Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Çeşitli hücre tiplerinde nükleer cisimlerdeki dinamik değişiklikleri analiz etmek için çok yönlü bir boru hattı
Bu Makalede
Özet
Bu yöntem, insan T lenfositlerinde çeşitli nükleer organizasyon paternleri ile protein dağılımını değerlendirmek için bir immünofloresan protokolünü ve miktar tayini boru hattını tanımlar. Bu protokol, numune hazırlamadan başlayarak Fiji'de yarı otomatik analizin yürütülmesine kadar devam eden ve bir Google Colab not defteri tarafından veri işleme ile sonuçlanan adım adım rehberlik sağlar.
Özet
Transkripsiyonel kontrol gibi çeşitli nükleer süreçler, immünofloresan tekniği ile ayırt edilebilen odaklar olarak bilinen ayrı yapılar içinde meydana gelir. Bu odakların dinamiklerini çeşitli hücresel koşullar altında mikroskopi yoluyla araştırmak, hücresel kimliği ve işlevleri yöneten moleküler mekanizmalar hakkında değerli bilgiler verir. Bununla birlikte, farklı hücre tiplerinde immünofloresan testleri yapmak ve bu odakların montajı, difüzyonu ve dağılımındaki değişiklikleri değerlendirmek çok sayıda zorluk ortaya çıkarmaktadır. Bu zorluklar, numune hazırlama, görüntüleme verilerini analiz etmek için parametrelerin belirlenmesi ve önemli veri hacimlerinin yönetimindeki karmaşıklıkları kapsar. Ayrıca, mevcut görüntüleme iş akışları genellikle yetkin kullanıcılar için uyarlanır ve bu nedenle erişilebilirliği daha geniş bir kitleye sınırlar.
Bu çalışmada, ilgilenilen herhangi bir protein ve hücre tipi için özelleştirilebilen, farklı insan birincil T hücre tiplerinde nükleer proteinleri araştırmak için uyarlanmış optimize edilmiş bir immünofloresan protokolü sunuyoruz. Ayrıca, ister farklı odaklar oluştursunlar, ister dağınık bir nükleer dağılım sergilesinler, protein boyamayı tarafsız bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunuyoruz.
Önerilen yöntemimiz, Jython'da geliştirilen ve Fiji'de yürütülebilen yarı otomatik bir boru hattından yararlanarak, hücresel boyamadan analize kadar kapsamlı bir kılavuz sunmaktadır. Ayrıca, veri yönetimini kolaylaştırmak için bir Google Colab not defterinde herkesin erişebileceği kullanıcı dostu bir Python komut dosyası sağlıyoruz. Yaklaşımımız, farklı bağlamlarda çeşitli nükleer organizasyon modellerine sahip proteinler için son derece bilgilendirici immünofloresan analizleri sağlamada etkinlik göstermiştir.
Giriş
Ökaryotik genomun organizasyonu, nükleer cisimler veya yoğunlaşmalar2 adı verilen özel bölmelerde meydana gelebilecek çeşitli nükleer işlevleri koordine eden çok sayıda epigenetik modifikasyon 1 katmanı tarafındanyönetilir. Bu yapılar içinde transkripsiyon başlatma 3, RNA işleme 4,5,6, DNA onarımı 7,8, ribozom biyogenezi 9,10,11 ve heterokromatin regülasy....
Protokol
İnsan örneklerinin araştırma amaçlı kullanımı, Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milano) Etik Kurulları tarafından onaylandı ve tüm deneklerden bilgilendirilmiş onam alındı (yetki numaraları: 708_2020). Protokol üç ana bölüme ayrılmıştır: immünofloresan yürütme, görüntü elde etme ve görüntü analizi. Ortalama olarak, tamamlanması 4 iş günü gerektirir (Şekil 1).
1. İmmünofloresan hazırlama
NOT: Bu immünofloresan protokolü, fiksasyon ve geçirgenlik koşullarını ayarlayarak çeşitli hücre tipleri v....
Temsili Sonuçlar
Bu yöntemde özetlenen protokol, insan birincil T hücrelerindeki nükleer protein boyamasındaki değişikliklerin görselleştirilmesini ve niceliklerinin belirlenmesini kolaylaştırır ve çeşitli hücre tipleri ve protein hedefleri için özelleştirilebilir. Vaka çalışmaları olarak, naif ve TH1 CD4 + hücrelerinde BRD4 ve SUZ12'nin boyanmasını gerçekleştirdik ve analiz ettik.
BRD4, hem hareketsiz naif hem de farklılaşmış TH1 CD4 +.......
Tartışmalar
Bu çalışmada, insan T lenfositlerindeki nükleer proteinler üzerinde immünofloresan deneyleri yapmak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, daha önce tarif edildiği gibi, fiksasyon ve geçirgenlik aşamalarında küçük değişiklikler yoluyla çeşitli hücre tipleriyle kullanım için esneklik sunar30,31.
Görüntüleme iş akışımız, özellikle FindFoci ve 3D Suite22,23
Açıklamalar
R.V., T-One Therapeutics Srl girişimi ile bilimsel bir işbirliğine sahiptir; B.B. ve F.M., T-One Therapeutics Srl adlı girişimin kurucu ortaklarıdır; E.P. şu anda T-One Therapeutics Srl'de çalışmaktadır; Diğer tüm yazarlar rekabet eden çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
INGM Görüntüleme Tesisi'nin, özellikle C. Cordiglieri ve A. Fasciani'nin ve INGM FACS ayıklama tesisinin, özellikle M.C Crosti'nin (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare 'Romeo ed Enrica Invernizzi' (INGM), Milano, İtalya) bilimsel ve teknik yardımına teşekkür ederiz. M. Giannaccari'ye teknik bilişim desteği için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle finanse edilmiştir: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, hibe nr 2018-0321) ve Fondazione AIRC (hibe nr MFAG 29165) F.M. Ricerca Finalizzata, (hibe nr GR-2018-12365280), Fondazione AIRC (hibe nr 2022 27066), Fondazione Cariplo (hibe nr 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB CP2_12/2018....
Malzemeler
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Safe-Lock Tubes | Eppendord | #0030121503 | Protocol section 1 |
| 10 mL Serological pipettes | VWR | #612-3700 | Protocol section 1 |
| 20 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2149P-HR | Protocol section 1 |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | #352070 | Protocol section 1 |
| 200 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2069-HR | Protocol section 1 |
| antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia | Invitrogen | #P36984 | Step 1.3.12 |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | #A7030 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | #130-096-533 | Step 1.1.2. |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | Cat#D1306 | Step 1.3.10. |
| Dry ice | Step 1.3.1. | ||
| Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead | Life Technologies | #1131D | magnetic beads step 1.1.4. |
| EtOH | Carlo Erba | #4146320 | Step 1.2.1.1. |
| FACSAria SORP | BD Bioscences | Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | #10270106 | Step 1.1.4 |
| FICOLL PAQUE PLUS | Euroclone | GEH17144003F32 | Step 1.1.1. |
| FIJI Version 2.14.0 | - | - | Protocol section 3 |
| Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H) | Electron Microscopy Sciences | #72298-13 | Step 1.2.1. |
| Glycerol | Sigma | #G5516 | Step 1.2.7-1.3.1. |
| Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Step 1.3.8. |
| HCl | Sigma | #320331 | Step 1.3.4. |
| human neutralizing anti-IL-4 | Miltenyi Biotec | Cat#130-095-753 | Step 1.1.4. |
| human recombinant IL-12 | Miltenyi Biotec | Cat#130-096-704 | Step 1.1.4. |
| human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | Cat#130-097-744 | Step 1.1.4. |
| Leica TCS SP5 Confocal microscope | Leica Microsystems | - | Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | #11140035 | Step 1.1.4. |
| Microscope Slides | VWR | #631-1552 | Step 1.3.12. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone) | BD Bioscience | #557871 | Step 1.1.3. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone) | BD Bioscience | #552888 | Step 1.1.3. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone) | Miltenyi Biotec | #130-113-546 | Step 1.1.3. |
| Multiwell 24 well | Falcon | #353047 | Protocol section 1 |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
| PBS | Life Technologies | #14190094 | Protocol section 1 |
| Penicillin/Streptomycin solution | Life Technologies | #15070063 | Step 1.1.4. |
| PFA | Sigma | #P6148 | Step 1.2.4. |
| poly-L-lysine | Sigma | #P8920 | 1.2.1. |
| Primary antibody - BRD4 | Abcam | #ab128874 | Step 1.3.6. |
| Primary antibody - SUZ12 | Cel Signalling | mAb #3737 | Step 1.3.6. |
| RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I | Life Technologies | #61870010 | Step 1.1.4. |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | #11360039 | Step 1.1.4. |
| Triton X-100 | Sigma | #T8787 | Step 1.2., 1.3. |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | Step 1.3. |
| Tweezers | - | - | Protocol section 1 |
Referanslar
- Aboelnour, E., Bonev, B. Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome. Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).
- Erdel, F., Rippe, K. Formation of chromatin subcompartments by phase separation.
Yeniden Basımlar ve İzinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır