צינור רב-תכליתי לניתוח שינויים דינמיים בגופים גרעיניים במגוון סוגי תאים

Valeria Di Gioia; Jan Zamporlini; Rebecca Vadalà; Elena Parmigiani; Beatrice Bodega; Federica Marasca

doi:10.3791/66874

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

שיטה זו מתארת פרוטוקול אימונופלואורסנציה וצינור כימות להערכת התפלגות חלבונים עם דפוסי ארגון גרעיני מגוונים בלימפוציטים מסוג T אנושיים. פרוטוקול זה מספק הדרכה שלב אחר שלב, החל מהכנת הדגימה והמשך בביצוע ניתוח חצי אוטומטי בפיג'י, וכלה בטיפול בנתונים על ידי מחברת Google Colab.

Abstract

תהליכים גרעיניים שונים, כגון בקרת שעתוק, מתרחשים בתוך מבנים בדידים המכונים מוקדים הניתנים להבחנה באמצעות טכניקת האימונופלואורסנציה. חקירת הדינמיקה של מוקדים אלה בתנאים תאיים מגוונים באמצעות מיקרוסקופיה מניבה תובנות חשובות על המנגנונים המולקולריים השולטים בזהות התאית ובתפקודיה. עם זאת, ביצוע בדיקות אימונופלואורסנציה על פני סוגי תאים שונים והערכת שינויים בהרכבה, דיפוזיה והפצה של מוקדים אלה מציבים אתגרים רבים. אתגרים אלה כוללים מורכבויות בהכנת הדגימות, קביעת פרמטרים לניתוח נתוני הדמיה וניהול נפחי נתונים משמעותיים. יתר על כן, תהליכי עבודה קיימים של הדמיה מותאמים לעתים קרובות למשתמשים מיומנים, ובכך מגבילים את הנגישות לקהל רחב יותר.

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול אימונופלואורסנציה אופטימלי המותאם לחקר חלבונים גרעיניים בסוגים שונים של תאי T ראשוניים אנושיים שניתן להתאים אישית לכל חלבון מעניין וסוג תא. יתר על כן, אנו מציגים שיטה לכימות בלתי משוחד של צביעת חלבונים, בין אם הם יוצרים מוקדים נפרדים או מציגים פיזור גרעיני מפוזר.

השיטה המוצעת שלנו מציעה מדריך מקיף, החל מצביעה סלולרית ועד ניתוח, תוך מינוף צינור חצי אוטומטי שפותח ב- Jython וניתן להפעלה בפיג'י. יתר על כן, אנו מספקים סקריפט Python ידידותי למשתמש כדי לייעל את ניהול הנתונים, נגיש לציבור במחשב נייד של Google Colab. הגישה שלנו הוכיחה יעילות בהפקת ניתוחים אימונופלואורסצנטיים אינפורמטיביים ביותר עבור חלבונים עם דפוסים מגוונים של ארגון גרעיני בהקשרים שונים.

Introduction

ארגון הגנום האיקריוטי נשלט על ידי שכבות מרובות של שינויים אפיגנטיים¹, המתאמים מספר פונקציות גרעיניות שיכולות להתרחש בתוך תאים מיוחדים הנקראים גופים גרעיניים או מעובים². בתוך מבנים אלה מתרחשים תהליכים כגון התחלת שעתוק³, עיבוד RNA ^4,5,6, תיקון DNA ^7,8, ביוגנזה של ריבוזום ^9,10,11 וויסות הטרוכרומטין^12,13. ויסות הגופים הגרעיניים מתאים את עצמו הן לממד המרחבי והן לממד הזמני כדי להתאים לדרישות התא, מונחה על ידי עקרונות הפרדת פאזה^14,15. כתוצאה מכך, גופים אלה מתפקדים כמפעלים ארעיים שבהם מרכיבים פונקציונליים מתכנסים ומתפרקים, ועוברים שינויים בגודל ובפיזור המרחבי. לפיכך, הבנת המאפיינים של חלבונים גרעיניים באמצעות מיקרוסקופיה, כולל נטייתם ליצור גופים וסידורם המרחבי בתנאים תאיים שונים, מציעה תובנות חשובות לגבי תפקידיהם הפונקציונליים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא שיטה נפוצה לחקר חלבונים גרעיניים, המאפשרת את זיהויים באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים או ביטוי ישיר של מטרות עם כתב חלבון פלואורסצנטי^16,17.

בהקשר זה, גופים גרעיניים מופיעים כמוקדים בהירים או פונקטה, עם מידה ניכרת של ספיריות, מה שהופך אותם בקלות להבדיל מן הסביבה^16,18. טכניקות סופר-רזולוציה כמו STORM ו-PALM, על ידי מתן רזולוציה משופרת (עד 10 ננומטר)¹⁹, מאפשרות אפיון מדויק יותר של המבנה וההרכב של מעבים ספציפיים²⁰. עם זאת, הנגישות שלהם מוגבלת על ידי הוצאות ציוד ואת הכישורים המיוחדים הדרושים לניתוח נתונים. לכן, מיקרוסקופ קונפוקלי נשאר פופולרי בשל האיזון החיובי שלה בין רזולוציה לשימוש רחב יותר. פופולריות זו מתאפשרת על ידי הסרה מובנית של אור מחוץ לפוקוס, אשר מפחית את הדרישה להליכי עיבוד נרחבים לאחר עיבוד עבור פילוח מדויק, זמינותו הנרחבת במכוני מחקר, זמן הרכישה האפקטיבי שלו, והכנת דגימות שהיא בדרך כלל יעילה. עם זאת, מדידה מדויקת של פיזור, הרכבה או דיפוזיה של חלבונים באמצעות מבחני אימונופלואורסצנטיות על פני תנאים תאיים מגוונים מציבה אתגרים, שכן שיטות קיימות רבות חסרות הדרכה לבחירת פרמטרים מתאימים לחלבונים בעלי דפוסי התפלגות משתנים²¹. יתר על כן, טיפול בנפח הנתונים הגדול שנוצר יכול להיות מרתיע עבור משתמשים עם ניסיון מוגבל בניתוח נתונים, מה שעלול לסכן את המשמעות הביולוגית של התוצאות.

כדי להתמודד עם האתגרים האלה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב להכנת אימונופלואורסנציה וניתוח נתונים, במטרה לספק שיטה בלתי משוחדת לכימות צביעת חלבונים עם דפוסי ארגון שונים (איור 1). צינור חצי-אוטומטי זה מיועד למשתמשים בעלי מומחיות מוגבלת בניתוח חישובי והדמיה. הוא משלב את הפונקציות של שני תוספים פיג'י מבוססים: FindFoci²² ו 3D suite²³. על ידי שילוב יכולת זיהוי המוקדים המדויקת של FindFoci עם תכונות זיהוי האובייקטים והפילוח במרחב התלת-ממדי המוצע על ידי חבילת 3D, הגישה שלנו מייצרת שני קבצי CSV לכל ערוץ עבור כל שדה רכישה. קבצים אלה מכילים מידע משלים המאפשר חישוב מדדים המתאימים לסוגים שונים של התפלגות אותות, כגון ספירת מוקדים לתא, מרחק המוקדים מהצנטרויד הגרעיני ומקדם אי-הומוגניות (IC), שהכנסנו לצביעת חלבונים מפוזרים. בנוסף, אנו מכירים בכך שאקסטרפולציה של נתונים עשויה לגזול זמן רב עבור משתמשים עם כישורי טיפול מוגבלים בנתונים. כדי לייעל תהליך זה, אנו מספקים סקריפט Python שאוסף באופן אוטומטי את כל המדידות שנאספו לקובץ אחד עבור כל ניסוי. משתמשים יכולים להפעיל סקריפט זה ללא צורך להתקין תוכנת שפת תכנות כלשהי. אנו מספקים קוד הפעלה ב- Google Colab, פלטפורמה מבוססת ענן המאפשרת כתיבת סקריפטים של Python ישירות בדפדפן. זה מבטיח שהשיטה שלנו אינטואיטיבית ונגישה לשימוש מיידי.

אנו מדגימים את יעילות הפרוטוקול שלנו בניתוח וכימות שינויים בהתפלגות אותות של שני חלבונים גרעיניים: חלבון המכיל ברומודומיין 4 (BRD4) ומדכא זסטה-12 (SUZ12). BRD4 הוא חלבון קו-אקטיבטור מתועד היטב בתוך קומפלקס Mediator הידוע כיוצר עיבויים הקשורים לחניכת שעתוק תלוית פולימראז II^24,25. SUZ12 הוא רכיב חלבוני של Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) האחראי על ויסות התצהיר של שינוי היסטון H3K27me3^26,27. חלבונים אלה מציגים דפוסים שונים בתוך שני סוגי תאים נפרדים: תאי T נאיביים אנושיים CD4⁺ שבודדו זה עתה, שהם שקטים ומפגינים קצב איטי של פעילות שעתוק, ותאי T_H1 CD4⁺ ממוינים במבחנה, שהם תאים משפיעים מתמחים ומתרבים המראים שעתוק מוגבר²⁸.

Protocol

השימוש בדגימות אנושיות למטרות מחקר אושר על ידי ועדות האתיקה של Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (מילאנו), והתקבלה הסכמה מדעת מכל הנבדקים (מספרי הרשאה: 708_2020). הפרוטוקול מאורגן בשלושה חלקים עיקריים: ביצוע immunofluorescence, רכישת תמונה וניתוח תמונה. בממוצע, נדרשים 4 ימי עבודה כדי להסתיים (תרשים 1).

1. הכנת immunofluorescence

הערה: פרוטוקול אימונופלואורסנציה זה יכול להיות מותאם בקלות לסוגי תאים שונים ומטרות חלבון על ידי התאמת תנאי הקיבוע והחדירה. הכנה אימונופלואורסצנטית בדרך כלל אורכת פחות מ-3 ימים, כאשר משך הדגירה הראשונית של נוגדנים משתנה בהתאם לאיכות הנוגדנים ולחלבון המטרה (איור 1).

הכנת דוגמאות
1. בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) באמצעות צנטריפוגה הדרגתית צפיפות באמצעות תווך של כ-1.077 גרם/מ"ל צפיפות בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).
2. בודד תאי T CD4⁺ ממרכזיות באמצעות חרוזים מגנטיים, בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).
3. צביעת תאים עם נוגדנים עבור CD4, CD45RA ו- CD45RO (רשימת חומרים) והמשך במיון FACS של תאי T נאיביים CD4⁺ ^כתאי CD4⁺/CD45RA⁺/CD45RO, כמתואר במקום אחר^29,30.
  הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת מפרטים של ממיין FACS המשמש בפרוטוקול זה.
4. לגרום להתמיינות של תאי T נאיביים CD4⁺ לתוך T עוזר 1 (T_H1 CD4 ⁺ תאים) כמתואר ב ²⁹. בקצרה, תרבית 1.5 x 10⁶ תאים/מ"ל של תאי T נאיביים CD4⁺ ממוינים ב- T_H1 בינוני המגרה אותם עם חרוזים מגנטיים נגד CD3 / נגד CD28 ביחס של 1: 1. ספרו את התאים ופצלו אותם כאשר הם מגיעים ל-1.5 ×^{10 6} תאים/מ"ל כל 2-3 ימים (ראו טבלה 1 עבור T_H1 הרכב בינוני).
5. להעריך את הפרשת הציטוקינים של תפקוד האפקט לאחר 7 ימים של התמיינות, כמתואר ב ²⁹.
קיבוע תאים וחלחול
הערה: כל ההליכים הללו תוארו ב- ^30,31 עם התאמות קלות.
1. כדי להבטיח היצמדות אופטימלית של התא, יש לטפל בכיסויי זכוכית (10 מ"מ, עובי 1.5 שעות) עם תמיסת ציפוי (טבלה 1) באופן הבא:
  1. נקו את כיסויי הזכוכית על ידי שטיפתם תחילה במים מזוקקים (ddH₂O), ולאחר מכן שטיפה עם 70% אתנול (EtOH), ואפשרו להם להתייבש באוויר.
  2. הניחו את הכיסויים השטופים בצלחת מרובת 24 בארות לשלבים 1.2.1.3-1.3.
  3. יש למרוח טיפה של 200 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי על כיסוי הזכוכית. לאחר 5 דקות, להסיר את הטיפה ולתת לה להתייבש באוויר.
  4. שטפו את הכיסויים על ידי מריחת טיפה של 200 μL של ddH₂O. לאחר 5 דקות, יש להסיר את הטיפה ולייבש באוויר.
  5. חזור על 3 x שלבים 1.2.1.3-1.2.1.4.
2. השהה מחדש תאי T נאיביים CD4⁺ ותאי T_H1 CD4⁺ ב 1x פוספט חוצץ מלוחים (PBS) בריכוז 2 × 10⁶ תאים / מ"ל.
  הערה: הריכוז המצוין מומלץ במיוחד עבור תאים קטנים כגון לימפוציטים ראשוניים אנושיים מסוג T. עבור תאים דבקים, טיפול ציפוי זכוכית הוא מיותר. במקום זאת, המשיכו ישירות בגידול התאים על משטח הזכוכית באמצעות מדיום תרבית התאים המתאים.
3. יש למרוח טיפה של 200 μL של מתלה התא על החלקת מכסה הזכוכית. לאפשר לתאים לזרוע בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות; לאחר מכן, הסר את הטיפה.
4. תקן את התאים עם פרפורמלדהיד 3% מסונן טרי (תמיסת PFA, טבלה 1) למשך 10 דקות ב- RT.
5. שטפו את מכסה הזכוכית עם TPBS (טבלה 1) למשך 3 x 5 דקות ב-RT.
6. הסר TPBS והוסף פתרון חלחול (טבלה 1) למשך 10 דקות ב- RT.
7. יש להשליך את תמיסת החדירה ולדגור על הדגימה בתמיסת אחסון (טבלה 1) משעה אחת עד לילה (ON) ב-4°C.
  הערה: בשלב זה, ניתן לעצור את הפרוטוקול בבטחה, ולשמר את החלקות כיסוי הזכוכית בתמיסת אחסון בצלחת 24-multiwell למשך 3-4 שבועות.
אימונופלואורסנציה
1. (אופציונלי) הסירו את המכסה מהצלחת בת 24 הקידודים והקפיאו במהירות על קרח יבש למשך 30 שניות, הפשירו ב-RT ולאחר מכן שטפו את מכסה הזכוכית בבאר ממולאת מראש עם תמיסת אחסון.
2. (אופציונלי) חזור על 3 x שלב 1.3.1.
3. יש לשטוף בתמיסת חלחול למשך 5 דקות ב-RT. לאחר מכן, שטפו במשך 2 x 5 דקות עם TPBS ב-RT.
4. יש לדגור ב-0.1 N HCl למשך 12 דקות ב-RT.
5. בצעו שתי שטיפות מהירות ב-1x PBS.
  הערה: תנאי חדירת התאים שצוינו, כולל שלבי הקפאה והפשרה וטיפול HCl, הם אופטימליים להכתמת רכיבים גרעיניים בתאים המאופיינים בכרומטין. עם זאת, כאשר מדובר בתאים המאופיינים בכרומטין, רצוי להפחית או להימנע מצעדים אלה. נוסף על כך, כדי להתמקד ברכיבים ציטופלזמיים, שקול להפחית או לבטל את הטיפול ב-HCl.
6. לדגור על התאים עם נוגדן ראשוני (BRD4, 1:500, או SUZ12, 1:100) מדולל במאגר דילול נוגדנים (טבלה 1) (200 μL עבור כל כיסוי זכוכית) ON ב 4 ° C.
  הערה: ניתן לבצע אימונופלואורסנציה על ידי ריבוב יותר מנוגדן ראשוני אחד בהתאם לצרכי הניסוי, נוגדנים משניים ומערכות זיהוי.
7. שטפו 3 x 5 דקות עם PBS-T (טבלה 1) ב-RT עם רעידות קלות.
8. לדגור על התאים עם נוגדן משני מדולל במאגר דילול נוגדנים (200 μL עבור כל כיסוי זכוכית) במשך 1 שעה ב RT.
  הערה: בחר את הנוגדן המשני המתאים ביותר לצרכי הניסוי ולמערכות הזיהוי הזמינות. ודא שכל נוגדן משני מכוון למין שממנו נגזר הנוגדן הראשוני. בנוסף, בחרו פלואורופורים התואמים לפילטרים ולמקור האור של המיקרוסקופ. חשוב להימנע מחפיפה ספקטרלית בין הפלואורופור הנבחר לבין ספקטרום הפליטה של הכתם הגרעיני.
9. שטפו 3 x 5 דקות עם PBS-T ב-RT עם רעידות קלות.
10. כתם עם 1 ng/mL של 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מדולל ב 1x PBS במשך 5 דקות ב RT.
  הערה: ניתן להשתמש בצבעים חלופיים להכתמה גרעינית כל עוד הם אינם חופפים לספקטרום הפליטה של נוגדנים משניים.
11. בצע מספר שטיפות מהירות ב- 1x PBS.
12. הרכיבו את מכסה הזכוכית על שקופית מיקרוסקופיה עם אמצעי הרכבה נגד דהייה.

2. רכישת תמונות

הערה: משך רכישת התמונה תלוי במכשיר ובהגדרות שנבחרו.

רכישת מיקרוסקופ קונפוקלי
1. צלם תמונות תלת-ממדיות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, תוך הגדרת גודל צעד של 0.25 מיקרומטר ב-z וגודל פיקסלים של 0.1-0.2 מיקרומטר.
  הערה: כדי להשיג רזולוציה אופטימלית מוגבלת בעקיפת אור עם המטרה שלנו 63x 1.4 NA Oil, הגדרנו את גודל חור הסיכה על 0.8 AU, ממוצע קו 2x וגודל מסגרת 1024 × 1024 פיקסלים. לייזר העירור כמו גם רצף רכישת התעלה נבחרו במכוון כדי למנוע הפרעה או הצלבה בין הפלואורופורים הנמצאים בשימוש. עם זאת, התאמת הפרמטרים צריכה להיות מותאמת למאפייני המיקרוסקופ והדגימה הספציפיים. עיין בטבלת החומרים לקבלת מפרטים של המיקרוסקופ הקונפוקלי המשמש בפרוטוקול זה.
2. לרכוש מספר עקבי של שדות אקראיים כדי להקיף כ -50 תאים לכל שכפול ביולוגי.

3. ניתוח תמונות

התקנת תוכנה
1. הורד והתקן את הגרסה האחרונה הזמינה של פיג'י מדף ההורדות הרשמי של פיג'י (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
2. התקן את 3D Suite דרך אתר העדכון של פיג'י או באופן ידני בהתאם להוראות באתר האינטרנט של 3D Suite (https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download).
3. התקן את GDSC (FindFoci) דרך אתר העדכון של פיג'י או באופן ידני על ידי ביצוע ההוראות במאגר GitHub (https://github.com/aherbert/gdsc).
המרת TIFF
1. הורד את הסקריפט "convert_to_TIFF.py" (קובץ משלים 1).
2. גרור ושחרר את הסקריפט בפיג'י והפעל את הקוד.
3. בחלונית שמופיעה, אתר את הנתיב שבו מאוחסן הניסוי. תת-התיקייה הכוללת את קובצי TIFF שהומרו נוצרת באותה תיקיית ניסוי.
אתחל הגדרות ב- 3D Manager.
1. פתח את לוח האפשרויות של 3D Manager על ידי לחיצה על תוספים | 3DSuite | אפשרויות מנהל תלת מימד.
2. בחלון האפשרויות 3D Manager, בחר בתיבות הסימון המתאימות למדידות הבאות: עוצמת קול (יחידה), ערך אפור ממוצע, תיבה תוחמת (pix), ערך אפור של Std Dev, Centroid (pix) ו- Centroid (יחידה).
3. סמנו את האפשרויות הבאות: אל תכלול עצמים בקצוות XY ואל תכלול עצמים בקצוות Z ולחצו על הלחצן 'אשר'.
  הערה: שלב זה צריך להיעשות פעם אחת בלבד כדי להגדיר תחילה את המדדים שיישמרו בקבצי המידע המרחבי והכמותי. המדדים שנבחרו חיוניים להבטחת תפקוד תקין של הצינור. ניתן לכלול מדדים אופציונליים נוספים בשלב זה, כמתואר בהמשך המקטע דיון.
הגדר פרמטרים בממשק המשתמש הגרפי של FindFoci.
הערה: שלב זה צריך להיעשות רק פעם אחת כדי להגדיר את הצינור האוטומטי למחצה עם פרמטרים אופטימליים, אשר ישולבו לאחר מכן לתוך סקריפטים.
1. פתח את תמונת הבדיקה. שכפל את ערוץ החלבון, כולל הערימה (Ctrl + Shift + D), סמן את תיבת הסימון hyperstack וציין את מספר הערוץ המתאים בתיבה ערוצים (c) ושנה את שמו בהתאם.
2. הפעל את מקליט המאקרו של פיג'י על ידי ניווט אל תוספים | פקודות מאקרו | שיא.
3. פתח את תוסף FindFoci (לחץ על תוספים | מניית GDSC | פינדופוצ'י | FindFoci GUI) ובחר את התמונה לניתוח מהתפריט הנפתח "תמונה".
4. הגדר את הפרמטרים באופן הבא (איור 2A): טשטוש גאוס = 1.5; שיטת רקע = SD לעיל ממוצע; רקע פארם = 9; שיטת חיפוש = שבר שיא - רקע; חיפוש param = 0.7; שיטת שיא = יחסית מעל הרקע; שיא פארם = 0.2; גודל מינימלי = 5; מקסימום פסגות = 1,000,000.
  הערה: הפרמטרים שצוינו נבחרו על סמך מקרי הבוחן שלנו וייתכן שאינם מתאימים להליכי צביעה אחרים.
5. כדי לשפר את זיהוי המוקדים, התאם את הפרמטרים הבאים:
  1. טשטוש גאוסיאני מגדיר את מידת ההחלקה למוקדים טובים יותר בסגמנטים. שמור אותו קרוב לקוטר המוקד (פיקסל).
  2. פראם רקע קובע סף כדי להבדיל בין הרקע לאות המוקד. הגדל את הערכים כדי להטיל ערכי סף מחמירים יותר.
  3. פראם חיפוש מגדיר את אחוז הפלואורסצנטיות מהשיא הכלול בזיהוי אותות. הקטן את הערכים כדי לכלול אזורים רחוקים יותר משיא הפלואורסצנטיות.
  4. שיא פאראם קובע את המידה שבה שתי פסגות אות נחשבות רציפות או מופרדות. ירידת הערך תגרום להפרדת פסגות.
  5. Max peaks מציין את המספר המרבי של מוקדים הניתנים לזיהוי. הגדירו מספרים גבוהים כדי לכלול את כל המוקדים בתמונה.
6. הפעל את FindFoci והעתק את המחרוזת שמופיעה בחלון המקליט (שלב 3.4.2, איור 2B) שמכילה את הפרמטרים שנבחרו, למעט המרכאות. למידע נוסף הקשור להגדרות, עיין בהוראות מדריך התוסף ²².
צינור לכימות חלבונים גרעיניים
1. הורד את הסקריפט "nuclear_prot_q.py" (קובץ משלים 2).
2. גרור ושחרר את הסקריפט בפיג'י ולחץ על הפעל כדי להפעיל את הקוד.
3. בצע את ההוראות בתיבת הדו-שיח המוצגת כדי לעבד את התמונות.
  1. ערוץ גרעין: הזן את המספר המתאים לערוץ DAPI (או לכל צביעה גרעינית).
  2. Nucleus Gaussian Blur: הזן את ערך הסיגמא הדרוש לטשטוש התמונה לצורך סגמנטציה.
    הערה: שמור על פרמטר זה קרוב יותר לקוטר הגרעין (כלומר, 5-6 מיקרומטר). ערכי סיגמא גבוהים יותר מסומנים עבור צביעה לא הומוגנית.
  3. ערוץ חלבון: הזן את המספר המתאים לערוץ הצביעה של העניין.
  4. פרמטר FindFoci: הדבק את המחרוזת המתקבלת משלב הקלטת המאקרו בקטע 3.4.6 (איור 2B).
  5. (אופציונלי) בקרת איכות: בדוק את איכות הגרעינים המקוטעים. פעולה זו תשהה את הסקריפט ותאפשר בדיקה ידנית של כל אזור עניין גרעיני שנוצר (ROI).
  6. בחרו ספריית תמונות: לחצו על הלחצן 'עיון ' כדי לנווט לתיקייה הכוללת את קובצי TIFF לניתוח.
4. לאחר הידור כל התיבות, לחץ על אישור כדי להמשיך בביצוע.
5. אם גרעין אינו מפולח כראוי ואינו עומד בדרישות האיכות, מחק או שנה אותו כפי שמצוין באיור 2C.
  1. בדוק את רשימת החזר ההשקעה בחלון ROIManager3D ; אם הרשימה ריקה, בחר בחלון המיזוג ולחץ על Quantify 3D כדי לרענן את המנהל. לאחר מכן, סגור את טבלת התוצאות התלת-ממדית Quantify . בחר את ערוץ הגרעינים ולחץ על Live-ROI למצב מופעל.
  2. בחר את החזר ההשקעה השייך לאותו גרעין ולחץ על מיזוג או הקש Delete במקרה של גרעינים לא רצויים.
  3. לחץ על בחר הכל והמשך בניתוח על-ידי לחיצה על אישור בחלון בדיקת מסיכה .
  4. לקבלת תוצאות, חפש בתיקייה Quantification בתוך נתיב הקובץ המצוין בשלב 3.5.3.6, המכיל קובץ txt עם רשומות של הפרמטר ששימש לניתוח.
Pipeline ב- Google Colab
1. הורד את מחברת "final_nuclear_protein_metrics.ipynb" (קובץ משלים 3).
2. פתח את המחברת ב- Google Colab (https://colab.research.google.com/).
3. העלה את כל התיקיות המכילות את קבצי .csv של כל שדה תמונה לתיקיית העדפות ב- Google Drive.
4. ציין במחברת את נתיב התיקיה שבה מאוחסנות תיקיות המשנה של התוצאות והפעל את כל התאים. בסיום הידור הקוד, קובץ הגיליון האלקטרוני הסופי המכיל את כל הנתונים שעברו הידור נוצר באותה תיקייה שבה הועלו קבצי .csv.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר בשיטה זו מאפשר הדמיה וכימות של שינויים בצביעת חלבונים גרעיניים בתוך תאי T ראשוניים אנושיים, וניתן להתאים אותו למגוון סוגי תאים ומטרות חלבון. כמקרי בוחן, ערכנו וניתחנו את הצביעה של BRD4 ו-SUZ12 בתאים נאיביים ובתאי T_H1 CD4⁺ .

