Универсальный конвейер для анализа динамических изменений в ядерных телах в различных типах клеток

Резюме

Этот метод описывает протокол иммунофлуоресценции и конвейер количественной оценки для оценки распределения белка с различными структурами ядерной организации в Т-лимфоцитах человека. Этот протокол обеспечивает пошаговое руководство, начиная с подготовки образца и заканчивая выполнением полуавтоматического анализа на Фиджи и заканчивая обработкой данных с помощью блокнота Google Colab.

Аннотация

Различные ядерные процессы, такие как транскрипционный контроль, происходят в дискретных структурах, известных как очаги, которые можно различить с помощью метода иммунофлуоресценции. Изучение динамики этих очагов в различных клеточных условиях с помощью микроскопии дает ценную информацию о молекулярных механизмах, управляющих клеточной идентичностью и функциями. Тем не менее, проведение иммунофлуоресцентных анализов для различных типов клеток и оценка изменений в сборке, диффузии и распределении этих очагов сопряжены с многочисленными проблемами. Эти проблемы включают в себя сложности подготовки образцов, определения параметров для анализа данных визуализации и управления значительными объемами данных. Кроме того, существующие рабочие процессы обработки изображений часто адаптированы для опытных пользователей, что ограничивает доступность для более широкой аудитории.

В этом исследовании мы представляем оптимизированный протокол иммунофлуоресценции, предназначенный для изучения ядерных белков в различных типах первичных Т-клеток человека, которые могут быть настроены для любого белка, представляющего интерес, и типа клеток. Кроме того, мы представляем метод несмещенной количественной оценки окрашивания белков, независимо от того, образуют ли они отдельные очаги или демонстрируют диффузное распределение ядер.

Предлагаемый нами метод представляет собой всеобъемлющее руководство, от клеточного окрашивания до анализа, с использованием полуавтоматического конвейера, разработанного в Jython и исполняемого на Фиджи. Кроме того, мы предоставляем удобный скрипт Python для оптимизации управления данными, который находится в открытом доступе в блокноте Google Colab. Наш подход продемонстрировал свою эффективность в получении высокоинформативных иммунофлуоресцентных анализов белков с различными структурами ядерной организации в различных контекстах.

Введение

Организация эукариотического генома регулируется несколькими слоями эпигенетических модификаций¹, координирующих несколько ядерных функций, которые могут происходить в специализированных отсеках, называемых ядерными телами или конденсатами². В этих структурах происходят такие процессы, как инициация транскрипции³, процессинг РНК ^4,5,6, репарация ДНК ^7,8, биогенез рибосом ^9,10,11 и регуляция гетерохроматина ^12,13. Регуляция ядерных тел корректируется как в пространственном, так и во временном измерениях, чтобы удовлетворить потребности клеток, руководствуясь принципами разделения фаз^14,15. Следовательно, эти тела функционируют как переходные фабрики, где функциональные компоненты собираются и разбираются, претерпевая изменения в размерах и пространственном распределении. Таким образом, понимание характеристик ядерных белков с помощью микроскопии, включая их склонность к образованию тел и их пространственное расположение в различных клеточных условиях, дает ценную информацию об их функциональных ролях. Флуоресцентная микроскопия является широко используемым методом изучения ядерных белков, позволяющим обнаруживать их с помощью флуоресцентных антител или непосредственно экспрессировать мишени с помощью флуоресцентного белка-репортера^16,17.

В этом контексте ядерные тела предстают в виде ярких очагов или точек, с заметной степенью сферичности, что делает их легко отличимыми от^{окружающей среды.} Методы сверхвысокого разрешения, такие как STORM и PALM, обеспечивая улучшенное разрешение (до 10 нм)¹⁹, позволяют более точно характеризовать структуру и состав конкретных^{конденсатов20}. Однако их доступность ограничена затратами на оборудование и специальными навыками, необходимыми для анализа данных. Таким образом, конфокальная микроскопия остается популярной благодаря выгодному балансу между разрешением и более широким использованием. Такой популярности способствует неизбежное удаление расфокусированного света, что снижает потребность в обширных процедурах постобработки для точной сегментации, его широкой доступности в научно-исследовательских институтах, эффективном времени получения и обычно эффективной подготовке образцов. Тем не менее, точное измерение распределения, сборки или диффузии белка с помощью иммунофлуоресцентных анализов в различных клеточных условиях представляет собой проблему, поскольку во многих существующих методах отсутствуют рекомендации по выбору подходящих параметров для белков с различными моделями распределения^. Кроме того, обработка большого объема данных может быть сложной задачей для пользователей с ограниченным опытом анализа данных, что может поставить под угрозу биологическую значимость результатов.

Для решения этих проблем мы представляем подробный пошаговый протокол подготовки иммунофлуоресценции и анализа данных, направленный на обеспечение объективного метода количественной оценки окрашивания белков с различными структурами организации (Рисунок 1). Этот полуавтоматический конвейер предназначен для пользователей с ограниченными знаниями в области вычислительного анализа и анализа изображений. Он сочетает в себе функции двух известных фиджийских плагинов: FindFoci²² и 3D suite²³. Благодаря интеграции возможностей точной идентификации очагов FindFoci с функциями идентификации объектов и сегментации в 3D-пространстве, предлагаемыми 3D Suite, наш подход генерирует два файла CSV на канал для каждой области приобретения. Эти файлы содержат дополнительную информацию, которая облегчает расчет метрик, подходящих для различных типов распределения сигналов, таких как количество очагов на ячейку, расстояние фокусов от ядерного центроида и коэффициент неоднородности (IC), который мы ввели для диффузного окрашивания белков. Кроме того, мы признаем, что экстраполяция данных может отнимать много времени у пользователей с ограниченными навыками работы с данными. Чтобы упростить этот процесс, мы предоставляем скрипт Python, который автоматически компилирует все собранные измерения в один файл для каждого эксперимента. Пользователи могут выполнять этот скрипт без необходимости установки какого-либо программного обеспечения на языке программирования. Мы предоставляем исполняемый код на Google Colab, облачной платформе, которая позволяет писать скрипты Python прямо в браузере. Это гарантирует, что наш метод интуитивно понятен и легко доступен для немедленного использования.

Мы демонстрируем эффективность нашего протокола в анализе и количественной оценке изменений в распределении сигнала двух ядерных белков: бромдомен-содержащего белка 4 (BRD4) и супрессора zeste-12 (SUZ12). BRD4 является хорошо документированным белком-коактиватором в составе медиаторного комплекса, который, как известно, образует конденсаты^, связанные с полимеразой II-зависимой инициацией транскрипции^24,25. SUZ12 является белковым компонентом репрессивного комплекса Polycomb 2 (PRC2), отвечающего за регуляцию отложения гистона H3K27me3 модификации^26,27. Эти белки демонстрируют различные паттерны в двух различных типах клеток: свежевыделенные человеческие CD4⁺ наивные Т-клетки, которые находятся в состоянии покоя и демонстрируют медленную скорость транскрипционной активности, и дифференцированные in vitro T_H1 CD4⁺ клетки, которые являются специализированными, пролиферирующими эффекторными клетками, демонстрирующими повышенную транскрипцию^.

протокол

Использование образцов человека в исследовательских целях было одобрено Комитетами по этике Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Милан), и было получено информированное согласие всех субъектов (номер разрешения: 708_2020). Протокол состоит из трех основных разделов: выполнение иммунофлуоресценции, получение изображений и анализ изображений. В среднем для его выполнения требуется 4 рабочих дня (Рисунок 1).

1. Иммунофлюоресцентный препарат

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол иммунофлуоресценции может быть легко настроен для различных типов клеток и белковых мишеней путем регулировки условий фиксации и пермеабилизации. Иммунофлуоресцентный препарат обычно занимает менее 3 дней, при этом продолжительность первичной инкубации антител варьируется в зависимости от качества антител и целевого белка (рис. 1).

1. Подготовка образцов
   1. Выделите мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) с помощью центрифугирования с градиентом плотности в среде с плотностью около 1,077 г/мл в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов).
   2. Выделите CD4⁺ Т-клетки из PBMC с помощью магнитных шариков, следуя инструкциям производителя (Таблица материалов).
   3. Окрашивают клетки антителами к CD4, CD45RA и CD45RO (Таблица материалов) и приступают к FACS-сортировке наивных CD4^{+ Т-клеток как} CD4⁺/CD45RA⁺/CD45RO-клетки, как описано в других разделах^29,30.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Технические характеристики сортировщика FACS, используемого в этом протоколе, см. в Таблице материалов .
   4. Индуцировать дифференцировку наивных CD4⁺ Т-клеток в Т-хелперы 1 (T,_H1, CD4⁺ клетки), как описано в ^{пункте 29}. Вкратце, культивируют 1,5 x 10⁶ клеток/мл наивных CD4⁺ Т-клеток, отсортированных методом FACS, в среде T_H1, стимулируя их анти-CD3/анти-CD28 магнитными шариками в соотношении 1:1. Подсчитайте клетки и разделите их, когда они достигнут 1,5 ×^{10 6} клеток/мл каждые 2-3 дня (см. Таблицу 1 для среднего состава T_H1).
   5. Оцените секрецию цитокинов эффекторной функции после 7 дней дифференцировки, как описано в ^{пункте 29}.
2. Фиксация клеток и пермеабилизация
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти процедуры были описаны в ^30,31 с незначительными адаптациями.
   1. Для обеспечения оптимальной адгезии ячеек обрабатывайте стеклянные покровные стекла (10 мм, толщина 1,5 H) раствором для нанесения покрытий (Таблица 1) следующим образом:
      1. Очистите стеклянные покровные стекла, сначала промойте их дистиллированной водой (ddH₂O), затем промойте 70% этанолом (EtOH) и дайте им высохнуть на воздухе.
      2. Поместите промытые покровные стекла в 24-многолуночную пластину для выполнения шагов 1.2.1.3-1.3.
      3. Нанесите каплю 200 μл лакокрасочного раствора на стеклянную защитную крышку. Через 5 минут удалите каплю и дайте ей высохнуть на воздухе.
      4. Промойте покровные стекла, нанеся каплю 200 μL ddH₂O. Через 5 минут удалите каплю и высушите на воздухе.
      5. Повторите 3 шага 1.2.1.3-1.2.1.4.
   2. Ресуспендируйте наивные CD4⁺ Т-клетки и T_H1 CD4⁺ клетки в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) в концентрации 2 × 10⁶ клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Указанная концентрация рекомендуется специально для малых клеток, таких как первичные Т-лимфоциты человека. Для адгезивных клеток обработка стеклом не требуется. Вместо этого приступайте непосредственно к выращиванию клеток на стеклянной поверхности с использованием соответствующей среды для культивирования клеток.
   3. Нанесите каплю суспензии ячейки объемом 200 мкл на стеклозащитный лист. Дайте ячейкам посеять семена при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут; Затем удалите каплю.
   4. Зафиксируйте клетки свежеотфильтрованным 3% параформальдегидом (раствор PFA, табл. 1) на 10 мин при RT.
   5. Промойте стекло с помощью TPBS (Таблица 1) в течение 3 x 5 минут при температуре RT.
   6. Удалите TPBS и добавьте раствор для пермеабилизации (Таблица 1) в течение 10 минут при RT.
   7. Сбросить раствор для проникновения и инкубировать образец в растворе для хранения (Таблица 1) от 1 ч до ночи (ON) при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол может быть безопасно остановлен, а стекла могут быть сохранены в растворе для хранения в 24-многолуночной пластине в течение 3-4 недель.
3. Иммунофлюоресценция
   1. (Дополнительный) Снимите покровное стекло с пластины 24-multiwell и быстро заморозьте на сухом льду в течение 30 с, разморозьте при RT, а затем промойте стекло покровным стеклом в предварительно заполненной лунке с раствором для хранения.
   2. (Дополнительный) Повторите 3 шага 1.3.1.
   3. Постирайте в растворе для пермеабилизации в течение 5 минут при температуре RT. Затем постирайте в течение 2 х 5 минут с TPBS в RT.
   4. Инкубировать в 0,1 Н HCl в течение 12 мин при РТ.
   5. Выполните две быстрые промывки в 1x PBS.
      Указанные условия пемеабилизации клеток, включая этапы замораживания и размораживания и обработку HCl, являются оптимальными для окрашивания ядерных компонентов в клетках, характеризующихся плотно упакованным хроматином. Однако при работе с клетками, характеризующимися менее уплотненным хроматином, рекомендуется уменьшить или избегать этих этапов. Кроме того, для нацеливания на цитоплазматические компоненты рассмотрите возможность снижения или отмены лечения HCl.
   6. Инкубируйте клетки с первичным антителом (BRD4, 1:500 или SUZ12, 1:100), разведенным в буфере для разведения антител (табл. 1) (200 мкл для каждого стеклянного покровного стекла) при 4 °C.
      Иммунофлуоресценция может быть выполнена путем мультиплексирования более чем одного первичного антитела в зависимости от экспериментальных потребностей, вторичных антител и систем обнаружения.
   7. Вымыть 3 x 5 мин с помощью PBS-T (Таблица 1) в RT с легким встряхиванием.
   8. Инкубируйте клетки с вторичными антителами, разведенными в буфере для разведения антител (200 мкл на каждое стеклостекло) в течение 1 ч в режиме ЛТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите вторичное антитело, которое наилучшим образом соответствует экспериментальным потребностям и имеющимся системам обнаружения. Убедитесь, что каждое вторичное антитело нацелено на вид, из которого получено первичное антитело. Кроме того, выбирайте флуорофоры, совместимые с фильтрами микроскопа и источником света. Крайне важно избегать спектрального перекрытия между выбранным флуорофором и спектром излучения ядерного пятна.
   9. Устирайте 3 x 5 минут с PBS-T при RT с легким встряхиванием.
   10. Окрашивание 1 нг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), разведенного в 1x PBS в течение 5 минут в режиме RT.
       Примечание: Альтернативные красители могут быть использованы для ядерного окрашивания при условии, что они не перекрываются со спектром излучения вторичных антител.
   11. Выполните несколько быстрых стирок в 1x PBS.
   12. Закрепите стеклянное покровное стекло на предметном стекле для микроскопии с помощью монтажного материала, препятствующего выцветанию.

2. Получение изображения

ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность получения изображения зависит от прибора и выбранных настроек.

1. Получение данных с помощью конфокального микроскопа
   1. Захватывайте 3D-изображения с помощью конфокального микроскопа, устанавливая шаг 0,25 мкм по z и размер пикселя 0,1-0,2 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимального разрешения, ограниченного световой дифракцией, с помощью объектива 63x 1.4 NA Oil, мы установили размер отверстия на 0.8 а.е., среднее значение по линии в 2 раза, и размер кадра от 1024 × 1024 пикселей. Возбуждающий лазер, а также последовательность захвата канала были выбраны намеренно, чтобы предотвратить помехи или перекрестные помехи между используемыми флуорофорами. Тем не менее, регулировка параметров должна быть адаптирована к конкретным характеристикам микроскопа и образца. Технические характеристики конфокального микроскопа, используемого в данном протоколе, см. в Таблице материалов .
   2. Соберите постоянное количество случайных полей, чтобы охватить примерно 50 клеток на биологическую репликацию.

3. Анализ изображений

1. Установка программного обеспечения
   1. Загрузите и установите последнюю доступную версию Fiji с официальной страницы загрузки Fiji (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
   2. Установите 3D Suite с сайта обновлений Fiji или вручную, следуя инструкциям на веб-сайте 3D Suite (https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download).
   3. Установите GDSC (FindFoci) либо через сайт обновлений Fiji, либо вручную, следуя инструкциям в репозитории GitHub (https://github.com/aherbert/gdsc).
2. Конвертация TIFF
   1. Скачайте скрипт "convert_to_TIFF.py" (Дополнительный файл 1).
   2. Перетащите скрипт на Фиджи и запустите код.
   3. На появившейся панели перейдите к пути, по которому хранится эксперимент. Подпапка, содержащая преобразованные файлы TIFF, создается в той же папке эксперимента.
3. Инициализируйте настройки в 3D Manager.
   1. Откройте панель настроек 3D Manager , нажав на Plugins | 3DSuite | 3D Manager Options.
   2. В окне параметров 3D Manager установите флажки, соответствующие следующим измерениям: Объем (единица измерения), Среднее значение серого, Ограничивающая рамка (пиксели), Стандартное значение серого значения, Центроид (пиксели) и Центроид (единицы измерения).
   3. Отметьте галочками следующие опции: Исключить объекты на ребрах XY и Исключить объекты на ребрах Z и нажмите OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходимо выполнить только один раз для первоначальной настройки метрик, которые будут храниться в файлах пространственной и количественной информации. Выбранные метрики необходимы для обеспечения правильной работы воронки продаж. На этом шаге можно включить необязательные дополнительные метрики, как описано в разделе Обсуждение.
4. Установите параметры в графическом интерфейсе FindFoci.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг нужно сделать всего один раз, чтобы настроить полуавтоматический конвейер с оптимальными параметрами, которые затем будут включены в скрипты.
   1. Откройте тестовое изображение. Продублируйте белковый канал, включая стек (Ctrl + Shift + D), установите флажок гиперстек и укажите соответствующий номер канала в поле Каналы (c) и переименуйте его соответствующим образом.
   2. Запустите рекордер макросов Fiji, перейдя в раздел Плагины | Макросы | Рекорд.
   3. Откройте плагин FindFoci (нажмите на Плагины | ГДСК | FindFoci | FindFoci GUI) и выберите изображение для анализа из выпадающего меню "Изображение".
   4. Установите параметры следующим образом (рисунок 2A): размытие по Гауссу = 1.5; фоновый метод = SD выше среднего; параметр фона = 9; метод поиска = дробь пика - фон; параметр поиска = 0.7; метод пика = относительный над фоном; пиковый параметр = 0,2; минимальный размер = 5; Максимальное количество пиков = 1 000 000.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные параметры были выбраны на основе наших тематических исследований и могут не подходить для других процедур окрашивания.
   5. Чтобы улучшить идентификацию очагов, настройте следующие параметры:
      1. Размытие по Гауссу определяет степень сглаживания до лучших фокусов сегмента. Держите его близко к диаметру фокусов (пикселю).
      2. Параметр фона задает порог для отличия фона от сигнала фокуса. Увеличьте значения, чтобы установить более строгие пороговые значения.
      3. Параметр поиска определяет процент флуоресценции от пика, который включается в распознавание сигнала. Уменьшите значения, чтобы включить области, удаленные от пика флуоресценции.
      4. Параметр пика определяет степень, в которой два пика сигнала считаются непрерывными или разделенными. Уменьшение значения приведет к разделению пиков.
      5. Максимальное количество пиков указывает максимальное количество идентифицируемых фокусов. Установите большие числа, чтобы включить все фокусы на изображении.
   6. Запустите FindFoci и скопируйте строку, которая появится в окне регистратора (шаг 3.4.2, рисунок 2B), содержащую выбранные параметры, за исключением кавычек. Для получения дополнительной информации, связанной с настройками, обратитесь к инструкции ²² к руководству по плагину.
5. Конвейер количественного определения ядерных белков
   1. Скачайте скрипт "nuclear_prot_q.py" (Дополнительный файл 2).
   2. Перетащите скрипт на Фиджи и нажмите кнопку «Выполнить», чтобы выполнить код.
   3. Следуйте инструкциям в отображаемом диалоговом окне для обработки изображений.
      1. Канал ядра: введите число, соответствующее каналу DAPI (или любому ядерному окрашиванию).
      2. Nucleus Gaussian Blur: введите значение сигма, необходимое для размытия изображения для сегментации.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте этот параметр ближе к диаметру ядра (т.е. 5-6 мкм). Более высокие значения сигма указаны для неоднородного окрашивания.
      3. Белковый канал: введите число, соответствующее каналу интересующего окрашивания.
      4. Параметр FindFoci: вставьте строку, полученную на этапе записи макроса в отрывок 3.4.6 (рисунок 2B).
      5. (Дополнительный) Контроль качества: проверка качества сегментированных ядер. Это приостановит работу скрипта и позволит вручную проверять каждую сгенерированную ядерную область интереса (ROI).
      6. Выберите каталог изображений: нажмите кнопку «Обзор », чтобы перейти к папке, содержащей файлы TIFF для анализа.
   4. После того как все поля будут скомпилированы, нажмите OK , чтобы продолжить выполнение.
   5. Если ядро неправильно сегментировано и не соответствует требованиям к качеству, удалите или измените его, как показано на рисунке 2C.
      1. Проверьте список ROI в окне ROIManager3D; Если список пуст, выберите окно объединения и нажмите Quantify 3D, чтобы обновить менеджер. Затем закройте таблицу результатов Quantify 3D. Выберите канал ядер и нажмите кнопку Live-ROI в положение ON.
      2. Выберите ROI, принадлежащий тому же ядру, и нажмите « Объединить » или нажмите «Delete » в случае нежелательных ядер.
      3. Нажмите «Выбрать все » и продолжите анализ, нажав OK в окне Проверка маски .
      4. Для получения результатов найдите папку Quantification в пределах пути к файлу, указанному в шаге 3.5.3.6, содержащую txt-файл с записями параметра, используемого для анализа.
6. Pipeline в Google Colab
   1. Скачать блокнот "final_nuclear_protein_metrics.ipynb" (Дополнительный файл 3).
   2. Откройте блокнот в Google Colab (https://colab.research.google.com/).
   3. Загрузите все папки, содержащие .csv файлы каждого поля изображения, в нужную папку на Google Диске.
   4. Укажите в записной книжке путь к папке, в которой хранятся подпапки с результатами и запустите все ячейки. Когда компиляция кода завершена, окончательный файл таблицы, содержащий все скомпилированные данные, создается в той же папке, куда были загружены .csv файлы.

Результаты

Протокол, изложенный в этом методе, облегчает визуализацию и количественную оценку изменений в окрашивании ядерных белков в первичных Т-клетках человека, и может быть адаптирован для различных типов клеток и белковых мишеней. В качестве примера мы провели и проанализировали окрашиван...

Обсуждение

В этом исследовании мы представляем метод проведения иммунофлуоресцентных экспериментов на ядерных белках в Т-лимфоцитах человека. Этот метод обеспечивает гибкость для использования с различными типами клеток за счет незначительных изменений в этапах фиксации и пермеабилизации, ка?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Safe-Lock Tubes	Eppendord	#0030121503	Protocol section 1
10 mL Serological pipettes	VWR	#612-3700	Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2149P-HR	Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	#352070	Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	#A7030	Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation Kit	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	Cat#D1306	Step 1.3.10.
Dry ice			Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	magnetic beads step 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0	-	-	Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)	Electron Microscopy Sciences	#72298-13	Step 1.2.1.
Glycerol	Sigma	#G5516	Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody	Invitrogen	A11036	Step 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Step 1.1.4.
human recombinant IL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Step 1.1.4.
human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope	Leica Microsystems	-	Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life Technologies	#11140035	Step 1.1.4.
Microscope Slides	VWR	#631-1552	Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)	BD Bioscience	#557871	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)	BD Bioscience	#552888	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Step 1.1.3.
Multiwell 24 well	Falcon	#353047	Protocol section 1
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000	Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution	Life Technologies	#15070063	Step 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Step 1.2.4.
poly-L-lysine	Sigma	#P8920	1.2.1.
Primary antibody - BRD4	Abcam	#ab128874	Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12	Cel Signalling	mAb #3737	Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate	Life Technologies	#11360039	Step 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Step 1.3.
Tweezers	-	-	Protocol section 1