다양한 세포 유형에서 핵체의 동적 변화를 분석하기 위한 다목적 파이프라인

요약

이 방법은 인간 T 림프구에서 다양한 핵 조직 패턴을 가진 단백질 분포를 평가하기 위한 면역형광 프로토콜 및 정량화 파이프라인을 설명합니다. 이 프로토콜은 시료 전처리부터 시작하여 피지에서 반자동 분석을 실행하는 단계별 지침을 제공하며, Google Colab 노트북을 통한 데이터 처리로 마무리됩니다.

초록

전사 제어(transcriptional control)와 같은 다양한 핵 과정은 면역형광 기법을 통해 식별할 수 있는 병소(foci)로 알려진 개별 구조 내에서 발생합니다. 현미경을 통해 다양한 세포 조건에서 이러한 병소의 역학을 조사하면 세포 정체성과 기능을 지배하는 분자 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 그러나 다양한 세포 유형에 대해 면역형광 분석을 수행하고 이러한 병소의 조립, 확산 및 분포의 변화를 평가하는 것은 많은 과제를 제시합니다. 이러한 과제에는 시료 전처리, 이미징 데이터 분석을 위한 파라미터 결정, 상당한 양의 데이터 관리의 복잡성이 포함됩니다. 더욱이 기존 이미징 워크플로우는 숙련된 사용자에게 맞춤화된 경우가 많아 더 많은 사용자에 대한 접근성이 제한됩니다.

이 연구에서는 관심 단백질 및 세포 유형에 맞게 맞춤화할 수 있는 다양한 인간 일차 T 세포 유형의 핵 단백질을 조사하기 위해 맞춤화된 최적화된 면역형광 프로토콜을 소개합니다. 또한, 단백질 염색이 뚜렷한 병소를 형성하거나 확산성 핵 분포를 나타내는지 여부에 관계없이 편향되지 않게 정량화하는 방법을 제시합니다.

당사가 제안하는 방법은 자이썬에서 개발되고 피지에서 실행 가능한 반자동 파이프라인을 활용하여 세포 염색에서 분석에 이르기까지 포괄적인 가이드를 제공합니다. 또한 데이터 관리를 간소화하기 위해 사용자 친화적인 Python 스크립트를 제공하며, Google Colab 노트북에서 공개적으로 액세스할 수 있습니다. 당사의 접근 방식은 다양한 상황에서 다양한 핵 조직 패턴을 가진 단백질에 대해 매우 유익한 면역형광 분석을 수행하는 데 효능이 있음을 입증했습니다.

서문

진핵생물 게놈(eukaryotic genome)의 조직은 후성유전학적 변형(epigenetic modification)¹의 여러 층에 의해 지배되며, 핵체 또는 응축물⁽vaultates)2이라고 불리는 특수한 구획 내에서 발생할 수 있는 여러 핵 기능을 조정한다. 이러한 구조 내에서 전사 시작³, RNA 처리 ^4,5,6, DNA 복구 ^7,8, 리보솜 생물 발생 ^9,10,11 및 헤테로크로마틴 조절^12,13과 같은 과정이 발생합니다. 핵체의 조절은 위상 분리 원칙^14,15

프로토콜

연구 목적의 인체 샘플 사용은 IRCCS(Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico(밀라노)의 윤리 위원회의 승인을 받았으며 모든 피험자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다(승인 번호: 708_2020). 프로토콜은 세 가지 주요 섹션으로 구성됩니다: 면역형광 실행, 이미지 획득 및 이미지 분석. 평균적으로 완료하는 데 영업일 기준 4일이 소요됩니다(그림 1).

1. 면역형광 제제

참고: 이 immunofluorescence 프로토콜은 고정 및 투과화 조건을 조정하여 다양한 세포 유형 및 단백질 표적에 대해 쉽게 맞춤화할 수 있습니다. 면역형광 전처리는 일반적으로 완료하는 데 3일 미만이 소요되며, 1차 항체 배양 기간은 항체 품질과 표적 단백질에 따라 다릅니다(그림 1).

1. 시료 전처리
   1. 제조업체의 지침에 따라 약 1.077g/mL 밀도의 매체를 통해 밀도 구배 원심분리를 통해 인간 말초....

토론

본 연구에서는 인간 T 림프구에서 핵 단백질에 대한 면역형광 실험을 수행하는 방법을 제시한다. 이 방법은 앞서 설명한 바와 같이 고정 및 투과화 단계에서의 사소한 수정을 통해 다양한 세포 유형에 사용할 수 있는 유연성을 제공합니다(^30,31).

당사의 이미징 워크플로우는 문헌에 요약된 확립된 기술, 특히 FindFoci 및 3D Suite

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Safe-Lock Tubes	Eppendord	#0030121503	Protocol section 1
10 mL Serological pipettes	VWR	#612-3700	Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2149P-HR	Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	#352070	Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	#A7030	Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation Kit	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	Cat#D1306	Step 1.3.10.
Dry ice			Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	magnetic beads step 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0	-	-	Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)	Electron Microscopy Sciences	#72298-13	Step 1.2.1.
Glycerol	Sigma	#G5516	Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody	Invitrogen	A11036	Step 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Step 1.1.4.
human recombinant IL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Step 1.1.4.
human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope	Leica Microsystems	-	Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life Technologies	#11140035	Step 1.1.4.
Microscope Slides	VWR	#631-1552	Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)	BD Bioscience	#557871	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)	BD Bioscience	#552888	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Step 1.1.3.
Multiwell 24 well	Falcon	#353047	Protocol section 1
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000	Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution	Life Technologies	#15070063	Step 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Step 1.2.4.
poly-L-lysine	Sigma	#P8920	1.2.1.
Primary antibody - BRD4	Abcam	#ab128874	Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12	Cel Signalling	mAb #3737	Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate	Life Technologies	#11360039	Step 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Step 1.3.
Tweezers	-	-	Protocol section 1