Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الطريقة بروتوكول التألق المناعي وخط أنابيب القياس الكمي لتقييم توزيع البروتين مع أنماط تنظيم نووية متنوعة في الخلايا الليمفاوية التائية البشرية. يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة ، بدءا من إعداد العينات والاستمرار في تنفيذ التحليل شبه الآلي في فيجي ، وينتهي بمعالجة البيانات بواسطة دفتر ملاحظات Google Colab.

Abstract

تحدث العمليات النووية المختلفة ، مثل التحكم في النسخ ، داخل هياكل منفصلة تعرف باسم البؤر التي يمكن تمييزها من خلال تقنية التألق المناعي. إن التحقيق في ديناميكيات هذه البؤر في ظل ظروف خلوية متنوعة عبر الفحص المجهري يعطي رؤى قيمة حول الآليات الجزيئية التي تحكم الهوية الخلوية ووظائفها. ومع ذلك ، فإن إجراء فحوصات التألق المناعي عبر أنواع مختلفة من الخلايا وتقييم التغيرات في تجميع هذه البؤر ونشرها وتوزيعها يمثل العديد من التحديات. تشمل هذه التحديات تعقيدات في إعداد العينات ، وتحديد المعلمات لتحليل بيانات التصوير ، وإدارة أحجام البيانات الكبيرة. علاوة على ذلك ، غالبا ما يتم تصميم مهام سير عمل التصوير الحالية للمستخدمين الأكفاء ، مما يحد من إمكانية الوصول إلى جمهور أوسع.

في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكول تألق مناعي محسن مصمم خصيصا للتحقيق في البروتينات النووية في أنواع مختلفة من الخلايا التائية الأولية البشرية التي يمكن تخصيصها لأي بروتين مهم ونوع الخلية. علاوة على ذلك ، نقدم طريقة لقياس تلطيخ البروتين بشكل غير متحيز ، سواء كانت تشكل بؤرا متميزة أو تظهر توزيعا نوويا منتشرا.

تقدم طريقتنا المقترحة دليلا شاملا ، من التلوين الخلوي إلى التحليل ، والاستفادة من خط أنابيب شبه آلي تم تطويره في Jython وقابل للتنفيذ في فيجي. علاوة على ذلك ، نقدم نصا برمجيا سهل الاستخدام من Python لتبسيط إدارة البيانات ، ويمكن الوصول إليه بشكل عام على دفتر ملاحظات Google Colab. وقد أثبت نهجنا فعاليته في إنتاج تحليلات عالية الإثراء للبروتينات ذات الأنماط المتنوعة للتنظيم النووي عبر سياقات مختلفة.

Introduction

يخضع تنظيم الجينوم حقيقي النواة لطبقات متعددة من التعديلات اللاجينية1 ، وتنسيق العديد من الوظائف النووية التي يمكن أن تحدث داخل مقصورات متخصصة تسمى الأجسام النووية أو المكثفات2. ضمن هذه الهياكل ، تتم عمليات مثل بدء النسخ3 ، ومعالجة الحمض النووي الريبي4،5،6 ، وإصلاح الحمض النووي7،8 ، والتكوين الحيوي للريبوسوم9،10،11 ، وتنظيم heterochromatin12،13. يتكيف تنظيم الأجسام النووية على كل من الأبعاد المكانية والزمانية لاستيعاب المتطلبات الخلوية ، مسترشدا بمبادئ فصل الطور14,15. وبالتالي ، تعمل هذه الهيئات كمصانع عابرة حيث تتجمع المكونات الوظيفية وتفكك ، وتخضع لتغييرات في الحجم والتوزيع المكاني. ومن ثم ، فإن فهم خصائص البروتينات النووية عن طريق الفحص المجهري ، بما في ذلك ميلها لتشكيل الأجسام وترتيبها المكاني في الظروف الخلوية المختلفة ، يوفر رؤى قيمة حول أدوارها الوظيفية. الفحص المجهري الفلوري هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع لدراسة البروتينات النووية ، مما يسمح باكتشافها من خلال الأجسام المضادة الفلورية أو التعبير المباشر عن الأهداف باستخدام مراسل بروتين الفلورسنت16,17.

في هذا السياق ، تظهر الأجسام النووية كبؤر ساطعة أو نقاط ، مع درجة ملحوظة من الكروية ، مما يسهل تمييزها عن البيئة المحيطة16,18. تتيح التقنيات فائقة الدقة مثل STORM و PALM ، من خلال توفير دقة محسنة (تصل إلى 10 نانومتر) 19 ، توصيفا أكثر دقة لهيكل وتكوين مكثفات محددة20. ومع ذلك ، فإن إمكانية الوصول إليها محدودة بسبب نفقات المعدات والمهارات المتخصصة اللازمة لتحليل البيانات. لذلك ، يظل الفحص المجهري متحد البؤر شائعا نظرا لتوازنه الإيجابي بين الدقة والاستخدام الأوسع. يتم تسهيل هذه الشعبية من خلال الإزالة المتأصلة للضوء خارج التركيز البؤري ، مما يقلل من الحاجة إلى إجراءات ما بعد المعالجة المكثفة للتجزئة الدقيقة ، وتوافره على نطاق واسع في معاهد البحوث ، ووقت اكتسابه الفعال ، وإعداد العينات الذي عادة ما يكون فعالا. ومع ذلك ، فإن القياس الدقيق لتوزيع البروتين أو تجميعه أو انتشاره باستخدام مقايسات التألق المناعي عبر الظروف الخلوية المتنوعة يشكل تحديات ، حيث تفتقر العديد من الطرق الحالية إلى إرشادات حول اختيار المعلمات المناسبة للبروتينات ذات أنماط التوزيع المختلفة21. علاوة على ذلك ، قد يكون التعامل مع حجم البيانات الكبير الناتج أمرا شاقا للمستخدمين ذوي الخبرة المحدودة في تحليل البيانات ، مما قد يضر بالأهمية البيولوجية للنتائج.

لمواجهة هذه التحديات ، نقدم بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لإعداد التألق المناعي وتحليل البيانات ، بهدف توفير طريقة غير متحيزة لقياس تلطيخ البروتين بأنماط تنظيمية مختلفة (الشكل 1). تم تصميم هذا المسار شبه الآلي للمستخدمين ذوي الخبرة المحدودة في التحليل الحسابي والتصويري. فهو يجمع بين وظائف اثنين من المكونات الإضافية فيجي المعمول بها: FindFoci22 و 3D جناح23. من خلال دمج قدرة تحديد البؤر الدقيقة ل FindFoci مع ميزات تحديد الكائنات والتجزئة في مساحة ثلاثية الأبعاد التي توفرها مجموعة 3D ، يقوم نهجنا بإنشاء ملفين CSV لكل قناة لكل مجال اكتساب. تحتوي هذه الملفات على معلومات تكميلية تسهل حساب المقاييس المناسبة لأنواع مختلفة من توزيع الإشارات ، مثل عدد البؤر لكل خلية ، ومسافة البؤر من المركز النووي ، ومعامل عدم التجانس (IC) ، الذي قدمناه لتلطيخ البروتين المنتشر. بالإضافة إلى ذلك ، نقر بأن استقراء البيانات يمكن أن يستغرق وقتا طويلا للمستخدمين ذوي المهارات المحدودة في معالجة البيانات. لتبسيط هذه العملية ، نقدم برنامج Python النصي الذي يجمع تلقائيا جميع القياسات التي تم جمعها في ملف واحد لكل تجربة. يمكن للمستخدمين تنفيذ هذا البرنامج النصي دون الحاجة إلى تثبيت أي برنامج لغة برمجة. نحن نقدم رمزا قابلا للتنفيذ على Google Colab ، وهو نظام أساسي قائم على السحابة يسمح بكتابة نصوص Python مباشرة في المتصفح. هذا يضمن أن طريقتنا بديهية ويمكن الوصول إليها بسهولة للاستخدام الفوري.

لقد أثبتنا فعالية بروتوكولنا في تحليل وقياس التغيرات في توزيع الإشارات لبروتينين نوويين: البروتين 4 المحتوي على البرومودومين (BRD4) ومثبط zeste-12 (SUZ12). BRD4 هو بروتين منشط موثق جيدا داخل مجمع الوسيط المعروف بتكوين المكثفات المرتبطة ببدء النسخ المعتمد على البلمرةII 24,25. SUZ12 هو مكون بروتيني في مجمع Polycomb القمعي 2 (PRC2) المسؤول عن تنظيم ترسب تعديل هيستون H3K27me326,27. تظهر هذه البروتينات أنماطا مختلفة داخل نوعين متميزين من الخلايا: الخلايا التائية البشرية الساذجة CD4 + المعزولة حديثا ، والتي تكون هادئة وتظهر معدلات بطيئة من نشاط النسخ ، وخلايا TH1 CD4 + المتمايزة في المختبر ، وهي خلايا مستجيبة متخصصة ومتكاثرة تظهر زيادة النسخ28.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام العينات البشرية لأغراض البحث من قبل لجان الأخلاقيات التابعة لمؤسسة معهد البحوث والوقاية العلمية (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (ميلانو) ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الموضوعات (أرقام الترخيص: 708_2020). يتم تنظيم البروتوكول في ثلاثة أقسام أساسية: تنفيذ التألق المناعي ، والحصول على الصور ، وتحليل الصور. في المتوسط ، يتطلب الأمر 4 أيام عمل ليتم إكمالها (الشكل 1).

1. إعداد المناعي

ملاحظة: يمكن تخصيص بروتوكول التألق المناعي هذا بسهولة لأنواع الخلايا المختلفة وأهداف البروتين عن طريق ضبط ظروف التثبيت والنفاذية. عادة ما يستغرق تحضير التألق المناعي أقل من 3 أيام حتى يكتمل ، مع اختلاف مدة حضانة الأجسام المضادة الأولية بناء على جودة الجسم المضاد والبروتين المستهدف (الشكل 1).

  1. إعداد العينة
    1. عزل خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية (PBMCs) من خلال جهاز طرد مركزي متدرج الكثافة عبر وسط يبلغ كثافته حوالي 1.077 جم / مل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
    2. عزل خلايا CD4 + T من PBMCs بالخرز المغناطيسي ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
    3. قم بتلطيخ الخلايا ذات الأجسام المضادة ل CD4 و CD45RA و CD45RO (جدول المواد) والمضي قدما في فرز FACS للخلايا التائية CD4 + الساذجة مثل خلايا CD4 + / CD45RA+ / CD45RO ، كما هو موضح في مكان آخر 29,30.
      ملاحظة: انظر جدول المواد للاطلاع على مواصفات فارز FACS المستخدم في هذا البروتوكول.
    4. حث على تمايز الخلايا التائية CD4 + الساذجة إلى الخلايا التائية المساعدة 1 (خلايا TH1 CD4 + ) كما هو موضح في 29. باختصار ، قم بزراعة 1.5 × 106 خلايا / مل من خلايا CD4 + T الساذجة المصنفة من قبل FACS في وسط TH1 لتحفيزها بخرز مغناطيسي مضاد ل CD3 / مضاد CD28 بنسبة 1: 1. عد الخلايا وقسمها عندما تصل إلى 1.5 × 106 خلايا / مل كل 2-3 أيام (انظر الجدول 1 للتكوين المتوسط TH1).
    5. تقييم إفراز السيتوكينات وظيفة المستجيب بعد 7 أيام من التمايز ، كما هو موضح في 29.
  2. تثبيت الخلايا ونفاذية
    ملاحظة: تم وصف جميع هذه الإجراءات في 30،31 مع تعديلات طفيفة.
    1. لضمان التصاق الخلية الأمثل ، عالج أغطية الزجاج (10 مم ، سمك 1.5 ساعة) بمحلول طلاء (الجدول 1) على النحو التالي:
      1. نظف أغطية الزجاج عن طريق غسلها في البداية بالماء المقطر (ddH2O) ، متبوعا بشطفها بنسبة 70٪ من الإيثانول (EtOH) ، والسماح لها بالجفاف في الهواء.
      2. ضع أغطية الغطاء المغسولة في لوحة متعددة الآبار مكونة من 24 بئرا للخطوات 1.2.1.3-1.3.
      3. ضع قطرة 200 ميكرولتر من محلول الطلاء على غطاء الغطاء الزجاجي. بعد 5 دقائق ، قم بإزالة القطرة واتركها تجف في الهواء.
      4. اغسل أغطية الغطاء عن طريق وضع قطرة 200 ميكرولتر من ddH2O. بعد 5 دقائق ، قم بإزالة القطرة وجففها في الهواء.
      5. كرر 3 خطوات 1-2-1-3-1-1-1-4.
    2. إعادة تعليق الخلايا التائية CD4 + الساذجة وخلايا TH1 CD4 + في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بتركيز 2 × 106 خلايا / مل.
      ملاحظة: ينصح بالتركيز المشار إليه على وجه التحديد للخلايا الصغيرة مثل الخلايا الليمفاوية التائية الأولية البشرية. بالنسبة للخلايا الملتصقة ، فإن معالجة طلاء الزجاج غير ضرورية. بدلا من ذلك ، تابع مباشرة زراعة الخلايا على السطح الزجاجي باستخدام وسط زراعة الخلايا المناسب.
    3. ضع قطرة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية على زلة الغطاء الزجاجي. اترك الخلايا تزرع في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة ؛ ثم قم بإزالة القطرة.
    4. ثبت الخلايا باستخدام بارافورمالدهيد المصفى حديثا بنسبة 3٪ (محلول PFA ، الجدول 1) لمدة 10 دقائق في RT.
    5. اغسل غطاء الغطاء الزجاجي باستخدام TPBS (الجدول 1) لمدة 3 × 5 دقائق في RT.
    6. قم بإزالة TPBS وإضافة محلول النفاذية (الجدول 1) لمدة 10 دقائق في RT.
    7. تخلص من محلول النفاذية واحتضان العينة في محلول التخزين (الجدول 1) من ساعة واحدة إلى ليلة (ON) عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف البروتوكول بأمان ، ويمكن الحفاظ على زلات الغطاء الزجاجي في محلول تخزين في لوحة متعددة الآبار 24 لمدة 3-4 أسابيع.
  3. التألق المناعي
    1. (اختياري) قم بإزالة غطاء الغطاء من اللوحة المكونة من 24 بئرا متعددة الآبار وقم بتجميدها بسرعة على الثلج الجاف لمدة 30 ثانية ، وقم بإذابة الجليد في RT ، ثم اغسل غطاء الغطاء الزجاجي في بئر مملوء مسبقا بمحلول تخزين.
    2. (اختياري) كرر 3 × الخطوة 1.3.1.
    3. يغسل في محلول النفاذية لمدة 5 دقائق في RT. بعد ذلك ، اغسل لمدة 2 × 5 دقائق باستخدام TPBS في RT.
    4. احتضان في 0.1 N حمض الهيدروكلوريك لمدة 12 دقيقة في RT.
    5. قم بإجراء غسلتين سريعتين في 1x PBS.
      ملاحظة: تعتبر ظروف نفاذية الخلية المحددة ، بما في ذلك خطوات التجميد والذوبان ومعالجة حمض الهيدروكلوريك ، مثالية لتلطيخ المكونات النووية في الخلايا التي تتميز بالكروماتين المعبأ بكثافة. ومع ذلك ، عند التعامل مع الخلايا التي تتميز بالكروماتين الأقل ضغطا ، ينصح بتقليل أو تجنب هذه الخطوات. بالإضافة إلى ذلك ، لاستهداف المكونات السيتوبلازمية ، فكر في تقليل أو القضاء على علاج حمض الهيدروكلوريك.
    6. احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الأولية (BRD4 ، 1: 500 ، أو SUZ12 ، 1: 100) المخففة في محلول تخفيف الأجسام المضادة (الجدول 1) (200 ميكرولتر لكل غطاء زجاجي) عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن إجراء التألق المناعي عن طريق تعدد إرسال أكثر من جسم مضاد أولي واحد اعتمادا على الاحتياجات التجريبية والأجسام المضادة الثانوية وأنظمة الكشف.
    7. اغسل 3 × 5 دقائق باستخدام PBS-T (الجدول 1) في RT مع اهتزاز خفيف.
    8. احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية المخففة في محلول تخفيف الأجسام المضادة (200 ميكرولتر لكل غطاء زجاجي) لمدة 1 ساعة في RT.
      ملاحظة: اختر الجسم المضاد الثانوي الذي يناسب الاحتياجات التجريبية وأنظمة الكشف المتاحة. تأكد من أن كل جسم مضاد ثانوي يستهدف الأنواع التي يشتق منها الجسم المضاد الأساسي. بالإضافة إلى ذلك ، حدد الفلوروفورات المتوافقة مع مرشحات المجهر ومصدر الضوء. من الأهمية بمكان تجنب التداخل الطيفي بين الفلوروفور المختار وطيف انبعاث البقعة النووية.
    9. اغسل 3 × 5 دقائق باستخدام PBS-T في RT مع اهتزاز خفيف.
    10. بقعة مع 1 نانوغرام / مل من 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) مخفف في 1x PBS لمدة 5 دقائق في RT.
      ملاحظة: يمكن استخدام الأصباغ البديلة للتلطيخ النووي طالما أنها لا تتداخل مع طيف انبعاث الأجسام المضادة الثانوية.
    11. أداء عدة غسلات سريعة في 1x PBS.
    12. قم بتركيب الغطاء الزجاجي على شريحة مجهرية مع وسائط تثبيت مانعة للتلاشي.

2. الحصول على الصور

ملاحظة: تعتمد مدة التقاط الصورة على الجهاز والإعدادات المحددة.

  1. اقتناء المجهر البؤري
    1. التقط صورا ثلاثية الأبعاد باستخدام مجهر متحد البؤر ، مع تحديد حجم خطوة 0.25 ميكرومتر في z وحجم بكسل 0.1-0.2 ميكرومتر.
      ملاحظة: لتحقيق الدقة المثلى لحيود الضوء المحدود من خلال هدف الزيت 63x 1.4 NA ، قمنا بتعيين حجم الثقب عند 0.8 AU ومتوسط خط 2x وحجم الإطار 1024 × 1024 بكسل. تم اختيار ليزر الإثارة وكذلك تسلسل اكتساب القناة عمدا لمنع التداخل أو الحديث المتبادل بين الفلوروفورات المستخدمة. ومع ذلك ، ينبغي أن يكون تعديل المعلمات مصمما وفقا للمجهر المحدد وخصائص العينة. انظر جدول المواد لمعرفة مواصفات المجهر متحد البؤر المستخدم في هذا البروتوكول.
    2. الحصول على عدد ثابت من الحقول العشوائية لتشمل ما يقرب من 50 خلية لكل نسخة بيولوجية.

3. تحليل الصور

  1. تثبيت البرامج
    1. قم بتنزيل وتثبيت آخر إصدار متوفر من فيجي من صفحة تنزيل فيجي الرسمية (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
    2. قم بتثبيت 3D Suite إما عبر موقع تحديث فيجي أو يدويا باتباع الإرشادات الموجودة على موقع 3D Suite على الويب (https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download).
    3. قم بتثبيت GDSC (FindFoci) إما عبر موقع تحديث فيجي أو يدويا باتباع الإرشادات الموجودة على مستودع GitHub (https://github.com/aherbert/gdsc).
  2. تحويل TIFF
    1. قم بتنزيل البرنامج النصي "convert_to_TIFF.py" (الملف التكميلي 1).
    2. قم بسحب وإسقاط البرنامج النصي على فيجي وقم بتشغيل الكود.
    3. في اللوحة التي تظهر، استعرض وصولا إلى المسار حيث يتم تخزين التجربة. يتم إنشاء المجلد الفرعي الذي يحتوي على ملفات TIFF المحولة في نفس مجلد التجربة.
  3. تهيئة الإعدادات على 3D Manager.
    1. افتح لوحة خيارات 3D Manager بالنقر فوق Plugins | 3DSuite | 3D Manager Options.
    2. ضمن نافذة خيار 3D Manager ، حدد مربعات الاختيار المقابلة للقياسات التالية: الحجم (الوحدة) ، متوسط القيمة الرمادية ، المربع المحيط (pix) ، قيمة Std Dev Gray ، Centroid (pix) ، و Centroid (الوحدة).
    3. حدد الخيارات التالية: استثناء كائنات على الحواف XY واستبعاد كائنات على الحواف Z وانقر موافق.
      ملاحظة: يجب القيام بهذه الخطوة مرة واحدة فقط لتكوين المقاييس التي سيتم تخزينها في ملفات المعلومات المكانية والكمية في البداية. المقاييس المحددة ضرورية لضمان الأداء السليم لخط الأنابيب. يمكن تضمين مقاييس إضافية اختيارية في هذه الخطوة، كما هو موضح بمزيد من التفصيل في قسم المناقشة.
  4. تعيين المعلمات على FindFoci واجهة المستخدم الرسومية.
    ملاحظة: يجب القيام بهذه الخطوة مرة واحدة فقط لتكوين خط الأنابيب شبه الآلي مع المعلمات المثلى ، والتي سيتم دمجها بعد ذلك في البرامج النصية.
    1. افتح صورة الاختبار. قم بتكرار قناة البروتين ، بما في ذلك المكدس (Ctrl + Shift + D) ، وحدد خانة الاختيار hyperstack ، وحدد رقم القناة المناسب داخل مربع القنوات (c) ، وأعد تسميته وفقا لذلك.
    2. قم بتشغيل مسجل ماكرو فيجي بالانتقال إلى المكونات الإضافية | وحدات الماكرو | سجل.
    3. افتح المكون الإضافي FindFoci (انقر فوق المكونات الإضافية | جي دي إس سي | فايند فوتشي | FindFoci GUI) وحدد الصورة المراد تحليلها من القائمة المنسدلة "صورة".
    4. اضبط المعلمات على النحو التالي (الشكل 2 أ): طمس غاوسي = 1.5 ؛ طريقة الخلفية = SD أعلاه يعني ؛ معلمة الخلفية = 9 ؛ طريقة البحث = جزء من الذروة - الخلفية ؛ معلمة البحث = 0.7 ؛ طريقة الذروة = نسبي فوق الخلفية ؛ معلمة الذروة = 0.2 ؛ الحد الأدنى للحجم = 5 ؛ الحد الأقصى للقمم = 1,000,000.
      ملاحظة: تم اختيار المعلمات المشار إليها بناء على دراسات الحالة الخاصة بنا وقد لا تكون مناسبة لإجراءات التلوين الأخرى.
    5. لتحسين تحديد البؤر ، اضبط المعلمات التالية:
      1. يحدد التمويه الغاوسي مدى التنعيم لتقسيم بؤر أفضل. اجعله قريبا من قطر البؤر (بكسل).
      2. تحدد معلمة الخلفية عتبة لتمييز الخلفية عن إشارة البؤر. زيادة القيم لفرض عتبات أكثر صرامة.
      3. تحدد معلمة البحث النسبة المئوية للتألق من الذروة المضمنة في التعرف على الإشارة. قلل القيم لتشمل مساحات أبعد عن قمة التألق.
      4. تحدد معلمة الذروة الدرجة التي تعتبر بها قمتان للإشارة مستمرتين أو منفصلتين. سيؤدي تقليل القيمة إلى فصل القمم.
      5. تحدد القمم القصوى الحد الأقصى لعدد البؤر التي يمكن تحديدها. قم بتعيين أرقام عالية لتضمين كل البؤر في الصورة.
    6. قم بتشغيل FindFoci وانسخ السلسلة التي تظهر في نافذة المسجل (الخطوة 3.4.2 ، الشكل 2B) التي تحتوي على المعلمات المحددة ، باستثناء علامات الاقتباس. لمزيد من المعلومات المتعلقة بالإعدادات ، راجع تعليمات دليل المكون الإضافي 22.
  5. خط أنابيب قياس كمية البروتين النووي
    1. قم بتنزيل البرنامج النصي "nuclear_prot_q.py" (الملف التكميلي 2).
    2. قم بسحب البرنامج النصي وإفلاته في فيجي وانقر فوق تشغيل لتنفيذ الكود.
    3. اتبع الإرشادات الموجودة في مربع الحوار المعروض لمعالجة الصور.
      1. قناة النواة: أدخل الرقم المقابل لقناة DAPI (أو أي تلطيخ نووي).
      2. Nucleus Gaussian Blur: أدخل قيمة سيجما اللازمة لطمس الصورة للتقسيم.
        ملاحظة: حافظ على هذه المعلمة بالقرب من قطر النواة (أي 5-6 ميكرومتر). يشار إلى قيم سيغما أعلى للتلطيخ غير المتجانس.
      3. قناة البروتين: أدخل الرقم المقابل لقناة تلطيخ الفائدة.
      4. معلمة FindFoci: الصق السلسلة التي تم الحصول عليها من خطوة تسجيل الماكرو في المقطع 3.4.6 (الشكل 2B).
      5. (اختياري) مراقبة الجودة: تحقق من جودة النوى المجزأة. سيؤدي هذا إلى إيقاف البرنامج النصي مؤقتا والسماح بالتحقق اليدوي من كل منطقة نووية تم إنشاؤها (ROI).
      6. حدد دليل صور: انقر فوق الزر "استعراض " للانتقال إلى المجلد الذي يحتوي على ملفات TIFF المراد تحليلها.
    4. بمجرد تجميع جميع المربعات ، انقر فوق "موافق " لمتابعة التنفيذ.
    5. إذا لم يتم تقسيم النواة بشكل صحيح وفشلت في تلبية متطلبات الجودة ، فقم بحذفها أو تعديلها كما هو موضح في الشكل 2C.
      1. تحقق من قائمة عائد الاستثمار في نافذة ROIManager3D ؛ إذا كانت القائمة فارغة ، فحدد نافذة الدمج وانقر فوق Quantify 3D لتحديث المدير. ثم أغلق جدول نتائج Quantify 3D . حدد قناة النوى وانقر فوق Live-ROI to ON.
      2. حدد عائد الاستثمار الذي ينتمي إلى نفس النواة واضغط على دمج أو اضغط على حذف في حالة النوى غير المرغوب فيها.
      3. انقر فوق تحديد الكل وتابع التحليل بالنقر فوق موافق في نافذة فحص القناع .
      4. للحصول على النتائج ، ابحث في مجلد القياس الكمي داخل مسار الملف المشار إليه في الخطوة 3.5.3.6 ، والذي يحتوي على ملف txt مع سجلات المعلمة المستخدمة للتحليل.
  6. خط الأنابيب على جوجل كولاب
    1. قم بتنزيل دفتر الملاحظات "final_nuclear_protein_metrics.ipynb" (الملف التكميلي 3).
    2. افتح دفتر الملاحظات على Google Colab (https://colab.research.google.com/).
    3. قم بتحميل جميع المجلدات التي تحتوي على ملفات .csv لكل حقل صورة في مجلد تفضيلات في Google Drive.
    4. أشر في دفتر الملاحظات إلى مسار المجلد حيث يتم تخزين المجلدات الفرعية الناتجة وقم بتشغيل جميع الخلايا. عند الانتهاء من تجميع التعليمات البرمجية ، يتم إنشاء ملف جدول البيانات النهائي الذي يحتوي على جميع البيانات المترجمة في نفس المجلد حيث تم تحميل ملفات .csv.