BRD4 מציג תבנית צביעה מנוקדת...

Discussion

במחקר זה אנו מציגים שיטה לביצוע ניסויים אימונופלואורסנטיים על חלבונים גרעיניים בלימפוציטים אנושיים מסוג T. שיטה זו מציעה גמישות לשימוש עם סוגי תאים שונים באמצעות שינויים קלים בשלבי הקיבוע והחלחול, כפי שתואר קודם לכן^30,31.

תהליך העבודה שלנו לה?...

Disclosures

ל-R.V. יש שיתוף פעולה מדעי עם הסטארט-אפ T-One Therapeutics Srl; B.B. ו-F.M הם מייסדים משותפים של הסטארט-אפ T-One Therapeutics Srl; E.P. מועסקת כיום על ידי T-One Therapeutics Srl; כל שאר המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מכירים בסיוע המדעי והטכני של מתקן ההדמיה של INGM, בפרט, C. Cordiglieri ו- A. Fasciani, ומתקן המיון של INGM FACS בפרט M.C Crosti (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare 'Romeo ed Enrica Invernizzi' (INGM), מילאנו, איטליה). אנו מודים ל- M. Giannaccari על תמיכתו הטכנית האינפורמטית. עבודה זו מומנה על ידי המענקים הבאים: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321) ו- Fondazione AIRC (grant nr MFAG 29165) ל- F.M. Ricerca Finalizzata, (grant nr GR-2018-12365280), Fondazione AIRC (grant nr 2022 27066), Fondazione Cariplo (grant nr 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB CP2_12/2018,) Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) (grant nr G43C22002620007) ו- Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (grant nr 2022PKF9S) ל- B. B.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Safe-Lock Tubes	Eppendord	#0030121503	Protocol section 1
10 mL Serological pipettes	VWR	#612-3700	Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2149P-HR	Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	#352070	Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	#A7030	Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4⁺T Cell Isolation Kit	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	Cat#D1306	Step 1.3.10.
Dry ice			Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	magnetic beads step 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0	-	-	Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)	Electron Microscopy Sciences	#72298-13	Step 1.2.1.
Glycerol	Sigma	#G5516	Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody	Invitrogen	A11036	Step 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Step 1.1.4.
human recombinant IL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Step 1.1.4.
human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope	Leica Microsystems	-	Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life Technologies	#11140035	Step 1.1.4.
Microscope Slides	VWR	#631-1552	Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)	BD Bioscience	#557871	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)	BD Bioscience	#552888	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Step 1.1.3.
Multiwell 24 well	Falcon	#353047	Protocol section 1
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000	Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution	Life Technologies	#15070063	Step 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Step 1.2.4.
poly-L-lysine	Sigma	#P8920	1.2.1.
Primary antibody - BRD4	Abcam	#ab128874	Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12	Cel Signalling	mAb #3737	Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate	Life Technologies	#11360039	Step 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Step 1.3.
Tweezers	-	-	Protocol section 1

References

Aboelnour, E., Bonev, B. Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome. Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).
Erdel, F., Rippe, K. Formation of chromatin subcompartments by phase separation. Biophys J. 114 (10), 2262-2270 (2018).
Henninger, J. E., et al. RNA-mediated feedback control of transcriptional condensates. Cell. 184 (1), 207-225 (2021).
Guo, Y. E., et al. Pol II phosphorylation regulates a switch between transcriptional and splicing condensates. Nature. 572 (7770), 543-548 (2019).
Bhat, P., et al. 3D genome organization around nuclear speckles drives mRNA splicing efficiency. bioRxiv. , (2023).
Spector, D. L., Lamond, A. I. Nuclear speckles. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a000646 (2011).
Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. EMBO J. 38 (16), e101379 (2019).
Parker, M. W., et al. A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly. Elife. 8, e48562 (2019).
Feric, M., et al. Coexisting liquid phases underlie nucleolar subcompartments. Cell. 165 (7), 1686-1697 (2016).
Yoneda, M., Nakagawa, T., Hattori, N., Ito, T. The nucleolus from a liquid droplet perspective. J Biochem. 170 (2), 153-162 (2021).
Alberti, S., Carra, S. Nucleolus: A liquid droplet compartment for misbehaving proteins. Curr Biol. 29 (19), R930-R932 (2019).
Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 39-58 (2014).
Feric, M., Misteli, T. Phase separation in genome organization across evolution. Trends Cell Biol. 31 (8), 671-685 (2021).
Mitrea, D. M., et al. Methods for physical characterization of phase-separated bodies and membrane-less organelles. J Mol Biol. 430 (23), 4773-4805 (2018).
Fetter, J., et al. Endogenous gene tagging with fluorescent proteins. Methods Mol Biol. 1239, 231-240 (2015).
Alberti, S., Gladfelter, A., Mittag, T. Considerations and challenges in studying liquid-liquid phase separation and biomolecular condensates. Cell. 176 (3), 419-434 (2019).
Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. J Cell Sci. 124 (10), 1607-1611 (2011).
Scalisi, S., Ahmad, A., D'Annunzio, S., Rousseau, D., Zippo, A. Quantitative analysis of PcG-associated condensates by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Methods Mol Biol. 2655, 183-200 (2023).
Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
Herbert, A. D., Carr, A. M., Hoffmann, E. FindFoci: a focus detection algorithm with automated parameter training that closely matches human assignments, reduces human inconsistencies and increases speed of analysis. PLoS One. 9 (12), e114749 (2014).
Ollion, J., Cochennec, J., Loll, F., Escude, C., Boudier, T. TANGO: a generic tool for high-throughput 3D image analysis for studying nuclear organization. Bioinformatics. 29 (14), 1840-1841 (2013).
Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), 3958 (2018).
Jang, M. K., et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19 (4), 523-534 (2005).
Pasini, D., Bracken, A. P., Jensen, M. R., Denchi, E. L., Helin, K. Suz12 is essential for mouse development and for EZH2 histone methyltransferase activity. EMBO J. 23 (20), 4061-4071 (2004).
Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
Peng, Z., et al. Brd4 regulates the homeostasis of CD8(+) T-lymphocytes and their proliferation in response to antigen stimulation. Front Immunol. 12, 728082 (2021).
Marasca, F., et al. LINE1 are spliced in non-canonical transcript variants to regulate T cell quiescence and exhaustion. Nat Genet. 54 (2), 180-193 (2022).
Marasca, F., Cortesi, A., Bodega, B. 3D COMBO chrRNA-DNA-ImmunoFISH. Methods Mol Biol. 2157, 281-297 (2021).
Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH tool to study nuclear architecture in human primary cells. J Vis Exp. (155), (2020).
Jakob, B., Splinter, J., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Live cell microscopy analysis of radiation-induced DNA double-strand break motion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3172-3177 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

T Jython

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

Method Article