Um pipeline versátil para analisar mudanças dinâmicas em corpos nucleares em uma variedade de tipos de células

Resumo

Este método descreve um protocolo de imunofluorescência e pipeline de quantificação para avaliar a distribuição de proteínas com padrões variados de organização nuclear em linfócitos T humanos. Este protocolo fornece orientação passo a passo, começando pela preparação da amostra e continuando com a execução da análise semiautomatizada em Fiji, concluindo com o tratamento de dados por um notebook Google Colab.

Resumo

Vários processos nucleares, como o controle transcricional, ocorrem dentro de estruturas discretas conhecidas como focos que são discerníveis através da técnica de imunofluorescência. Investigar a dinâmica desses focos sob diversas condições celulares por meio de microscopia produz informações valiosas sobre os mecanismos moleculares que governam a identidade e as funções celulares. No entanto, a realização de ensaios de imunofluorescência em diferentes tipos de células e a avaliação de alterações na montagem, difusão e distribuição desses focos apresentam inúmeros desafios. Esses desafios abrangem complexidades na preparação de amostras, determinação de parâmetros para análise de dados de imagem e gerenciamento de volumes substanciais de dados. Além disso, os fluxos de trabalho de imagem existentes geralmente são adaptados para usuários proficientes, limitando assim a acessibilidade a um público mais amplo.

Neste estudo, apresentamos um protocolo de imunofluorescência otimizado adaptado para investigar proteínas nucleares em diferentes tipos de células T primárias humanas que podem ser personalizadas para qualquer proteína de interesse e tipo de célula. Além disso, apresentamos um método para quantificar de forma imparcial a coloração de proteínas, quer elas formem focos distintos ou exibam uma distribuição nuclear difusa.

Nosso método proposto oferece um guia abrangente, desde a coloração celular até a análise, aproveitando um pipeline semiautomatizado desenvolvido em Jython e executável em Fiji. Além disso, fornecemos um script Python fácil de usar para simplificar o gerenciamento de dados, acessível publicamente em um notebook do Google Colab. Nossa abordagem demonstrou eficácia em produzir análises de imunofluorescência altamente informativas para proteínas com diversos padrões de organização nuclear em diferentes contextos.

Introdução

A organização do genoma eucariótico é governada por múltiplas camadas de modificações epigenéticas¹, coordenando várias funções nucleares que podem ocorrer dentro de compartimentos especializados chamados corpos nucleares ou condensados². Dentro dessas estruturas, ocorrem processos como iniciação da transcrição³, processamento de RNA ^4,5,6, reparo de DNA ^7,8, biogênese do ribossomo ^9,10,11 e regulação da heterocromatina^12,13. A regulação dos corpos nucleares se ajusta às dimensões espaciais e temporais para acomodar as necessidades celulares, guiada pelos princípios de separação de fases^14,15. Consequentemente, esses corpos funcionam como fábricas transitórias onde os componentes funcionais se montam e se desmontam, sofrendo mudanças de tamanho e distribuição espacial. Portanto, entender as características das proteínas nucleares por microscopia, incluindo sua propensão a formar corpos e seu arranjo espacial em diferentes condições celulares, oferece informações valiosas sobre seus papéis funcionais. A microscopia de fluorescência é um método amplamente utilizado para o estudo de proteínas nucleares, permitindo sua detecção por meio de anticorpos fluorescentes ou expressando diretamente alvos com um repórter de proteína fluorescente^16,17.

