A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
تصف هذه الطريقة بروتوكول التألق المناعي وخط أنابيب القياس الكمي لتقييم توزيع البروتين مع أنماط تنظيم نووية متنوعة في الخلايا الليمفاوية التائية البشرية. يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة ، بدءا من إعداد العينات والاستمرار في تنفيذ التحليل شبه الآلي في فيجي ، وينتهي بمعالجة البيانات بواسطة دفتر ملاحظات Google Colab.
تحدث العمليات النووية المختلفة ، مثل التحكم في النسخ ، داخل هياكل منفصلة تعرف باسم البؤر التي يمكن تمييزها من خلال تقنية التألق المناعي. إن التحقيق في ديناميكيات هذه البؤر في ظل ظروف خلوية متنوعة عبر الفحص المجهري يعطي رؤى قيمة حول الآليات الجزيئية التي تحكم الهوية الخلوية ووظائفها. ومع ذلك ، فإن إجراء فحوصات التألق المناعي عبر أنواع مختلفة من الخلايا وتقييم التغيرات في تجميع هذه البؤر ونشرها وتوزيعها يمثل العديد من التحديات. تشمل هذه التحديات تعقيدات في إعداد العينات ، وتحديد المعلمات لتحليل بيانات التصوير ، وإدارة أحجام البيانات الكبيرة. علاوة على ذلك ، غالبا ما يتم تصميم مهام سير عمل التصوير الحالية للمستخدمين الأكفاء ، مما يحد من إمكانية الوصول إلى جمهور أوسع.
في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكول تألق مناعي محسن مصمم خصيصا للتحقيق في البروتينات النووية في أنواع مختلفة من الخلايا التائية الأولية البشرية التي يمكن تخصيصها لأي بروتين مهم ونوع الخلية. علاوة على ذلك ، نقدم طريقة لقياس تلطيخ البروتين بشكل غير متحيز ، سواء كانت تشكل بؤرا متميزة أو تظهر توزيعا نوويا منتشرا.
تقدم طريقتنا المقترحة دليلا شاملا ، من التلوين الخلوي إلى التحليل ، والاستفادة من خط أنابيب شبه آلي تم تطويره في Jython وقابل للتنفيذ في فيجي. علاوة على ذلك ، نقدم نصا برمجيا سهل الاستخدام من Python لتبسيط إدارة البيانات ، ويمكن الوصول إليه بشكل عام على دفتر ملاحظات Google Colab. وقد أثبت نهجنا فعاليته في إنتاج تحليلات عالية الإثراء للبروتينات ذات الأنماط المتنوعة للتنظيم النووي عبر سياقات مختلفة.
يخضع تنظيم الجينوم حقيقي النواة لطبقات متعددة من التعديلات اللاجينية1 ، وتنسيق العديد من الوظائف النووية التي يمكن أن تحدث داخل مقصورات متخصصة تسمى الأجسام النووية أو المكثفات2. ضمن هذه الهياكل ، تتم عمليات مثل بدء النسخ3 ، ومعالجة الحمض النووي الريبي4،5،6 ، وإصلاح الحمض النووي7،8 ، والتكوين الحيوي للريبوسوم9،10،11 ، وتنظيم heterochromatin
تمت الموافقة على استخدام العينات البشرية لأغراض البحث من قبل لجان الأخلاقيات التابعة لمؤسسة معهد البحوث والوقاية العلمية (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (ميلانو) ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الموضوعات (أرقام الترخيص: 708_2020). يتم تنظيم البروتوكول في ثلاثة أقسام أساسية: تنفيذ التألق المناعي ، والحصول على الصور ، وتحليل الصور. في المتوسط ، يتطلب الأمر 4 أيام عمل ليتم إكمالها (الشكل 1).
1. إعداد المناعي
ملاحظة: يمكن تخصيص بروتوكول التألق المناعي هذا بسهولة لأنواع الخلايا المختلفة وأهداف البروتين عن طريق ضبط ظروف التثبيت والنفاذية. عادة ما يستغ....
يسهل البروتوكول المبين في هذه الطريقة تصور وقياس التغيرات في تلطيخ البروتين النووي داخل الخلايا التائية الأولية البشرية ، ويمكن تخصيصه لأنواع الخلايا المتنوعة وأهداف البروتين. كدراسات حالة ، أجرينا وحللنا تلطيخ BRD4 و SUZ12 في الخلايا الساذجة و TH1 CD4 + .
يعرض BRD4 نمط ت.......
في هذه الدراسة ، نقدم طريقة لإجراء تجارب التألق المناعي على البروتينات النووية في الخلايا الليمفاوية التائية البشرية. توفر هذه الطريقة مرونة للاستخدام مع أنواع الخلايا المختلفة من خلال تعديلات طفيفة في خطوات التثبيت والنفاذية ، كما هو موضح سابقا30,31.
RV لديها تعاون علمي مع بدء التشغيل T-One Therapeutics Srl. B.B. و F.M. هما مؤسسان مشاركان لشركة T-One Therapeutics Srl الناشئة. يعمل E.P. حاليا من قبل T-One Therapeutics Srl. يعلن جميع المؤلفين الآخرين أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
نحن نعترف بالمساعدة العلمية والتقنية التي قدمها مرفق التصوير INGM ، ولا سيما C. Cordiglieri و A. Fasciani ، ومرفق الفرز INGM FACS على وجه الخصوص M.C Crosti (المعهد الوطني للجينات Molecolare 'Romeo ed Enrica Invernizzi' (INGM) ، ميلانو ، إيطاليا). نعرب عن تقديرنا للسيد جياناكاري لدعمه المعلوماتي التقني. تم تمويل هذا العمل من خلال المنح التالية: مؤسسة كاريبلو (باندو جيوفاني ، منحة رقم 2018-0321) ومؤسسة AIRC (منحة رقم MFAG 29165) إلى F.M. Ricerca Finalizzata ، (منحة رقم GR-2018-12365280) ، مؤسسة AIRC (منحة رقم 2022 27066) ، مؤسسة كاريبلو (منحة رقم 2019-3416) ، مؤسسة إقليمية للبحوث الحيوية (FRRB CP2_12/2018) ،) البيانو الوطني للريبريزا و Resilienza (منحة رقم G43C220026200....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Safe-Lock Tubes | Eppendord | #0030121503 | Protocol section 1 |
10 mL Serological pipettes | VWR | #612-3700 | Protocol section 1 |
20 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2149P-HR | Protocol section 1 |
50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | #352070 | Protocol section 1 |
200 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2069-HR | Protocol section 1 |
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia | Invitrogen | #P36984 | Step 1.3.12 |
BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | #A7030 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | #130-096-533 | Step 1.1.2. |
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | Cat#D1306 | Step 1.3.10. |
Dry ice | Step 1.3.1. | ||
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead | Life Technologies | #1131D | magnetic beads step 1.1.4. |
EtOH | Carlo Erba | #4146320 | Step 1.2.1.1. |
FACSAria SORP | BD Bioscences | Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | #10270106 | Step 1.1.4 |
FICOLL PAQUE PLUS | Euroclone | GEH17144003F32 | Step 1.1.1. |
FIJI Version 2.14.0 | - | - | Protocol section 3 |
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H) | Electron Microscopy Sciences | #72298-13 | Step 1.2.1. |
Glycerol | Sigma | #G5516 | Step 1.2.7-1.3.1. |
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Step 1.3.8. |
HCl | Sigma | #320331 | Step 1.3.4. |
human neutralizing anti-IL-4 | Miltenyi Biotec | Cat#130-095-753 | Step 1.1.4. |
human recombinant IL-12 | Miltenyi Biotec | Cat#130-096-704 | Step 1.1.4. |
human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | Cat#130-097-744 | Step 1.1.4. |
Leica TCS SP5 Confocal microscope | Leica Microsystems | - | Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel. |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | #11140035 | Step 1.1.4. |
Microscope Slides | VWR | #631-1552 | Step 1.3.12. |
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone) | BD Bioscience | #557871 | Step 1.1.3. |
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone) | BD Bioscience | #552888 | Step 1.1.3. |
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone) | Miltenyi Biotec | #130-113-546 | Step 1.1.3. |
Multiwell 24 well | Falcon | #353047 | Protocol section 1 |
Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
PBS | Life Technologies | #14190094 | Protocol section 1 |
Penicillin/Streptomycin solution | Life Technologies | #15070063 | Step 1.1.4. |
PFA | Sigma | #P6148 | Step 1.2.4. |
poly-L-lysine | Sigma | #P8920 | 1.2.1. |
Primary antibody - BRD4 | Abcam | #ab128874 | Step 1.3.6. |
Primary antibody - SUZ12 | Cel Signalling | mAb #3737 | Step 1.3.6. |
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I | Life Technologies | #61870010 | Step 1.1.4. |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | #11360039 | Step 1.1.4. |
Triton X-100 | Sigma | #T8787 | Step 1.2., 1.3. |
TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | Step 1.3. |
Tweezers | - | - | Protocol section 1 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved