A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الطريقة بروتوكول التألق المناعي وخط أنابيب القياس الكمي لتقييم توزيع البروتين مع أنماط تنظيم نووية متنوعة في الخلايا الليمفاوية التائية البشرية. يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة ، بدءا من إعداد العينات والاستمرار في تنفيذ التحليل شبه الآلي في فيجي ، وينتهي بمعالجة البيانات بواسطة دفتر ملاحظات Google Colab.

Abstract

تحدث العمليات النووية المختلفة ، مثل التحكم في النسخ ، داخل هياكل منفصلة تعرف باسم البؤر التي يمكن تمييزها من خلال تقنية التألق المناعي. إن التحقيق في ديناميكيات هذه البؤر في ظل ظروف خلوية متنوعة عبر الفحص المجهري يعطي رؤى قيمة حول الآليات الجزيئية التي تحكم الهوية الخلوية ووظائفها. ومع ذلك ، فإن إجراء فحوصات التألق المناعي عبر أنواع مختلفة من الخلايا وتقييم التغيرات في تجميع هذه البؤر ونشرها وتوزيعها يمثل العديد من التحديات. تشمل هذه التحديات تعقيدات في إعداد العينات ، وتحديد المعلمات لتحليل بيانات التصوير ، وإدارة أحجام البيانات الكبيرة. علاوة على ذلك ، غالبا ما يتم تصميم مهام سير عمل التصوير الحالية للمستخدمين الأكفاء ، مما يحد من إمكانية الوصول إلى جمهور أوسع.

في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكول تألق مناعي محسن مصمم خصيصا للتحقيق في البروتينات النووية في أنواع مختلفة من الخلايا التائية الأولية البشرية التي يمكن تخصيصها لأي بروتين مهم ونوع الخلية. علاوة على ذلك ، نقدم طريقة لقياس تلطيخ البروتين بشكل غير متحيز ، سواء كانت تشكل بؤرا متميزة أو تظهر توزيعا نوويا منتشرا.

تقدم طريقتنا المقترحة دليلا شاملا ، من التلوين الخلوي إلى التحليل ، والاستفادة من خط أنابيب شبه آلي تم تطويره في Jython وقابل للتنفيذ في فيجي. علاوة على ذلك ، نقدم نصا برمجيا سهل الاستخدام من Python لتبسيط إدارة البيانات ، ويمكن الوصول إليه بشكل عام على دفتر ملاحظات Google Colab. وقد أثبت نهجنا فعاليته في إنتاج تحليلات عالية الإثراء للبروتينات ذات الأنماط المتنوعة للتنظيم النووي عبر سياقات مختلفة.

Introduction

يخضع تنظيم الجينوم حقيقي النواة لطبقات متعددة من التعديلات اللاجينية1 ، وتنسيق العديد من الوظائف النووية التي يمكن أن تحدث داخل مقصورات متخصصة تسمى الأجسام النووية أو المكثفات2. ضمن هذه الهياكل ، تتم عمليات مثل بدء النسخ3 ، ومعالجة الحمض النووي الريبي4،5،6 ، وإصلاح الحمض النووي7،8 ، والتكوين الحيوي للريبوسوم9،10،11 ، وتنظيم heterochromatin

Protocol

تمت الموافقة على استخدام العينات البشرية لأغراض البحث من قبل لجان الأخلاقيات التابعة لمؤسسة معهد البحوث والوقاية العلمية (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (ميلانو) ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الموضوعات (أرقام الترخيص: 708_2020). يتم تنظيم البروتوكول في ثلاثة أقسام أساسية: تنفيذ التألق المناعي ، والحصول على الصور ، وتحليل الصور. في المتوسط ، يتطلب الأمر 4 أيام عمل ليتم إكمالها (الشكل 1).

1. إعداد المناعي

ملاحظة: يمكن تخصيص بروتوكول التألق المناعي هذا بسهولة لأنواع الخلايا المختلفة وأهداف البروتين عن طريق ضبط ظروف التثبيت والنفاذية. عادة ما يستغ....

النتائج

يسهل البروتوكول المبين في هذه الطريقة تصور وقياس التغيرات في تلطيخ البروتين النووي داخل الخلايا التائية الأولية البشرية ، ويمكن تخصيصه لأنواع الخلايا المتنوعة وأهداف البروتين. كدراسات حالة ، أجرينا وحللنا تلطيخ BRD4 و SUZ12 في الخلايا الساذجة و TH1 CD4 + .

يعرض BRD4 نمط ت.......

Discussion

في هذه الدراسة ، نقدم طريقة لإجراء تجارب التألق المناعي على البروتينات النووية في الخلايا الليمفاوية التائية البشرية. توفر هذه الطريقة مرونة للاستخدام مع أنواع الخلايا المختلفة من خلال تعديلات طفيفة في خطوات التثبيت والنفاذية ، كما هو موضح سابقا30,31.

Disclosures

RV لديها تعاون علمي مع بدء التشغيل T-One Therapeutics Srl. B.B. و F.M. هما مؤسسان مشاركان لشركة T-One Therapeutics Srl الناشئة. يعمل E.P. حاليا من قبل T-One Therapeutics Srl. يعلن جميع المؤلفين الآخرين أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نحن نعترف بالمساعدة العلمية والتقنية التي قدمها مرفق التصوير INGM ، ولا سيما C. Cordiglieri و A. Fasciani ، ومرفق الفرز INGM FACS على وجه الخصوص M.C Crosti (المعهد الوطني للجينات Molecolare 'Romeo ed Enrica Invernizzi' (INGM) ، ميلانو ، إيطاليا). نعرب عن تقديرنا للسيد جياناكاري لدعمه المعلوماتي التقني. تم تمويل هذا العمل من خلال المنح التالية: مؤسسة كاريبلو (باندو جيوفاني ، منحة رقم 2018-0321) ومؤسسة AIRC (منحة رقم MFAG 29165) إلى F.M. Ricerca Finalizzata ، (منحة رقم GR-2018-12365280) ، مؤسسة AIRC (منحة رقم 2022 27066) ، مؤسسة كاريبلو (منحة رقم 2019-3416) ، مؤسسة إقليمية للبحوث الحيوية (FRRB CP2_12/2018) ،) البيانو الوطني للريبريزا و Resilienza (منحة رقم G43C220026200....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Safe-Lock TubesEppendord#0030121503Protocol section 1
10 mL Serological pipettesVWR#612-3700Protocol section 1
20 µL barrier pipette tipThermo Scientific#2149P-HRProtocol section 1
50 mL Polypropylene Conical TubeFalcon#352070Protocol section 1
200 µL barrier pipette tipThermo Scientific#2069-HRProtocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmediaInvitrogen#P36984Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)Sigma#A7030Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation KitMiltenyi Biotec#130-096-533Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)InvitrogenCat#D1306Step 1.3.10.
Dry iceStep 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 beadLife Technologies#1131Dmagnetic beads step 1.1.4.
EtOHCarlo Erba#4146320Step 1.2.1.1.
FACSAria SORPBD BioscencesStep 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)Life Technologies#10270106Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUSEurocloneGEH17144003F32Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0--Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)Electron Microscopy Sciences#72298-13Step 1.2.1.
GlycerolSigma#G5516Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibodyInvitrogenA11036Step 1.3.8.
HClSigma#320331Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4Miltenyi BiotecCat#130-095-753Step 1.1.4.
human recombinant IL-12Miltenyi BiotecCat#130-096-704Step 1.1.4.
human recombinant IL-2Miltenyi BiotecCat#130-097-744Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscopeLeica Microsystems-Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids SolutionLife Technologies#11140035Step 1.1.4.
Microscope SlidesVWR#631-1552Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)BD Bioscience#557871Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)BD Bioscience#552888Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)Miltenyi Biotec#130-113-546Step 1.1.3.
Multiwell 24 wellFalcon#353047Protocol section 1
Normal Goat SerumInvitrogenPCN5000Step 1.3.6., 1.3.8.
PBSLife Technologies#14190094Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solutionLife Technologies#15070063Step 1.1.4.
PFASigma#P6148Step 1.2.4.
poly-L-lysineSigma#P89201.2.1.
Primary antibody - BRD4Abcam#ab128874Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12Cel SignallingmAb #3737Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-ILife Technologies#61870010Step 1.1.4.
Sodium PyruvateLife Technologies#11360039Step 1.1.4.
Triton X-100Sigma#T8787Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20Sigma#P9416Step 1.3.
Tweezers--Protocol section 1

References

  1. Aboelnour, E., Bonev, B. Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome. Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).
  2. Erdel, F., Rippe, K. Formation of chromatin subcompartments by phase separation.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Jython

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved