Una línea versátil para analizar los cambios dinámicos en los cuerpos nucleares en una variedad de tipos de células

Resumen

Este método describe un protocolo de inmunofluorescencia y un canal de cuantificación para evaluar la distribución de proteínas con patrones de organización nuclear variados en linfocitos T humanos. Este protocolo proporciona orientación paso a paso, comenzando con la preparación de la muestra y continuando con la ejecución de análisis semiautomatizados en Fiji, concluyendo con el manejo de datos por parte de un cuaderno de Google Colab.

Resumen

Varios procesos nucleares, como el control transcripcional, ocurren dentro de estructuras discretas conocidas como focos que se pueden discernir a través de la técnica de inmunofluorescencia. La investigación de la dinámica de estos focos en diversas condiciones celulares a través de la microscopía proporciona información valiosa sobre los mecanismos moleculares que gobiernan la identidad y las funciones celulares. Sin embargo, la realización de ensayos de inmunofluorescencia en diferentes tipos de células y la evaluación de las alteraciones en el ensamblaje, la difusión y la distribución de estos focos presentan numerosos desafíos. Estos desafíos abarcan complejidades en la preparación de muestras, la determinación de parámetros para analizar datos de imágenes y la gestión de volúmenes de datos sustanciales. Además, los flujos de trabajo de imágenes existentes a menudo se adaptan a usuarios competentes, lo que limita la accesibilidad a un público más amplio.

En este estudio, presentamos un protocolo de inmunofluorescencia optimizado diseñado para investigar proteínas nucleares en diferentes tipos de células T primarias humanas que se pueden personalizar para cualquier proteína de interés y tipo de célula. Además, presentamos un método para cuantificar de forma no sesgada la tinción de proteínas, ya sea que formen focos distintos o exhiban una distribución nuclear difusa.

Nuestro método propuesto ofrece una guía completa, desde la tinción celular hasta el análisis, aprovechando una tubería semiautomatizada desarrollada en Jython y ejecutable en Fiji. Además, proporcionamos un script de Python fácil de usar para agilizar la gestión de datos, de acceso público en un cuaderno de Google Colab. Nuestro enfoque ha demostrado eficacia en la producción de análisis de inmunofluorescencia altamente informativos para proteínas con diversos patrones de organización nuclear en diferentes contextos.

Introducción

La organización del genoma eucariota está gobernada por múltiples capas de modificaciones epigenéticas¹, que coordinan varias funciones nucleares que pueden ocurrir dentro de compartimentos especializados llamados cuerpos nucleares o condensados². Dentro de estas estructuras, tienen lugar procesos como la iniciación de la transcripción³, el procesamiento del ARN ^4,5,6, la reparación del ADN ^7,8, la biogénesis del ribosoma

Protocolo

El uso de muestras humanas con fines de investigación fue aprobado por los Comités de Ética de la Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milán), y se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos (número de autorización: 708_2020). El protocolo se organiza en tres secciones principales: ejecución de inmunofluorescencia, adquisición de imágenes y análisis de imágenes. En promedio, requiere 4 días hábiles para completarse (Figura 1).

1. Preparación de inmunofluorescencia

NOTA: Este protoco....

Discusión

En este estudio, presentamos un método para realizar experimentos de inmunofluorescencia sobre proteínas nucleares en linfocitos T humanos. Este método ofrece flexibilidad para su uso con varios tipos de células a través de modificaciones menores en los pasos de fijación y permeabilización, como se describió anteriormente^30,31.

Nuestro flujo de trabajo de imágenes se basa en técnicas establecidas descritas en la literatura, e.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Safe-Lock Tubes	Eppendord	#0030121503	Protocol section 1
10 mL Serological pipettes	VWR	#612-3700	Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2149P-HR	Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	#352070	Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocol section 1
antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	#A7030	Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation Kit	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	Cat#D1306	Step 1.3.10.
Dry ice			Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	magnetic beads step 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0	-	-	Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)	Electron Microscopy Sciences	#72298-13	Step 1.2.1.
Glycerol	Sigma	#G5516	Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody	Invitrogen	A11036	Step 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Step 1.1.4.
human recombinant IL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Step 1.1.4.
human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope	Leica Microsystems	-	Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Life Technologies	#11140035	Step 1.1.4.
Microscope Slides	VWR	#631-1552	Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)	BD Bioscience	#557871	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)	BD Bioscience	#552888	Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Step 1.1.3.
Multiwell 24 well	Falcon	#353047	Protocol section 1
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000	Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution	Life Technologies	#15070063	Step 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Step 1.2.4.
poly-L-lysine	Sigma	#P8920	1.2.1.
Primary antibody - BRD4	Abcam	#ab128874	Step 1.3.6.
Primary antibody - SUZ12	Cel Signalling	mAb #3737	Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate	Life Technologies	#11360039	Step 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Step 1.3.
Tweezers	-	-	Protocol section 1