النتائج

يسهل البروتوكول المبين في هذه الطريقة تصور وقياس التغيرات في تلطيخ البروتين النووي داخل الخلايا التائية الأولية البشرية ، ويمكن تخصيصه لأنواع الخلايا المتنوعة وأهداف البروتين. كدراسات حالة ، أجرينا وحللنا تلطيخ BRD4 و SUZ12 في الخلايا الساذجة و TH1 CD4 + .

يعرض BRD4 نمط ت...

Discussion

في هذه الدراسة ، نقدم طريقة لإجراء تجارب التألق المناعي على البروتينات النووية في الخلايا الليمفاوية التائية البشرية. توفر هذه الطريقة مرونة للاستخدام مع أنواع الخلايا المختلفة من خلال تعديلات طفيفة في خطوات التثبيت والنفاذية ، كما هو موضح سابقا30,31.

Disclosures

RV لديها تعاون علمي مع بدء التشغيل T-One Therapeutics Srl. B.B. و F.M. هما مؤسسان مشاركان لشركة T-One Therapeutics Srl الناشئة. يعمل E.P. حاليا من قبل T-One Therapeutics Srl. يعلن جميع المؤلفين الآخرين أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نحن نعترف بالمساعدة العلمية والتقنية التي قدمها مرفق التصوير INGM ، ولا سيما C. Cordiglieri و A. Fasciani ، ومرفق الفرز INGM FACS على وجه الخصوص M.C Crosti (المعهد الوطني للجينات Molecolare 'Romeo ed Enrica Invernizzi' (INGM) ، ميلانو ، إيطاليا). نعرب عن تقديرنا للسيد جياناكاري لدعمه المعلوماتي التقني. تم تمويل هذا العمل من خلال المنح التالية: مؤسسة كاريبلو (باندو جيوفاني ، منحة رقم 2018-0321) ومؤسسة AIRC (منحة رقم MFAG 29165) إلى F.M. Ricerca Finalizzata ، (منحة رقم GR-2018-12365280) ، مؤسسة AIRC (منحة رقم 2022 27066) ، مؤسسة كاريبلو (منحة رقم 2019-3416) ، مؤسسة إقليمية للبحوث الحيوية (FRRB CP2_12/2018) ،) البيانو الوطني للريبريزا و Resilienza (منحة رقم G43C22002620007) و Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (منحة رقم 2022PKF9S) إلى B. B.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Safe-Lock TubesEppendord#0030121503Protocol section 1
10 mL Serological pipettesVWR#612-3700Protocol section 1
20 µL barrier pipette tipThermo Scientific#2149P-HRProtocol section 1
50 mL Polypropylene Conical TubeFalcon#352070Protocol section 1
200 µL barrier pipette tipThermo Scientific#2069-HRProtocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmediaInvitrogen#P36984Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)Sigma#A7030Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation KitMiltenyi Biotec#130-096-533Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)InvitrogenCat#D1306Step 1.3.10.
Dry iceStep 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 beadLife Technologies#1131Dmagnetic beads step 1.1.4.
EtOHCarlo Erba#4146320Step 1.2.1.1.
FACSAria SORPBD BioscencesStep 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)Life Technologies#10270106Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUSEurocloneGEH17144003F32Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0--Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)Electron Microscopy Sciences#72298-13Step 1.2.1.
GlycerolSigma#G5516Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibodyInvitrogenA11036Step 1.3.8.
HClSigma#320331Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4Miltenyi BiotecCat#130-095-753Step 1.1.4.
human recombinant IL-12Miltenyi BiotecCat#130-096-704Step 1.1.4.
human recombinant IL-2Miltenyi BiotecCat#130-097-744Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscopeLeica Microsystems-Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids SolutionLife Technologies#11140035Step 1.1.4.
Microscope SlidesVWR#631-1552Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)BD Bioscience#557871Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)BD Bioscience#552888Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)Miltenyi Biotec#130-113-546Step 1.1.3.
Multiwell 24 wellFalcon#353047Protocol section 1
Normal Goat SerumInvitrogenPCN5000Step 1.3.6., 1.3.8.
PBSLife Technologies#14190094Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solutionLife Technologies#15070063Step 1.1.4.
PFASigma#P6148Step 1.2.4.
poly-L-lysineSigma#P89201.2.1.
Primary antibody - BRD4Abcam#ab128874Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12Cel SignallingmAb #3737Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-ILife Technologies#61870010Step 1.1.4.
Sodium PyruvateLife Technologies#11360039Step 1.1.4.
Triton X-100Sigma#T8787Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20Sigma#P9416Step 1.3.
Tweezers--Protocol section 1

