelmeiers	SP5D-24W
sterile petridish	Greiner bio-one	633181	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (25 cm² )	VWR	734-2311	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (75 cm²)	VWR	734-2313	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
U-bottom 96-well plate	VWR	10062-900	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope	Olympus	N/A	Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water