用于分析各种细胞类型中核体动态变化的多功能管道

摘要

该方法描述了一种免疫荧光方案和定量管道，用于评估人 T 淋巴细胞中具有不同核组织模式的蛋白质分布。该协议提供了分步指导，从样品制备开始，一直到斐济的半自动分析执行，最后通过 Google Colab 笔记本进行数据处理。

摘要

各种核过程，例如转录控制，发生在称为病灶的离散结构中，可通过免疫荧光技术进行识别。通过显微镜研究这些病灶在不同细胞条件下的动力学，可以深入了解控制细胞身份和功能的分子机制。然而，对不同细胞类型进行免疫荧光检测并评估这些病灶的组装、扩散和分布的改变存在许多挑战。这些挑战包括样品制备、分析成像数据的参数确定以及大量数据管理方面的复杂性。此外，现有的成像工作流程通常是为熟练用户量身定制的，因此限制了更广泛的受众的可访问性。

在这项研究中，我们引入了一种优化的免疫荧光方案，该方案专为研究不同人类原代 T 细胞类型中的核蛋白而量身定制，该方案可以针对任何感兴趣的蛋白质和细胞类型进行定制。此外，我们提出了一种无偏量化蛋白质染色的方法，无论它们是否形成不同的病灶或表现出弥漫的核分布。

我们提出的方法提供了一个全面的指南，从细胞染色到分析，利用在 Jython 中开发并在斐济执行的半自动化管道。此外，我们还提供了一个用户友好的 Python 脚本来简化数据管理，可在 Google Colab 笔记本上公开访问。我们的方法已证明对在不同环境中具有不同核组织模式的蛋白质进行信息丰富的免疫荧光分析的有效性。

引言

真核生物基因组的组织由多层表观遗传修饰¹ 控制，协调可能发生在称为核体或凝聚物² 的特殊隔室中的几种核功能。在这些结构中，发生转录起始³、RNA 加工 ^4,5,6、DNA 修复 ^7,8、核糖体生物发生^9、10、¹¹ 和异染色质调节^12,13 等过程。在相分离原理的指导下，核体的调节在空间和时间维度上进行调整，以适应细胞需求^14,15。因此，这些物体充当了瞬态工厂的功能，功能组件在这里组装和拆卸，大小和空间分布发生变化。因此，通过显微镜了解核蛋白的特性，包括它们形成体的倾向及其在不同细胞条件下的空间排列，为了解它们的功能作用提供了有价值的见解。荧光显微镜检查是一种广泛用于研究核蛋白的方法，可通过荧光抗体检测核蛋白，或使用荧光蛋白报告基因直接表达靶标^16,17。

在这种情况下，核体表现为明亮的焦点或点状，具有显着的球形度，使其很容易与周围环境区分开^{来 16,18}。STORM 和 PALM 等超分辨率技术通过提供更高的分辨率（高达 10 nm）¹⁹，能够更精确地表征特定凝聚物的结构和组成²⁰。然而，它们的可访问性受到设备费用和数据分析所需专业技能的限制。因此，共聚焦显微镜仍然很受欢迎，因为它在分辨率和更广泛的使用之间取得了良好的平衡。这种流行是由于固有的离焦光去除，这减少了对精确分割的广泛后处理程序的要求、它在研究机构中的广泛可用性、有效的采集时间以及通常高效的样品制备。然而，使用免疫荧光检测在不同细胞条件下准确测量蛋白质分布、组装或扩散带来了挑战，因为许多现有方法缺乏为具有不同分布模式的蛋白质选择合适的参数的指导²¹。此外，对于数据分析经验有限的用户来说，处理产生的大量数据可能会令人生畏，这可能会损害结果的生物学意义。

为了应对这些挑战，我们引入了免疫荧光制备和数据分析的详细分步方案，旨在提供一种无偏的方法来量化具有各种组织模式的蛋白质染色（图 1）。此半自动管道专为计算和成像分析专业知识有限的用户而设计。它结合了两个成熟的斐济插件的功能:FindFoci²² 和 3D suite²³。通过将 FindFoci 的精确焦点识别功能与 3D 套件提供的 3D 空间中的对象识别和分割功能集成，我们的方法为每个采集区域的每个通道生成两个 CSV 文件。这些文件包含补充信息，有助于计算适用于各种类型信号分布的指标，例如每个细胞的病灶计数、病灶与核质心的距离以及我们引入的用于弥散蛋白染色的不均匀系数 （IC）。此外，我们承认，对于数据处理技能有限的用户来说，数据外推可能非常耗时。为了简化此过程，我们提供了一个 Python 脚本，该脚本可自动将每个实验的所有收集的测量值编译到一个文件中。用户无需安装任何编程语言软件即可执行此脚本。我们在 Google Colab 上提供了可执行代码，这是一个基于云的平台，允许直接在浏览器中编写 Python 脚本。这确保了我们的方法直观且易于立即使用。

我们证明了我们的方案在分析和量化两种核蛋白信号分布改变方面的有效性:含溴结构域的蛋白 4 （BRD4） 和 zeste-12 抑制因子 （SUZ12）。BRD4 是 Mediator 复合体中一种有据可查的共激活因子蛋白，已知可形成与聚合酶 II 依赖性转录起始相关的缩合物^24,25。SUZ12 是多梳抑制复合物 2 （PRC2） 的蛋白质组分，负责调节 H3K27me3 组蛋白修饰的沉积^26,27。这些蛋白质在两种不同的细胞类型中表现出不同的模式:新鲜分离的人 CD4⁺ 幼稚 T 细胞，它们是静止的，转录活性速度较慢，以及体外分化的 T_H1 CD4⁺ 细胞，它们是特化的增殖效应细胞，显示转录增加²⁸。

研究方案

将人类样本用于研究目的已获得 Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico （IRCCS） Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico（米兰）伦理委员会的批准，并获得了所有受试者的知情同意（授权号:708_2020）。该方案分为三个主要部分:免疫荧光执行、图像采集和图像分析。平均而言，需要 4 个工作日才能完成（图 1）。

1. 免疫荧光制备

注:通过调整固定和透化条件，该免疫荧光方案可以很容易地针对各种细胞类型和蛋白质靶标进行定制。免疫荧光制备通常需要不到 3 天的时间才能完成，一抗孵育的持续时间因抗体质量和靶蛋白而异（图 1）。

1. 样品制备
   1. 根据制造商的说明（材料表），通过密度梯度离心通过密度约为 1.077 g/mL 的培养基分离人外周血单核细胞 （PBMC）。
   2. 按照制造商的说明（材料表），用磁珠从 PBMC 中分离 CD4 ⁺ T 细胞。
   3. 用 CD4、CD45RA 和 CD45RO 抗体对细胞进行染色（材料表），并继续将初始 CD4 ⁺ T 细胞进行 FACS 分选为 CD4 ⁺ / CD45RA ⁺ / CD45RO ^- 细胞，如其他地方所述^29,30。
      注意:有关本协议中使用的 FACS 分拣机的规格，请参阅 材料表 。
   4. 诱导幼稚 CD4 ⁺ T 细胞分化为辅助性 T 细胞 1（T_H1 CD4 ⁺ 细胞），如 ²⁹ 中所述。简而言之，在 T_H1 培养基中培养 1.5 x 10⁶ 个细胞/mL 的 FACS 分选的幼稚 CD4 ⁺ T 细胞，以 1:1 的比例用抗 CD3/抗 CD28 磁珠刺激它们。每 2-3 天对细胞进行计数并×达到 1.5^{10 6} 个细胞/mL 时将其分开（T_H1 培养基组成见表 1）。
   5. 如 ²⁹所述，评估分化7天后效应功能细胞因子的分泌。
2. 细胞固定和透化
   注意:所有这些程序都在 ^30,31 中进行了描述^，并进行了细微的调整。
   1. 为确保最佳细胞粘附，用涂层溶液（表 1）处理玻璃盖玻片（10 mm，厚度 1.5 H），如下所示:
      1. 清洁玻璃盖玻片，首先用蒸馏水 （ddH₂O） 清洗，然后用 70% 乙醇 （EtOH） 冲洗，并让它们风干。
      2. 将洗涤过的盖玻片放入 24 多孔板中进行步骤 1.2.1.3-1.3。
      3. 将 200 μL 涂层溶液滴在玻璃盖玻片上。5 分钟后，取出滴剂并风干。
      4. 滴入 200 μL ddH₂O 清洗盖玻片。5 分钟后，取出液滴并风干。
      5. 重复 3 x 步骤 1.2.1.3-1.2.1.4。
   2. 将初始 CD4 ⁺ T 细胞和 T_H1 CD4 ⁺ 细胞重悬于 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，浓度为 2 × 10⁶ 个细胞/mL。
      注:建议的浓度专门用于小细胞，例如人原代 T 淋巴细胞。对于贴壁细胞，无需进行玻璃涂层处理。相反，使用适当的细胞培养基直接在玻璃表面培养细胞。
   3. 将 200 μL 细胞悬液滴在玻璃盖玻片上。让细胞在室温 （RT） 下接种 30 分钟;然后，移除液滴。
   4. 在室温下用新鲜过滤的 3% 多聚甲醛（PFA 溶液， 表 1）固定细胞 10 分钟。
   5. 在 RT 下用 TPBS（表 1）清洗玻璃盖玻片 3 x 5 分钟。
   6. 去除 TPBS 并在 RT 下添加透化溶液（表 1）10 分钟。
   7. 弃去透化溶液，将样品在储存溶液（表 1）中孵育 1 小时至 4 °C 过夜 （ON）。
      注意:在此阶段，可以安全地停止方案，并且玻璃盖玻片可以在 24 多孔板的储存溶液中保存 3-4 周。
3. 免疫荧光
   1. （可选）从 24 多孔板中取出盖玻片，在干冰上快速冷冻 30 秒，在 RT 下解冻，然后在装有储存溶液的预装孔中清洗玻璃盖玻片。
   2. （可选）重复 3 x 步骤 1.3.1。
   3. 在 RT 下在透化溶液中洗涤 5 分钟。接下来，在 RT 下用 TPBS 洗涤 2 x 5 分钟。
   4. 在 RT 下在 0.1 N HCl 中孵育 12 分钟。
   5. 在 1x PBS 中进行两次快速洗涤。
      注:指定的细胞透化条件，包括冻融步骤和 HCl 处理，最适合对以密集排列的染色质为特征的细胞中的核成分进行染色。然而，当处理以较不紧密的染色质为特征的细胞时，建议减少或避免这些步骤。此外，对于靶向细胞质成分，请考虑减少或消除 HCl 处理。
   6. 在 4 °C 下用在抗体稀释缓冲液（表 1）中稀释的一抗（BRD4,1:500 或 SUZ12,1:100）（每个玻璃盖玻片 200 μL）孵育细胞。
      注:免疫荧光可以通过多重检测多种一抗来进行，具体取决于实验需要、二抗和检测系统。
   7. 在 RT 下用 PBS-T（表 1）洗涤 3 x 5 分钟，同时轻轻摇晃。
   8. 将细胞与在抗体稀释缓冲液（每个玻璃盖玻片 200 μL）中稀释的二抗在 RT 下孵育 1 小时。
      注:选择最适合实验需求和可用检测系统的二抗。确保每种二抗都靶向一抗来源的物种。此外，选择与显微镜滤光片和光源兼容的荧光基团。避免所选荧光基团与细胞核染色剂的发射光谱之间的光谱重叠至关重要。
   9. 在 RT 下用 PBS-T 洗涤 3 x 5 分钟，同时轻轻摇晃。
   10. 在 RT 下用 1 ng/mL 用 1x PBS 稀释的 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 染色 5 分钟。
       注:替代染料可用于细胞核染色，只要它们不与二抗的发射光谱重叠。
   11. 在 1x PBS 中进行几次快速洗涤。
   12. 将玻璃盖玻片安装在带有抗褪色封固剂的显微镜载玻片上。

2. 图像采集

注:图像采集的持续时间取决于仪器和所选设置。

1. 共聚焦显微镜采集
   1. 使用共聚焦显微镜捕获 3D 图像，在 z 轴上设置步长为 0.25 μm，像素大小为 0.1-0.2 μm。
      注意:为了使用我们的 63 倍 1.4 NA 油物镜实现最佳的光衍射极限分辨率，我们将针孔大小设置为 0.8 AU，2 倍线平均，帧大小为 1024 × 1024 像素。激发激光器和通道采集序列经过精心选择，以防止所用荧光团之间的干扰或串扰。但是，参数的调整应根据特定的显微镜和标本特性进行调整。有关本协议中使用的共聚焦显微镜的规格 ，请参阅材料表 。
   2. 获取一致数量的随机场，每个生物重复包含大约 50 个细胞。

