Универсальный конвейер для анализа динамических изменений в ядерных телах в различных типах клеток

Резюме

Этот метод описывает протокол иммунофлуоресценции и конвейер количественной оценки для оценки распределения белка с различными структурами ядерной организации в Т-лимфоцитах человека. Этот протокол обеспечивает пошаговое руководство, начиная с подготовки образца и заканчивая выполнением полуавтоматического анализа на Фиджи и заканчивая обработкой данных с помощью блокнота Google Colab.

Аннотация

Различные ядерные процессы, такие как транскрипционный контроль, происходят в дискретных структурах, известных как очаги, которые можно различить с помощью метода иммунофлуоресценции. Изучение динамики этих очагов в различных клеточных условиях с помощью микроскопии дает ценную информацию о молекулярных механизмах, управляющих клеточной идентичностью и функциями. Тем не менее, проведение иммунофлуоресцентных анализов для различных типов клеток и оценка изменений в сборке, диффузии и распределении этих очагов сопряжены с многочисленными проблемами. Эти проблемы включают в себя сложности подготовки образцов, определения параметров для анализа данных визуализации и управления значительными объемами данных. Кроме того, существующие рабочие процессы обработки изображений часто адаптированы для опытных пользователей, что ограничивает доступность для более широкой аудитории.

В этом исследовании мы представляем оптимизированный протокол иммунофлуоресценции, предназначенный для изучения ядерных белков в различных типах первичных Т-клеток человека, которые могут быть настроены для любого белка, представляющего интерес, и типа клеток. Кроме того, мы представляем метод несмещенной количественной оценки окрашивания белков, независимо от того, образуют ли они отдельные очаги или демонстрируют диффузное распределение ядер.

Предлагаемый нами метод представляет собой всеобъемлющее руководство, от клеточного окрашивания до анализа, с использованием полуавтоматического конвейера, разработанного в Jython и исполняемого на Фиджи. Кроме того, мы предоставляем удобный скрипт Python для оптимизации управления данными, который находится в открытом доступе в блокноте Google Colab. Наш подход продемонстрировал свою эффективность в получении высокоинформативных иммунофлуоресцентных анализов белков с различными структурами ядерной организации в различных контекстах.

Введение

Организация эукариотического генома регулируется несколькими слоями эпигенетических модификаций¹, координирующих несколько ядерных функций, которые могут происходить в специализированных отсеках, называемых ядерными телами или конденсатами². В этих структурах происходят такие процессы, как инициация транскрипции³, процессинг РНК ^4,5,6, репарация ДНК ^7,8, биогенез рибосом ^9,10,11 и регуляци....

протокол

Использование образцов человека в исследовательских целях было одобрено Комитетами по этике Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Милан), и было получено информированное согласие всех субъектов (номер разрешения: 708_2020). Протокол состоит из трех основных разделов: выполнение иммунофлуоресценции, получение изображений и анализ изображений. В среднем для его выполнения требуется 4 рабочих дня (Рисунок 1).

1. Иммунофлюоресцентный препарат

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол иммунофлуоресценции может быть л....

Результаты

Протокол, изложенный в этом методе, облегчает визуализацию и количественную оценку изменений в окрашивании ядерных белков в первичных Т-клетках человека, и может быть адаптирован для различных типов клеток и белковых мишеней. В качестве примера мы провели и проанализировали окрашиван.......

Обсуждение

В этом исследовании мы представляем метод проведения иммунофлуоресцентных экспериментов на ядерных белках в Т-лимфоцитах человека. Этот метод обеспечивает гибкость для использования с различными типами клеток за счет незначительных изменений в этапах фиксации и пермеабилизации, ка?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Safe-Lock Tubes	Eppendord	#0030121503	Protocol section 1
10 mL Serological pipettes	VWR	#612-3700	Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2149P-HR	Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	#352070	Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	#A7030	Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation Kit	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	Cat#D1306	Step 1.3.10.
Dry ice			Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	magnetic beads step 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0	-	-	Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)	Electron Microscopy Sciences	#72298-13	Step 1.2.1.
Glycerol	Sigma	#G5516	Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody	Invitrogen	A11036	Step 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Step 1.1.4.
human recombinant IL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Step 1.1.4.
human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope	Leica Microsystems	-	Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life Technologies	#11140035	Step 1.1.4.
Microscope Slides	VWR	#631-1552	Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)	BD Bioscience	#557871	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)	BD Bioscience	#552888	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Step 1.1.3.
Multiwell 24 well	Falcon	#353047	Protocol section 1
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000	Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution	Life Technologies	#15070063	Step 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Step 1.2.4.
poly-L-lysine	Sigma	#P8920	1.2.1.
Primary antibody - BRD4	Abcam	#ab128874	Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12	Cel Signalling	mAb #3737	Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate	Life Technologies	#11360039	Step 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Step 1.3.
Tweezers	-	-	Protocol section 1