Nesse contexto, os corpos nucleares aparecem como focos ou pontos brilhantes, com notável grau de esfericidade, tornando-os facilmente distinguíveis do ambiente circundante^16,18. Técnicas de super-resolução como STORM e PALM, ao fornecer resolução aprimorada (até 10 nm) ¹⁹, permitem uma caracterização mais precisa da estrutura e composição de condensados específicos²⁰ . No entanto, sua acessibilidade é limitada pelas despesas com equipamentos e pelas habilidades especializadas necessárias para a análise de dados. Portanto, a microscopia confocal continua popular devido ao seu equilíbrio favorável entre resolução e uso mais amplo. Essa popularidade é facilitada pela remoção inerente da luz fora de foco, o que diminui a necessidade de extensos procedimentos de pós-processamento para segmentação precisa, sua ampla disponibilidade em institutos de pesquisa, seu tempo efetivo de aquisição e preparação de amostras que normalmente é eficiente. No entanto, medir com precisão a distribuição, montagem ou difusão de proteínas usando ensaios de imunofluorescência em diversas condições celulares apresenta desafios, pois muitos métodos existentes carecem de orientação sobre a seleção de parâmetros adequados para proteínas com padrões de distribuição variados²¹. Além disso, lidar com o grande volume de dados resultante pode ser assustador para usuários com experiência limitada em análise de dados, comprometendo potencialmente o significado biológico dos resultados.

Para enfrentar esses desafios, introduzimos um protocolo passo a passo detalhado para preparação de imunofluorescência e análise de dados, com o objetivo de fornecer um método imparcial para quantificar a coloração de proteínas com vários padrões de organização (Figura 1). Este pipeline semiautomatizado foi projetado para usuários com experiência limitada em análise computacional e de imagem. Ele combina as funcionalidades de dois plug-ins estabelecidos em Fiji: FindFoci²² e 3D suite²³. Ao integrar a capacidade precisa de identificação de focos do FindFoci com os recursos de identificação e segmentação de objetos no espaço 3D oferecidos pelo 3D suite, nossa abordagem gera dois arquivos CSV por canal para cada campo de aquisição. Esses arquivos contêm informações complementares que facilitam o cálculo de métricas adequadas para vários tipos de distribuição de sinal, como a contagem de focos por célula, a distância dos focos do centróide nuclear e o coeficiente de heterogeneidade (IC), que introduzimos para a coloração difusa de proteínas. Além disso, reconhecemos que a extrapolação de dados pode ser demorada para usuários com habilidades limitadas de manuseio de dados. Para agilizar esse processo, fornecemos um script Python que compila automaticamente todas as medidas coletadas em um único arquivo para cada experimento. Os usuários podem executar este script sem a necessidade de instalar nenhum software de linguagem de programação. Disponibilizamos um código executável no Google Colab, uma plataforma baseada em nuvem que permite a escrita de scripts Python diretamente no navegador. Isso garante que nosso método seja intuitivo e prontamente acessível para uso imediato.

Demonstramos a eficácia do nosso protocolo na análise e quantificação de alterações na distribuição de sinal de duas proteínas nucleares: proteína 4 contendo bromodomínio (BRD4) e supressor de zeste-12 (SUZ12). BRD4 é uma proteína coativadora bem documentada dentro do complexo Mediador conhecida por formar condensados associados à iniciação transcricional dependente da polimerase II^24,25. SUZ12 é um componente proteico do Complexo Repressivo Polycomb 2 (PRC2) responsável por regular a deposição da modificação da histona H3K27me3^26,27. Essas proteínas exibem padrões diferentes dentro de dois tipos distintos de células: células T CD4⁺ virgens humanas recém-isoladas, que são quiescentes e exibem taxas lentas de atividade transcricional, e células T_H1 CD4⁺ diferenciadas in vitro, que são células efetoras especializadas em proliferação mostrando transcrição aumentada²⁸.

Protocolo

O uso de amostras humanas para fins de pesquisa foi aprovado pelos Comitês de Ética da Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milão), e o consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos (números de autorização: 708_2020). O protocolo é organizado em três seções principais: execução de imunofluorescência, aquisição de imagem e análise de imagem. Em média, são necessários 4 dias úteis para ser concluído (Figura 1).

1. Preparação de imunofluorescência

NOTA: Este protocolo de imunofluorescência pode ser facilmente personalizado para vários tipos de células e alvos de proteínas, ajustando as condições de fixação e permeabilização. A preparação da imunofluorescência normalmente leva menos de 3 dias para ser concluída, com a duração da incubação do anticorpo primário variando com base na qualidade do anticorpo e na proteína alvo (Figura 1).

1. Preparação da amostra
   1. Isole as células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) por meio de uma centrifugação com gradiente de densidade por meio de aproximadamente 1.077 g/mL de densidade de acordo com as instruções do fabricante (Tabela de Materiais).
   2. Isole as células T CD4⁺ de PBMCs com esferas magnéticas, seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais).
   3. Corar as células com anticorpos para CD4, CD45RA e CD45RO (Tabela de Materiais) e proceder à classificação FACS de células T CD4⁺ virgens ^{como células} CD4⁺/CD45RA⁺/CD45RO-, conforme descrito em outro lugar^29,30.
      NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter especificações do classificador FACS usado neste protocolo.
   4. Induzir a diferenciação de células T CD4⁺ virgens em T helper 1 (células T_H1 CD4⁺ ), conforme descrito em ²⁹. Resumidamente, cultive 1,5 x 10⁶ células/mL de células T CD4⁺ virgens classificadas por FACS em meio T_H1, estimulando-as com esferas magnéticas anti-CD3/anti-CD28 na proporção de 1:1. Conte as células e divida-as quando atingirem 1,5 × 10⁶ células / mL a cada 2-3 dias (consulte a Tabela 1 para a composição do meio_TH1).
   5. Avalie a secreção de citocinas da função efetora após 7 dias de diferenciação, conforme descrito em ²⁹.
2. Fixação e permeabilização celular
   NOTA: Todos esses procedimentos foram descritos em ^30,31 com pequenas adaptações.
   1. Para garantir a adesão ideal das células, trate as lamínulas de vidro (10 mm, espessura 1,5 H) com solução de revestimento (Tabela 1) da seguinte forma:
      1. Limpe as lamínulas de vidro lavando-as inicialmente com água destilada (ddH₂O), seguida de um enxágue com etanol a 70% (EtOH) e deixando-as secar ao ar.
      2. Coloque as lamínulas lavadas em uma placa de 24 poços múltiplos para as etapas 1.2.1.3-1.3.
      3. Aplique uma gota de 200 μL de solução de revestimento na lamínula de vidro. Após 5 min, retire a gota e deixe secar ao ar.
      4. Lave as lamínulas aplicando uma gota de 200 μL de ddH₂O. Após 5 min, retire a gota e seque ao ar.
      5. Repita 3 etapas 1.2.1.3-1.2.1.4.
   2. Ressuspenda células T CD4⁺ virgens e células T_H1 CD4⁺ em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de 2 × 10⁶ células/mL.
      NOTA: A concentração indicada é recomendada especificamente para células pequenas, como linfócitos T primários humanos. Para células aderentes, o tratamento de revestimento de vidro é desnecessário. Em vez disso, prossiga diretamente com o cultivo das células na superfície do vidro usando o meio de cultura de células apropriado.
   3. Aplique uma gota de 200 μL da suspensão da célula na lamínula de cobertura. Deixe as células semearem à temperatura ambiente (RT) por 30 min; Em seguida, remova a gota.
   4. Fixe as células com paraformaldeído a 3% recém-filtrado (solução PFA, Tabela 1) por 10 min em RT.
   5. Lave a lamínula de vidro com TPBS (Tabela 1) por 3 x 5 min em RT.
   6. Remover o TPBS e adicionar a solução de permeabilização (Tabela 1) durante 10 min à RT.
   7. Rejeitar a solução de permeabilização e incubar a amostra em solução de armazenamento (quadro 1) durante 1 h até uma noite (ON) a 4 °C.
      NOTA: Nesta fase, o protocolo pode ser interrompido com segurança e as lamínulas de vidro podem ser preservadas em solução de armazenamento em uma placa de 24 multipoços por 3-4 semanas.
3. Imunofluorescência
   1. (Opcional) Remova a lamínula da placa de 24 poços múltiplos e congele rapidamente em gelo seco por 30 s, descongele em RT e, em seguida, lave a lamínula de vidro em um poço pré-preenchido com solução de armazenamento.
   2. (Opcional) Repita 3 x passo 1.3.1.
   3. Lavar em solução de permeabilização durante 5 min à RT. Em seguida, lave por 2 x 5 min com TPBS em RT.
   4. Incubar em HCl 0,1 N por 12 min em RT.
   5. Realize duas lavagens rápidas em 1x PBS.
      NOTA: As condições de permeabilização celular especificadas, incluindo etapas de congelamento e descongelamento e tratamento com HCl, são ideais para a coloração de componentes nucleares em células caracterizadas por cromatina densamente compactada. No entanto, ao lidar com células caracterizadas por cromatina menos compactada, é aconselhável reduzir ou evitar essas etapas. Além disso, para direcionar os componentes citoplasmáticos, considere reduzir ou eliminar o tratamento com HCl.
   6. Incubar as células com anticorpo primário (BRD4, 1:500 ou SUZ12, 1:100) diluído em tampão de diluição de anticorpos (Tabela 1) (200 μL para cada lamínula de vidro) ON a 4 °C.
      NOTA: A imunofluorescência pode ser realizada por multiplexação de mais de um anticorpo primário, dependendo das necessidades experimentais, anticorpos secundários e sistemas de detecção.
   7. Lave 3 x 5 min com PBS-T (Tabela 1) em RT com agitação suave.
   8. Incubar as células com anticorpo secundário diluído em tampão de diluição de anticorpos (200 μL para cada lamínula de vidro) durante 1 h em RT.
      NOTA: Escolha o anticorpo secundário que melhor se adapta às necessidades experimentais e aos sistemas de detecção disponíveis. Certifique-se de que cada anticorpo secundário tenha como alvo a espécie da qual o anticorpo primário é derivado. Além disso, selecione fluoróforos compatíveis com os filtros e a fonte de luz do microscópio. É crucial evitar a sobreposição espectral entre o fluoróforo escolhido e o espectro de emissão da mancha nuclear.
   9. Lave 3 x 5 min com PBS-T em RT com agitação suave.
   10. Coloração com 1 ng/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluído em 1x PBS por 5 min em RT.
       NOTA: Corantes alternativos podem ser usados para coloração nuclear, desde que não se sobreponham ao espectro de emissão de anticorpos secundários.
   11. Execute várias lavagens rápidas em 1x PBS.
   12. Monte a lamínula de vidro em uma lâmina de microscopia com mídia de montagem antidesbotamento.