3. 图像分析

1. 软件安装
   1. 从斐济官方下载页面 （https://imagej.net/software/fiji/downloads） 下载并安装 斐济 的最新版本。
   2. 通过斐济更新站点安装 3D Suite，或按照 3D Suite 网站 （https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download） 上的说明手动安装 3D Suite。
   3. 通过 Fiji 更新站点安装 GDSC （FindFoci），或按照 GitHub 存储库 （https://github.com/aherbert/gdsc） 上的说明手动安装 GDSC （FindFoci）。
2. TIFF 转换
   1. 下载 "convert_to_TIFF.py" 脚本（补充文件 1）。
   2. 将脚本拖放到 Fiji 上并运行代码。
   3. 在显示的面板中，浏览到存储试验的路径。包含已转换的 TIFF 文件的子文件夹将在同一实验文件夹中创建。
3. 在 3D 管理器上初始化设置。
   1. 通过单击插件 | 3DSuite | 3D 管理器选项打开 3D 管理器选项面板。
   2. 在 3D 管理器选项窗口中，选中与以下测量值对应的复选框:体积（单位）、平均灰度值、边界框（像素）、标准差灰度值、质心（像素）和质心（单位）。
   3. 勾选以下选项:排除 XY 边缘上的对象 和 排除 Z 边缘上的对象，然后单击 OK。
      注意:此步骤只需执行一次，即可对将存储在空间和定量信息文件中的指标进行初始配置。所选指标对于确保管道正常运行至关重要。此步骤中可以包含可选的其他量度，如 Discussion 部分所述。
4. 在 FindFoci GUI 上设置参数。
   注意:此步骤只需执行一次，即可使用最佳参数配置半自动管道，然后将其合并到脚本中。
   1. 打开测试图像。复制蛋白质通道，包括堆栈 （Ctrl + Shift + D），选中 hyperstack 复选框，并在 通道 （c） 框中指定适当的通道编号，并相应地重命名。
   2. 通过导航到 宏Plugins |宏 |记录。
   3. 打开 FindFoci 插件（单击 插件 |GDSC |查找焦点 |FindFoci GUI），然后从 "Image" 下拉菜单中选择要分析的图像。
   4. 按如下方式设置参数（图 2A）:高斯模糊 = 1.5;背景法 = SD 以上平均值;背景参数 = 9;搜索方法 = 峰的分数 - 背景;搜索参数 = 0.7;峰值方法 = 相对高于背景;峰值参数 = 0.2;最小大小 = 5;最大峰值 = 1,000,000。
      注意:指示的参数是根据我们的案例研究选择的，可能不适用于其他染色程序。
   5. 要增强焦点识别，请调整以下参数:
      1. Gaussian blur 定义平滑程度以获得更好的段焦点。使其靠近焦点直径（像素）。
      2. background param 设置一个阈值来区分背景和焦点信号。增加值以施加更严格的阈值。
      3. 搜索参数 定义信号识别中包含的峰的荧光百分比。减小值以包括远离荧光峰的区域。
      4. Peak param （峰值参数） 确定两个信号峰值被视为连续或分离的程度。减小该值将导致峰分离。
      5. Max peaks （最大峰值） 指定可识别的焦点的最大数量。设置较高的数字以包括图像中的所有焦点。
   6. 运行 FindFoci 并复制出现在记录器窗口（步骤 3.4.2， 图 2B）中的字符串，其中包含所选参数，不包括引号。有关设置的更多信息，请参阅插件手册说明 ²²。
5. 核蛋白定量流程
   1. 下载脚本 "nuclear_prot_q.py" （补充文件 2）。
   2. 将脚本拖放到 Fiji 上，然后单击 run 以执行代码。
   3. 按照显示的对话框中的说明处理图像。
      1. Nucleus channel:输入与 DAPI（或任何细胞核染色）通道对应的数字。
      2. Nucleus Gaussian Blur:输入模糊图像以进行分割所需的 sigma 值。
         注意:将此参数保持在更靠近细胞核直径（即 5-6 μm）的位置。较高的 sigma 值表示不均匀染色。
      3. Protein channel:输入与目标染色通道对应的数字。
      4. FindFoci 参数:粘贴从段落 3.4.6 中的宏录制步骤获得的字符串（图 2B）。
      5. （可选） 质量控制:检查分割细胞核的质量。这将暂停脚本并允许手动检查每个生成的感兴趣核区域 （ROI）。
      6. 选择图像目录:单击 浏览 按钮导航到包含要分析的 TIFF 文件的文件夹。
   4. 编译完所有框后，单击 OK 继续执行。
   5. 如果细胞核未正确分割且无法满足质量要求，请按照 图 2C 中的指示删除或修改它。
      1. 检查 ROIManager3D 窗口中的 ROI 列表;如果列表为空，请选择合并窗口，然后单击 Quantify 3D 以刷新管理器。然后，关闭 Quantify 3D 结果表。选择 Nuclei 通道，然后单击 Live-ROI 到 ON。
      2. 选择属于同一细胞核的 ROI，然后按 Merge（合并 ）或在不需要的细胞核的情况下按 Delete（删除 ）。
      3. 单击 select all （全选），然后单击 Mask check （掩码检查） 窗口中的 OK 继续分析。
      4. 有关结果，请查看步骤 3.5.3.6 中指示的文件路径中的 Quantification 文件夹 ，其中包含一个 txt 文件，其中包含用于分析的参数记录。
6. Google Colab 上的 Pipeline
   1. 下载 "final_nuclear_protein_metrics.ipynb" 笔记本（补充文件 3）。
   2. 在 Google Colab （https://colab.research.google.com/） 上打开笔记本。
   3. 将包含每个图像字段的 .csv 文件的所有文件夹上传到 Google Drive 中的首选项文件夹中。
   4. 在笔记本中指示存储结果子文件夹的文件夹的路径，并运行所有单元格。代码编译完成后，将在上传.csv文件的同一文件夹中创建包含所有已编译数据的最终电子表格文件。

结果

该方法中概述的方案有助于可视化和量化人原代 T 细胞内核蛋白染色的改变，并且可以针对不同的细胞类型和蛋白质靶标进行定制。作为案例研究，我们进行并分析了幼稚细胞和 T_H1 CD4 ⁺ 细胞中 BRD4 和 SUZ12 的染色。

BRD4 在静止幼稚和分化的 T_H1 CD4 ⁺ 细胞中均显示出良好的点状染色模式，因此能够使用设计的参数对两种细胞类型进行...

讨论

在这项研究中，我们提出了一种对人 T 淋巴细胞中的核蛋白进行免疫荧光实验的方法。如前所述，该方法通过对固定和透化步骤的微小修改，为各种细胞类型提供了灵活性^30,31。

我们的成像工作流程建立在文献中概述的既定技术之上，特别是 FindFoci 和 3D Suite ^22,23。与以前的出版物不同，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Safe-Lock Tubes	Eppendord	#0030121503	Protocol section 1
10 mL Serological pipettes	VWR	#612-3700	Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2149P-HR	Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	#352070	Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	#A7030	Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation Kit	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	Cat#D1306	Step 1.3.10.
Dry ice			Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	magnetic beads step 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0	-	-	Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)	Electron Microscopy Sciences	#72298-13	Step 1.2.1.
Glycerol	Sigma	#G5516	Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody	Invitrogen	A11036	Step 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Step 1.1.4.
human recombinant IL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Step 1.1.4.
human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope	Leica Microsystems	-	Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life Technologies	#11140035	Step 1.1.4.
Microscope Slides	VWR	#631-1552	Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)	BD Bioscience	#557871	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)	BD Bioscience	#552888	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Step 1.1.3.
Multiwell 24 well	Falcon	#353047	Protocol section 1
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000	Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution	Life Technologies	#15070063	Step 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Step 1.2.4.
poly-L-lysine	Sigma	#P8920	1.2.1.
Primary antibody - BRD4	Abcam	#ab128874	Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12	Cel Signalling	mAb #3737	Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate	Life Technologies	#11360039	Step 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Step 1.3.
Tweezers	-	-	Protocol section 1