さまざまな細胞タイプの原子核体の動的変化を解析するための汎用性の高いパイプライン

要約

この方法は、ヒトTリンパ球のさまざまな核組織パターンを持つタンパク質分布を評価するための免疫蛍光プロトコルと定量パイプラインを示しています。このプロトコルは、サンプル調製から始まり、フィジーでの半自動分析の実行まで、段階的なガイダンスを提供し、Google Colabノートブックによるデータ処理で終わります。

要約

転写制御などのさまざまな核プロセスは、免疫蛍光法によって識別可能な病巣として知られる個別の構造内で発生します。顕微鏡を用いて多様な細胞条件下でのこれらの病巣の動態を調査することで、細胞の同一性と機能を支配する分子メカニズムに関する貴重な洞察が得られます。しかし、異なる細胞タイプで免疫蛍光アッセイを実施し、これらの病巣の組み立て、拡散、分布の変化を評価するには、多くの課題があります。これらの課題には、サンプル調製の複雑さ、イメージングデータを解析するためのパラメータの決定、大量のデータの管理などが含まれます。さらに、既存のイメージングワークフローは、熟練したユーザー向けに調整されていることが多いため、より広範なオーディエンスへのアクセスが制限されています。

この研究では、さまざまなヒト初代T細胞タイプの核タンパク質を調査するために最適化された免疫蛍光プロトコルを導入し、関心のある任意のタンパク質と細胞タイプに合わせてカスタマイズできます。さらに、タンパク質染色が明確な病巣を形成するか、拡散した核分布を示すかにかかわらず、タンパク質染色を偏りなく定量する方法を提示します。

私たちが提案する方法は、Jythonで開発され、フィジーで実行可能な半自動パイプラインを活用して、細胞染色から分析までの包括的なガイドを提供します。さらに、データ管理を効率化するユーザーフレンドリーなPythonスクリプトを提供し、Google Colabノートブックで公開されています。私たちのアプローチは、さまざまな状況で多様な核組織化パターンを持つタンパク質の非常に有益な免疫蛍光分析を実現する有効性を実証しています。

概要

真核生物のゲノムの組織化は、エピジェネ^{ティックな修飾}1の複数の層によって支配されており、核体または凝縮物²と呼ばれる特殊なコンパートメント内で発生する可能性のあるいくつかの核機能を調整しています。これらの構造内では、転写開始³、RNAプロセシング^4,5,6、DNA修復^7,8、リボソーム生合成^9,10,11、ヘテロクロマチン制御^12,13などのプロセスが進行します。核体の調節は、相分離^{の原理14,15}に導かれて、細胞の要件に対応するために空間的および時間的次元の両方で調整され....

プロトコル

研究目的でのヒトサンプルの使用は、Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milan) の倫理委員会によって承認され、すべての被験者からインフォームド コンセントが得られました (承認番号: 708_2020)。このプロトコールは、免疫蛍光法の実行、画像取得、および画像解析の3つの主要なセクションで構成されています。平均して、完了するまでに4営業日かかります(図1)。

1. 免疫蛍光法の調製

注:この免疫蛍光プロトコルは、固定および透過化条件を調整することにより、さまざまな細胞タイプおよびタンパク質ターゲットに対して容易にカスタマイズできます。免疫蛍光染色の調製は、通常、完了までに3日未満で完了し、一次抗体のインキュベーション期間は抗体の品質と標的タンパク質によって異なります(図1)。

1. サンプル調製
   1. 製造元の指示に従って、密度約1.077 g / mLの培地を介した密度勾配遠心分離により、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を単離します(材料表<....

ディスカッション

本研究では、ヒトTリンパ球の核タンパク質に対する免疫蛍光実験を行う方法を紹介します。この方法は、前述のように、固定および透過化ステップのわずかな変更を通じて、さまざまな細胞タイプで使用するための柔軟性を提供します^30,31。

当社のイメージングワークフローは、文献、特にFindFociと3D Suite^22,23.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Safe-Lock Tubes	Eppendord	#0030121503	Protocol section 1
10 mL Serological pipettes	VWR	#612-3700	Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2149P-HR	Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	#352070	Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	#A7030	Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation Kit	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	Cat#D1306	Step 1.3.10.
Dry ice			Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	magnetic beads step 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0	-	-	Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)	Electron Microscopy Sciences	#72298-13	Step 1.2.1.
Glycerol	Sigma	#G5516	Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody	Invitrogen	A11036	Step 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Step 1.1.4.
human recombinant IL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Step 1.1.4.
human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope	Leica Microsystems	-	Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life Technologies	#11140035	Step 1.1.4.
Microscope Slides	VWR	#631-1552	Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)	BD Bioscience	#557871	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)	BD Bioscience	#552888	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Step 1.1.3.
Multiwell 24 well	Falcon	#353047	Protocol section 1
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000	Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution	Life Technologies	#15070063	Step 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Step 1.2.4.
poly-L-lysine	Sigma	#P8920	1.2.1.
Primary antibody - BRD4	Abcam	#ab128874	Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12	Cel Signalling	mAb #3737	Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate	Life Technologies	#11360039	Step 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Step 1.3.
Tweezers	-	-	Protocol section 1