2. Aquisição de imagem

NOTA: A duração da aquisição da imagem depende do instrumento e das configurações selecionadas.

1. Aquisição de microscópio confocal
   1. Capture imagens 3D usando um microscópio confocal, definindo um tamanho de passo de 0,25 μm em z e tamanho de pixel de 0,1-0,2 μm.
      NOTA: Para obter a resolução ideal limitada por difração de luz com nossa objetiva de óleo de 63x 1,4 NA, definimos o tamanho do orifício em 0,8 UA, média de linha de 2x e tamanho do quadro de 1024 × 1024 pixels. O laser de excitação, bem como a sequência de aquisição do canal, foram selecionados deliberadamente para evitar interferência ou diafonia entre os fluoróforos usados. No entanto, o ajuste dos parâmetros deve ser adaptado às características específicas do microscópio e da amostra. Consulte a Tabela de Materiais para obter especificações do microscópio confocal usado neste protocolo.
   2. Adquira um número consistente de campos aleatórios para abranger aproximadamente 50 células por réplica biológica.

3. Análise de imagem

1. Instalação de software
   1. Baixe e instale a última versão disponível do Fiji na página oficial de download do Fiji (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
   2. Instale o 3D Suite por meio do site de atualização de Fiji ou manualmente seguindo as instruções no site do 3D Suite (https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download).
   3. Instale o GDSC (FindFoci) por meio do site de atualização de Fiji ou manualmente seguindo as instruções no repositório GitHub (https://github.com/aherbert/gdsc).
2. Conversão de TIFF
   1. Baixe o script "convert_to_TIFF.py" (Arquivo Suplementar 1).
   2. Arraste e solte o script em Fiji e execute o código.
   3. No painel exibido, navegue até o caminho em que o experimento está armazenado. A subpasta que contém os arquivos TIFF convertidos é criada na mesma pasta do experimento.
3. Inicialize as configurações no 3D Manager.
   1. Abra o painel de opções do 3D Manager clicando em Plugins | 3DSuite | Opções do 3D Manager.
   2. Na janela de opções do 3D Manager, marque as caixas de seleção correspondentes às seguintes medidas: Volume (unidade), Valor médio de cinza, Caixa delimitadora (pix), Valor de cinza padrão de desenvolvimento, Centroide (pix) e Centroide (unidade).
   3. Marque as seguintes opções: Excluir objetos nas arestas XY e Excluir objetos nas arestas Z e clique em OK.
      NOTA: Esta etapa precisa ser feita apenas uma vez para configurar inicialmente as métricas que serão armazenadas nos arquivos de informações espaciais e quantitativas. As métricas selecionadas são essenciais para garantir o funcionamento adequado do pipeline. Métricas adicionais opcionais podem ser incluídas nesta etapa, conforme descrito em mais detalhes na seção Discussão.
4. Defina parâmetros na GUI do FindFoci.
   NOTA: Esta etapa precisa ser feita apenas uma vez para configurar o pipeline semiautomatizado com parâmetros ideais, que serão incorporados aos scripts.
   1. Abra a imagem de teste. Duplique o canal de proteína, incluindo a pilha (Ctrl + Shift + D), marque a caixa de seleção hyperstack e especifique o número do canal apropriado na caixa Canais (c) e renomeie-o de acordo.
   2. Inicie o gravador de macro Fiji navegando até Plugins | Macros | Registro.
   3. Abra o plugin FindFoci (clique em Plugins | GDSC | FindFoci | FindFoci GUI) e selecione a imagem a ser analisada no menu suspenso "Imagem".
   4. Defina os parâmetros da seguinte forma (Figura 2A): Desfoque gaussiano = 1,5; método de fundo = DP acima da média; parâmetro de fundo = 9; método de pesquisa = fração de pico - fundo; parâmetro de pesquisa = 0,7; método do pico = relativo acima do fundo; parâmetro de pico = 0,2; tamanho mínimo = 5; picos máximos = 1.000.000.
      NOTA: Os parâmetros indicados foram selecionados com base em nossos estudos de caso e podem não ser adequados para outros procedimentos de coloração.