References

  1. Aboelnour, E., Bonev, B. Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome. Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).
  2. Erdel, F., Rippe, K. Formation of chromatin subcompartments by phase separation. Biophys J. 114 (10), 2262-2270 (2018).
  3. Henninger, J. E., et al. RNA-mediated feedback control of transcriptional condensates. Cell. 184 (1), 207-225 (2021).
  4. Guo, Y. E., et al. Pol II phosphorylation regulates a switch between transcriptional and splicing condensates. Nature. 572 (7770), 543-548 (2019).
  5. Bhat, P., et al. 3D genome organization around nuclear speckles drives mRNA splicing efficiency. bioRxiv. , (2023).
  6. Spector, D. L., Lamond, A. I. Nuclear speckles. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a000646 (2011).
  7. Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. EMBO J. 38 (16), e101379 (2019).
  8. Parker, M. W., et al. A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly. Elife. 8, e48562 (2019).
  9. Feric, M., et al. Coexisting liquid phases underlie nucleolar subcompartments. Cell. 165 (7), 1686-1697 (2016).
  10. Yoneda, M., Nakagawa, T., Hattori, N., Ito, T. The nucleolus from a liquid droplet perspective. J Biochem. 170 (2), 153-162 (2021).
  11. Alberti, S., Carra, S. Nucleolus: A liquid droplet compartment for misbehaving proteins. Curr Biol. 29 (19), R930-R932 (2019).
  12. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  13. Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
  14. Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 39-58 (2014).
  15. Feric, M., Misteli, T. Phase separation in genome organization across evolution. Trends Cell Biol. 31 (8), 671-685 (2021).
  16. Mitrea, D. M., et al. Methods for physical characterization of phase-separated bodies and membrane-less organelles. J Mol Biol. 430 (23), 4773-4805 (2018).
  17. Fetter, J., et al. Endogenous gene tagging with fluorescent proteins. Methods Mol Biol. 1239, 231-240 (2015).
  18. Alberti, S., Gladfelter, A., Mittag, T. Considerations and challenges in studying liquid-liquid phase separation and biomolecular condensates. Cell. 176 (3), 419-434 (2019).
  19. Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. J Cell Sci. 124 (10), 1607-1611 (2011).
  20. Scalisi, S., Ahmad, A., D'Annunzio, S., Rousseau, D., Zippo, A. Quantitative analysis of PcG-associated condensates by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Methods Mol Biol. 2655, 183-200 (2023).
  21. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
  22. Herbert, A. D., Carr, A. M., Hoffmann, E. FindFoci: a focus detection algorithm with automated parameter training that closely matches human assignments, reduces human inconsistencies and increases speed of analysis. PLoS One. 9 (12), e114749 (2014).
  23. Ollion, J., Cochennec, J., Loll, F., Escude, C., Boudier, T. TANGO: a generic tool for high-throughput 3D image analysis for studying nuclear organization. Bioinformatics. 29 (14), 1840-1841 (2013).
  24. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), 3958 (2018).
  25. Jang, M. K., et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19 (4), 523-534 (2005).
  26. Pasini, D., Bracken, A. P., Jensen, M. R., Denchi, E. L., Helin, K. Suz12 is essential for mouse development and for EZH2 histone methyltransferase activity. EMBO J. 23 (20), 4061-4071 (2004).
  27. Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
  28. Peng, Z., et al. Brd4 regulates the homeostasis of CD8(+) T-lymphocytes and their proliferation in response to antigen stimulation. Front Immunol. 12, 728082 (2021).
  29. Marasca, F., et al. LINE1 are spliced in non-canonical transcript variants to regulate T cell quiescence and exhaustion. Nat Genet. 54 (2), 180-193 (2022).
  30. Marasca, F., Cortesi, A., Bodega, B. 3D COMBO chrRNA-DNA-ImmunoFISH. Methods Mol Biol. 2157, 281-297 (2021).
  31. Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH tool to study nuclear architecture in human primary cells. J Vis Exp. (155), (2020).
  32. Jakob, B., Splinter, J., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Live cell microscopy analysis of radiation-induced DNA double-strand break motion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3172-3177 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Jython

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved