Un pipeline polyvalent pour l’analyse des changements dynamiques dans les corps nucléaires dans une variété de types de cellules

Résumé

Cette méthode décrit un protocole d’immunofluorescence et un pipeline de quantification pour évaluer la distribution des protéines avec des modèles d’organisation nucléaire variés dans les lymphocytes T humains. Ce protocole fournit des conseils étape par étape, en commençant par la préparation des échantillons et en continuant par l’exécution d’une analyse semi-automatisée aux Fidji, se terminant par le traitement des données par un ordinateur portable Google Colab.

Résumé

Divers processus nucléaires, tels que le contrôle transcriptionnel, se produisent dans des structures discrètes appelées foyers qui sont discernables grâce à la technique d’immunofluorescence. L’étude de la dynamique de ces foyers dans diverses conditions cellulaires par microscopie fournit des informations précieuses sur les mécanismes moléculaires qui régissent l’identité et les fonctions cellulaires. Cependant, la réalisation de tests d’immunofluorescence sur différents types de cellules et l’évaluation des altérations dans l’assemblage, la diffusion et la distribution de ces foyers présentent de nombreux défis. Ces défis englobent la complexité de la préparation des échantillons, de la détermination des paramètres d’analyse des données d’imagerie et de la gestion de volumes de données importants. De plus, les flux de travail d’imagerie existants sont souvent adaptés aux utilisateurs expérimentés, ce qui limite l’accessibilité à un public plus large.

Dans cette étude, nous présentons un protocole d’immunofluorescence optimisé conçu pour l’étude des protéines nucléaires dans différents types de lymphocytes T primaires humains qui peuvent être personnalisés pour n’importe quelle protéine d’intérêt et type de cellule. De plus, nous présentons une méthode pour quantifier de manière impartiale la coloration des protéines, qu’elles forment des foyers distincts ou qu’elles présentent une distribution nucléaire diffuse.

La méthode que nous proposons offre un guide complet, de la coloration cellulaire à l’analyse, en s’appuyant sur un pipeline semi-automatisé développé à Jython et exécutable aux Fidji. De plus, nous fournissons un script Python convivial pour rationaliser la gestion des données, accessible publiquement sur un cahier Google Colab. Notre approche a démontré son efficacité à produire des analyses d’immunofluorescence très informatives pour des protéines présentant divers modèles d’organisation nucléaire dans différents contextes.

Introduction

L’organisation du génome eucaryote est régie par de multiples couches de modifications épigénétiques¹, coordonnant plusieurs fonctions nucléaires qui peuvent se produire dans des compartiments spécialisés appelés corps nucléaires ou condensats². Au sein de ces structures, des processus tels que l’initiation de la transcription³, le traitement de l’ARN ^4,5,6, la réparation de l’ADN ^7,8, la biogenèse des ribosomes ^9,10,11

Protocole

L’utilisation d’échantillons humains à des fins de recherche a été approuvée par les comités d’éthique de la Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milan), et le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets (numéros d’autorisation : 708_2020). Le protocole est organisé en trois sections principales : l’exécution de l’immunofluorescence, l’acquisition d’images et l’analyse d’images. En moyenne, il faut 4 jours ouvrables pour le réaliser (Figure 1).

1. Préparation par immunofluorescence

REMA....

Discussion

Dans cette étude, nous présentons une méthode pour réaliser des expériences d’immunofluorescence sur des protéines nucléaires dans des lymphocytes T humains. Cette méthode offre une flexibilité d’utilisation avec différents types de cellules grâce à des modifications mineures dans les étapes de fixation et de perméabilisation, comme décrit précédemment^30,31.

Notre flux de travail d’imagerie s’appuie sur des tec.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Safe-Lock Tubes	Eppendord	#0030121503	Protocol section 1
10 mL Serological pipettes	VWR	#612-3700	Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2149P-HR	Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	#352070	Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	#A7030	Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation Kit	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	Cat#D1306	Step 1.3.10.
Dry ice			Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	magnetic beads step 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0	-	-	Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)	Electron Microscopy Sciences	#72298-13	Step 1.2.1.
Glycerol	Sigma	#G5516	Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody	Invitrogen	A11036	Step 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Step 1.1.4.
human recombinant IL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Step 1.1.4.
human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope	Leica Microsystems	-	Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life Technologies	#11140035	Step 1.1.4.
Microscope Slides	VWR	#631-1552	Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)	BD Bioscience	#557871	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)	BD Bioscience	#552888	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Step 1.1.3.
Multiwell 24 well	Falcon	#353047	Protocol section 1
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000	Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution	Life Technologies	#15070063	Step 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Step 1.2.4.
poly-L-lysine	Sigma	#P8920	1.2.1.
Primary antibody - BRD4	Abcam	#ab128874	Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12	Cel Signalling	mAb #3737	Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate	Life Technologies	#11360039	Step 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Step 1.3.
Tweezers	-	-	Protocol section 1