   5. Para melhorar a identificação de focos, ajuste os seguintes parâmetros:
      1. O desfoque gaussiano define a extensão da suavização para melhores focos de segmento. Mantenha-o próximo ao diâmetro do foco (pixel).
      2. O parâmetro de plano de fundo define um limite para distinguir o sinal de fundo do foco. Aumente os valores para impor limites mais rigorosos.
      3. O parâmetro de pesquisa define a porcentagem de fluorescência do pico que está incluída no reconhecimento do sinal. Diminua os valores para incluir áreas mais distantes do pico de fluorescência.
      4. O parâmetro de pico determina o grau em que dois picos de sinal são considerados contínuos ou separados. Diminuir o valor resultará na separação dos picos.
      5. Picos máximos especifica o número máximo de focos identificáveis. Defina números altos para incluir todos os focos na imagem.
   6. Execute FindFoci e copie a cadeia de caracteres que aparece na janela do gravador (Etapa 3.4.2, Figura 2B) que contém os parâmetros selecionados, excluindo as aspas. Para obter mais informações relacionadas às configurações, consulte as instruções ²² do manual do plug-in.
5. Pipeline de quantificação de proteínas nucleares
   1. Baixe o script "nuclear_prot_q.py" (Arquivo Suplementar 2).
   2. Arraste e solte o script em Fiji e clique em executar para executar o código.
   3. Siga as instruções na caixa de diálogo exibida para processar as imagens.
      1. Canal do núcleo: insira o número correspondente ao canal de DAPI (ou qualquer coloração nuclear).
      2. Desfoque gaussiano do núcleo: insira o valor de sigma necessário para desfocar a imagem para segmentação.
         NOTA: Mantenha este parâmetro mais próximo do diâmetro do núcleo (ou seja, 5-6 μm). Valores sigma mais altos são indicados para coloração não homogênea.
      3. Canal de proteína: insira o número correspondente ao canal da coloração de interesse.
      4. Parâmetro FindFoci: cole a string obtida da etapa de gravação de macro na passagem 3.4.6 (Figura 2B).
      5. (Opcional) Controle de qualidade: verifique a qualidade dos núcleos segmentados. Isso pausará o script e permitirá a verificação manual de cada região nuclear de interesse (ROI) gerada.
      6. Selecione um diretório de imagem: clique no botão Procurar para navegar até a pasta que contém os arquivos TIFF a serem analisados.
   4. Depois que todas as caixas forem compiladas, clique em OK para continuar a execução.
   5. Se um núcleo não estiver segmentado corretamente e não atender aos requisitos de qualidade, exclua-o ou modifique-o conforme indicado na Figura 2C.
      1. Verifique a lista de ROI na janela ROIManager3D; se a lista estiver vazia, selecione a janela de mesclagem e clique em Quantificar 3D para atualizar o gerenciador. Em seguida, feche a tabela de resultados Quantificar 3D. Selecione o canal de núcleos e clique em Live-ROI para ON.
      2. Selecione o ROI pertencente ao mesmo núcleo e pressione Mesclar ou pressione Delete no caso de núcleos indesejados.
      3. Clique em selecionar tudo e prossiga com a análise clicando em OK na janela Verificação de máscara .
      4. Para obter resultados, procure na pasta Quantification dentro do caminho do arquivo indicado na etapa 3.5.3.6, contendo um arquivo txt com registros do parâmetro usado para a análise.
6. Pipeline no Google Colab
   1. Faça download do bloco de anotações "final_nuclear_protein_metrics.ipynb" (Arquivo Suplementar 3).
   2. Abra o notebook no Google Colab (https://colab.research.google.com/).
   3. Faça upload de todas as pastas que contêm os arquivos .csv de cada campo de imagem para uma pasta de sua preferência no Google Drive.
   4. Indique no notebook o caminho da pasta onde as subpastas de resultados estão armazenadas e execute todas as células. Quando o código termina de compilar, o arquivo de planilha final contendo todos os dados compilados é criado na mesma pasta em que os arquivos .csv foram carregados.

Resultados

O protocolo descrito neste método facilita a visualização e quantificação de alterações na coloração de proteínas nucleares em células T primárias humanas e pode ser personalizado para diversos tipos de células e alvos de proteínas. Como estudos de caso, conduzimos e analisamos a coloração de BRD4 e SUZ12 em células virgens e T_H1 CD4⁺ .

O BRD4 exibe um padrão de coloração bem pontilhado em células T_H1 CD4 ⁺ virge...

Discussão

Neste estudo, apresentamos um método para a realização de experimentos de imunofluorescência em proteínas nucleares em linfócitos T humanos. Esse método oferece flexibilidade para uso com vários tipos de células por meio de pequenas modificações nas etapas de fixação e permeabilização, conforme descrito anteriormente^30,31.

Nosso fluxo de trabalho de imagem baseia-se em técnicas estabelecidas descritas na literatura, esp...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Safe-Lock Tubes	Eppendord	#0030121503	Protocol section 1
10 mL Serological pipettes	VWR	#612-3700	Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2149P-HR	Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	#352070	Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	#A7030	Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation Kit	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	Cat#D1306	Step 1.3.10.
Dry ice			Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	magnetic beads step 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0	-	-	Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)	Electron Microscopy Sciences	#72298-13	Step 1.2.1.
Glycerol	Sigma	#G5516	Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody	Invitrogen	A11036	Step 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Step 1.1.4.
human recombinant IL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Step 1.1.4.
human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope	Leica Microsystems	-	Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life Technologies	#11140035	Step 1.1.4.
Microscope Slides	VWR	#631-1552	Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)	BD Bioscience	#557871	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)	BD Bioscience	#552888	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Step 1.1.3.
Multiwell 24 well	Falcon	#353047	Protocol section 1
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000	Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution	Life Technologies	#15070063	Step 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Step 1.2.4.
poly-L-lysine	Sigma	#P8920	1.2.1.
Primary antibody - BRD4	Abcam	#ab128874	Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12	Cel Signalling	mAb #3737	Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate	Life Technologies	#11360039	Step 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Step 1.3.
Tweezers	-	-	Protocol section 1